一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体、沉默体系及其构建方法和应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体、沉默体系及其构建方法和应用。

中国石蒜(Lycoris chinensis Traub)是石蒜属重要的观赏植物，具有花艳丽、花型优美，花茎挺拔高大等观赏特性，而且对环境要求不高，适应性强，是园林绿化的很好选择。分子育种是今后花卉育种研究的趋势及常用手段，可以为提高观赏性状、改良花期、培育新种质创造优良的条件，但是目前石蒜属植物遗传转化体系尚未成熟，难以对基因功能展开研究。

病毒介导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是一种基于转录后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)的技术，利用植物采用的天然防御机制来防止入侵病毒。被病毒感染的植物会诱导双链RA介导的PTGS，从而降解病毒RA。携带宿主靶基因部分序列的重组病毒被用来感染并在整个植物中传播。病毒基因转录物与植物靶基因一起被内源性PTGS识别和降解，导致靶基因表达减少。与其他转基因技术相比，VIGS技术可以避免植物转化，有周期较短、所需成本低以及操作简单等优势。目前已应用于多种植物进行基因功能验证，但该体系目前在中国石蒜未建立和应用。

本发明的目的在于提供一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体、沉默体系及其构建方法和应用，验证中国石蒜基因功能。

本发明提供了一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体，所述沉默载体包括中国石蒜LcCLA基因的特异性片段，所述特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。

本发明提供了所述中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体的构建方法，包括以下步骤：

将所述特异性片段连接到pTRV2上，构建得到沉默载体pTRV2-LcCLA。

优选的，所述特异性片段通过PCR扩增得到；所述PCR扩增所用的引物对包括上游引物CLA1-XbaI-F和下游引物CLA1-KpnI-R；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID O.4所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ ID O.5所示。

本发明还提供了一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默体系，所述沉默体系包括：含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的混合液；所述含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的体积比为1:1。

本发明还提供了所述沉默载体或所述沉默体系在鉴定中国石蒜LcCLA基因功能中的应用。

本发明还提供了一种鉴定中国石蒜LcCLA基因功能的方法，包括如下步骤：

利用所述沉默体系侵染中国石蒜的叶片后继续培养，观察叶片表型变化。

优选的，所述侵染的方式包括：采用针头注射的方式将所述沉默体系注入叶片尖端叶脉导管。

优选的，利用所述沉默体系侵染中国石蒜的叶片前，还包括对所述沉默体系进行暗培养，利用暗培养后的沉默体系侵染中国石蒜的叶片；所述暗培养的温度为24～26℃，时间为3～5h。

优选的，所述侵染后，培养中国石蒜的方式包括17～19℃的黑培养2d后正常培养。

优选的，其特征在于，所述农杆菌包括农杆菌GV3101。

本发明提供了一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体，所述沉默载体包括中国石蒜LcCLA基因的特异性片段，所述特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。本发明通过中国石蒜鳞茎转录组测序获得如SEQ ID O.1所示的LcCLA基因的特异性片段，首次构建中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体，能够有效降低中国石蒜中LcCLA基因的表达水平。

本发明将含有LcCLA基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体质粒转化到农杆菌体内，将含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液混合，得到沉默体系(即农杆菌菌液混合液)，采用针头注射的方式利用沉默体系侵染中国石蒜叶片，诱导中国石蒜内源LcCLA发生沉默，有效降低了中国石蒜LcCLA基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默性状，能够验证中国石蒜LcCLA基因功能，在中国石蒜的功能基因研究中具有应用价值。

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1叶片尖端针头注射法和对比例1叶片渗透法；

图2为实施例1中沉默载体侵染中国石蒜叶片后出现的叶片白化表型性状；

图3为中国石蒜LcCLA基因沉默后的cDA片段检测图；

图4为采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测中国石蒜LcCLA的表达情况。

本发明提供了一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体，所述沉默载体包括中国石蒜LcCLA基因的特异性片段，所述特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID O.1所示，具体为：5’-TTGACGGGCAGGAGGGACAAAATGCCCACAATGAGACAAACAAACGGATTAGCTGGGTTTACCAAACGCTCCGAGAGCGAGCATGATTGCTTCGGTACTGGCCACAGCTCAACCAGCATCTCAGCAGCACTAGGAATGGCAGTTGGAAGAGACTTGAAGGGAGGAAAGAACAATGTGATTGCAGTGATAGGAGATGGAGCCATGACAGCAGGCCAAGCTTATGAAGCAATGAATAATGCAGGGTATTTGGATTCTGATATGATTGTAATATTAAATGATAATAAGCAGGTTTCTCTGCCGACTGCAAATCTTGATGGGCCTATACCACCTGTTGGAGCTTTAAGCAGTGCTCTTAGTAAATTGCAGTCTAGCAGGCCTCTTAGAGAACTCAGGGAGGTGGCAAAGGGAGTAACAAAACAGCTTGGTGGGGGGATGCACGAATTAGCAGCAAAAGTTGATGAATATGCTCGAGGAATGATCAGTGGATCGGGTTCCACCTTGTTCGAGGAGCTTGGCCTTTACTACATAGGTCCAGTTGATGGCCACAACATTGACGACCTTGTCACAATTCTCAAAGAAGTGAAGAGCACAAAAACAACTGGTCCAGTTCTAATCCATGTCATAACAGAGAAAGGAAGAGGATATCCCTATGCAGAAAGAGCTGCTGATAAGTACCATGGTGTGGTGAAGTTTGACCCAGCAACGGGAAAACAGTTCAAAACCAGTTCTCAGACTCAGTCCTATACCAATTATTTTGCTGAGGCTTTGATAGCCGAAGCTGAAGTAGACAAGGACATTGTTGCAATTCATGCTGCAATGGGGGGAGGAACTGGCCTAAACTGCTTCCTCCGC-3’。

