一株深海细菌新菌株及其应用

本发明涉及一种海洋微生物新菌株及其应用,具体涉及一株深海热液羽流分离的 微生物新属种及其应用。

大洋中脊热泉喷出的热液进入海洋水体后，在热浮力作用下迅速上升，并与周围 海水混合，热液组分浓度迅速稀释至原有的10-4-10-5倍。混合后的流体在达到浮力平 衡前可上升数百米，同时发生侧向扩散，其扩散范围在空间尺度上可达数千公里，从 而形成热液羽流（hydrothermal plume）。热液羽流在与周围水体交换过程中形成各种 参数的梯度，其物理和化学特性与周围海水区别鲜明，Fe、Mn离子、甲烷、氢、硫化 氢等含量异常，与海洋其他生境（包括热液口及其沉积物）相比，热液羽流微生物的 研究工作相对较少。事实上分离自该环境的微生物往往具有一些特殊的生理生化特性， 并可能合成一些独特的代谢产物提高菌株的环境适应性，因此从该特殊环境中分离获 得新的微生物资源一直是海洋微生物研究的热点之一。

1999年，Yurkov等从太平洋热液羽流采用酵母蛋白胨醋酸培养基 （yeast-peptone-acetate medium）分离出需氧细菌Citromicrobium bathyomarinum, 该菌能合成光合素；2005年，Beatty等通过在培养基中添加0.1%硫代硫酸钠从深 海热液羽流分离光合绿硫细菌,可以作为初级生产者参与能量循环。2008，Rathgeber 等采用酵母蛋白胨醋酸培养基添加1.5%(w/v)aCl从太平洋热液羽流分离出需氧光 合细菌Erythrobacter。2010年，Dick等通过添加铁锰元素从Guaymas Basin深海热 液羽流分离出八株Mn(Ⅱ)氧化细菌。在热液羽流中还存在大量的自养硫氧化还原细 菌，它们通过氧化还原性硫获得电子能量，作为生产者提供热液区的生存能量。

可见深海热液区水体中存在着大量的浮游微生物，它们具有重要的生态学意义， 这些微生物有望成为解决当前人们所关注的医药、环保、能源等问题的重要资源。

本发明的一个目的是提供一种新的微生物菌种资源。

本发明所提供的微生物菌种资源是锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans），其 菌株号为8047，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号 为CGMCC o.6697。

本发明的另一个目的是提供用锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697制备四氢嘧啶的方法。

本发明所提供的制备四氢嘧啶的方法，包括如下步骤：从经aCl诱导的锰氧化 黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697中提取四氢嘧啶。

其中，所述aCl诱导是在含有aCl的培养基中培养锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697。

所述含有aCl的培养基中aCl的含量大于0g/L，具体可为60g/L-90g/L。

在本发明的一个实施例中，采用含有6%（质量百分含量）aCl的液体培养基对 锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697进行aCl诱导。在本 发明的另一个实施例中，采用含有9%（质量百分含量）aCl的液体培养基对锰氧化黄 氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697进行aCl诱导。

所述含有aCl的培养基具体可为如下培养基：每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提 取物、60-90gaCl和余量的水制成。

上述方法中，培养锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697 具体可为在所述含有aCl的培养基中培养锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans） 8047 CGMCC o.6697 6-12小时，如8-10小时。

本发明的另一个目的是提供一种产四氢嘧啶菌剂。

本发明所提供的产四氢嘧啶菌剂含有锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans） 8047 CGMCC o.6697。

本发明的锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697能在aCl 诱导条件下合成四氢嘧啶，随着aCl浓度的增加其四氢嘧啶合成水平也相应提高。

生物材料信息：

分类命名：锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）

菌株编号：8047

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2012年10月22日

保藏中心登记入册编号：CGMCC o.6697

下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。

图1为锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697在不同盐 浓度条件下四氢嘧啶合成水平的比较：A，四氢嘧啶标品；B，60g/L aCl条件下四氢 嘧啶的合成水平；C，90g/L aCl条件下四氢嘧啶的合成水平。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的分离 及鉴定

1、锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的分离

锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697分离自西南印度 洋2800米处热液羽流海水样品的海洋细菌。。它的分离方法如下：热液羽流海水样品 原位浓缩1000倍后取100ul涂布于YTSS培养基（每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提 取物、20gaCl、150g琼脂和余量的水制成，pH为7.8）平板上于28℃培养，从中挑 取一株橙黄菌落的菌株，经反复纯化获得锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans） 8047 CGMCC o.6697。

2、锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的鉴定

1）形态特征：锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697在 YTSS培养基（每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、20gaCl、150g琼脂和余量的水 制成，pH为7.8）中28℃培养28小时，菌体为杆状，大小约1.8-2.0*0.9-1.2um， 侧生单鞭毛，可运动。菌落呈黄，圆形隆起，不透明，边缘整齐。

2）生理生化特征：

按照下述文献中的方法测定了锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的下述生理生化特征：《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠、蔡妙英等编著， 科学出版社，2001）中P353-386。

锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697为革兰氏阴性菌， 氧化酶阳性，触酶阳性，脲酶阳性，明胶液化实验阳性，H2S实验阳性，硝酸还原实验 强阳性，脂酶阴性，淀粉利用阴性，纤维素利用阴性，甲基红（M.R）实验阴性，VP 实验阴性，对庆大霉素(10ug/片)敏感，新霉素(30ug/片)敏感。其对不同碳源利用 的情况如表1所示。

表1.锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的碳源利用 结果

注：“+”表示能利用该碳源，“-”表示不能利用该碳源。

3）细胞组分：

按照下述文献中的方法测定了锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的下述细胞组分：《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠、蔡妙英等编著，科学 出版社，2001）中P391-398。

锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697细胞中主要的极 性脂组分为磷脂DPG,PG,PME,PE,PC，未知磷脂PL及未知糖脂GL；其呼吸醌为甲基萘 醌MK-6；其最主要的脂肪酸为C 18:1 w7c，占72.9%。

4）16S rRA基因

锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的16S rRA基因 序列如SEQ ID o.1所示，相似性比对结果显示，与该菌株16S rRA基因序列最相似 的是橙单胞菌科的阔海褐黄海水菌Fulvimarina pelagi，但相似性仅有93%。

5）G＋Cmol%值

按照下述文献中的方法测定了锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的G＋Cmol%值：《常见细菌系统鉴定手册》（东秀珠、蔡妙英等编著，科学出 版社，2001）中P399-400。

锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的G+C mol%含量 为61.7%。

根据形态特征、生理生化特征、化学分类指标以及16S rRA基因序列分析，将锰 氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697定名为橙单胞菌科的新 属种锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）。

实施例2、利用锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697 制备四氢嘧啶

四氢嘧啶的分子式为C6H102O2，结构式如下：

四氢嘧啶能够为处于极端（包括高温、冷冻、射线、干燥以及高盐等）环境下的 细胞提供保护作用，并对一些神经性疾病有一定的疗效，在精细化工、生物医药以及 生物制药方面具有广泛的应用前景。

1.aCl诱导锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697产四 氢嘧啶的发酵方法

本实验采用以下两种含有aCl的培养基分别培养锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697：含有60g/L aCl培养基和含有90g/L aCl 培养基。其中，含有60g/L aCl培养基每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、60g aCl 和余量的水制成。含有90g/L aCl培养基每升由10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、90g aCl和余量的水制成。具体的培养方法如下：取斜面培养的锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697，分别接入上述含有60g/L aCl培养基和含有 90g/L aCl培养基，在28℃培养8小时，6000rpm离心10min，收集沉淀得到菌体。

2.菌体四氢嘧啶提取方法

（1）取0.1g（湿重）菌体加入1ml甲醇/氯仿/水（体积比为10：5：4），剧烈震 荡30min；

（2）离心13000rpm,10min促进分相；

（3）取上清液（800ul）再加入等体积的氯仿/水（体积分别为400ul和400ul）， 剧烈震荡30min；

（4）离心13000rpm，再次离心分相，取500ul上清水相；

（5）冻干；

（6）溶于500ul 70%乙腈中，得到菌体细胞抽提液。

3.菌体四氢嘧啶的检测及结果

（1）用有机滤器过滤步骤2得到的细胞抽提液，取150ul上样。细胞抽提液用 反向氨基柱（H2 Analytical HPLC Column 4.6×250mm，购自安捷伦公司）进行HPLC 分离。流动相为70%乙腈，流速为1ml/min。检测波长为210nm。

上述各实验均设三次重复。结果表明采用含有60g/L aCl培养基和含有90g/L aCl培养基培养的锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的 菌体细胞抽提液中均含有四氢嘧啶，采用含有60g/L aCl培养基培养的锰氧化黄氏菌 （Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的菌体的四氢嘧啶产量为 0.005mg/109CFU，采用含有90g/L aCl培养基培养的锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的菌体的四氢嘧啶产量为0.018mg/109CFU。说 明随着aCl浓度的提高，锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697 合成四氢嘧啶水平也相应提高。本实验还设置了含有60g/L aCl培养基和含有90g/L aCl培养基的空白对照，结果表明这两种培养基中均不含有四氢嘧啶。图1中A为作 为标准品的四氢嘧啶（Sigma公司产品编号：E2271）的HPLC图谱，在上述谱条件 下其保留时间为13.1分钟；图1中B为采用含有60g/L aCl培养基培养的锰氧化黄 氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697的菌体细胞抽提液的的HPLC图 谱，该图谱中含有保留时间为13.1分钟的四氢嘧啶的层析峰；图1中C为采用含有 90g/L aCl培养基培养的锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697 的菌体细胞抽提液的HPLC图谱，该图谱中含有保留时间为13.1分钟的四氢嘧啶的层 析峰。

另外，实验证明锰氧化黄氏菌（Huangia manganoxydans）8047 CGMCC o.6697 在不含aCl的培养基中能生长，但是不能产生四氢嘧啶。