本发明通过对中国石蒜鳞茎转录组进行测序，获得了LcCLA基因特异性片段(即CDS序列)，其具体核苷酸序列如SEQ ID O.1所示。以LcCLA基因特异性片段为目的片段构建LcCLA基因VIGS沉默载体，能够验证中国石蒜LcCLA基因的功能。

本发明还提供了所述中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

将所述特异性片段连接到pTRV2上，构建得到沉默载体pTRV2-LcCLA。

在本发明中，所述特异性片段优选通过PCR扩增得到，且所述PCR扩增所用的引物对优选包括上游引物CLA1-XbaI-F和下游引物CLA1-KpnI-R。本发明所述上游引物CLA1-XbaI-F的核苷酸序列优选如SEQ ID O.4所示(5’-CTAGTCTAGATTGACGGGCAGGAGGGAC-3’)，下游引物的核苷酸序列优选如SEQ ID O.5所示(5’-CGGGGTACCGCGGAGGAAGCAGTTTAGGC-3’)。本发明对所述PCR扩增时使用的模板来源不作具体限定，可采用合成的方式获得所述特异性片段，也可以中国石蒜的RA经反转录后得到的cDA为模板。本发明实施例中优选以cDA为模板，但是不能仅将其认定为本发明的全部保护范围。

本发明对所述连接的方式没有严格要求，采用常规的基因重组技术，例如在所述引物对的上游引物CLA1-XbaI-F的5’末端添加XbaI酶切位点，在所述引物对的下游引物CLA1-KpnI-R的5’末端添加KpnI酶切位点，通过酶切酶连的方式将PCR扩增得到的特异性片段插入到pTRV2即可。本发明对载体pTRV2的来源没有严格要求，常规购买即可。本发明具体实施过程中使用的载体pTRV2购买自https://www.addgene.org/148969/。

本发明还提供了一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默体系，包括：含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的混合液；所述含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的体积比为1:1。

本发明将含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液混合，得到的侵染液即为所述沉默体系，本发明通过限定含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的体积比为1:1，能够提高侵染效果。

在本发明中，对所述含有pTRV1的农杆菌菌液和含有pTRV2-LcCLA的农杆菌菌液的制备方法不做严格要求，利用常规方式，如电转法或热激法等方式将pTRV1和pTRV2-LcCLA分别转入农杆菌，培养获得即可。本发明所述农杆菌优选为农杆菌GV3101。

本发明还提供了所述沉默载体或沉默体系在鉴定中国石蒜LcCLA基因功能中的应用。本发明所述沉默载体或沉默体系能够有效降低中国石蒜中LcCLA基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默植株，验证中国石蒜LcCLA基因功能。

本发明还提供了一种鉴定中国石蒜LcCLA基因功能的方法，包括如下步骤：

利用所述沉默体系侵染中国石蒜的叶片后继续培养，观察叶片表型变化。

本发明利用所述沉默体系侵染中国石蒜的叶片前，优选对所述沉默体系进行暗培养，利用暗培养后的沉默体系侵染中国石蒜的叶片。本发明所述暗培养的温度为优选为25℃；所述暗培养的时间优选为3～5h，进一步优选为4h。本发明对所述暗培养的方式不作具体限定，采用常规培养方式即可，如在100rpm的摇床上进行培养。本发明对所述沉默体系进行暗培养能够诱导农杆菌的侵染能力，提高所述沉默体系的侵染效率。

暗培养结束后，本发明利用暗培养后的沉默体系侵染中国石蒜的叶片。本发明所述侵染的方式优选为针头注射，具体为采用针头注射的方式将所述暗培养后的侵染液注入叶片尖端叶脉导管，用手指紧捏针头部位，将菌液慢慢推入，直至浸润整个叶片。本发明所述暗培养后的沉默体系的注射量优选为1～2mL；所述暗培养后的沉默体系的侵染时间优选为15～20s，进一步优选为16～18s。本发明针对石蒜属植物特殊的叶片结构，采用针头直接注射方法，直接沿平行叶脉将菌液完整浸润整片叶子，有效避免了叶面渗透法难以穿透叶表面蜡质的难题，在较短的时间内，利用少量的沉默体系即可实现侵染，并用于后续中国石蒜LcCLA基因功能验证。

侵染结束后，本发明对侵染后的中国石蒜的叶片进行培养。本发明所述培养优选包括首先于17～19℃，进一步优选18℃暗培养2d后正常培养。本发明所述正常培养具体为：光暗交替培养，具体的，光培养16h后暗培养8h；所述光培养的光照强度为4000lx，光培养的温度为24～26℃；所述暗培养的温度为21～23℃。本发明所述正常培养时，保持空气相对湿度70％-80％。

正常培养8～13d(即侵染10～15d)后，本发明观察叶片表型变化和/或取样测定叶片中LcCLA基因的表达情况，实现中国石蒜LcCLA基因功能的鉴定，具体鉴定方法为：当叶片失绿，变白或浅黄时，表明中国石蒜LcCLA基因发挥功能。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

以下实施例中所采用的分子生物学实验技术包括RA提取和反转录、PCR扩增等实验，如无特殊说明，通常按照常规方法操作。

实施例1

(1)LcCLA基因特异性片段的克隆

根据中国石蒜转录组进行序列拼接、注释及比对分析后发现LcCLA具有完整ORF(全长1980bp)。用RA提取试剂盒(购于北京华越洋生物科技有限公司，货号0416-50gk)提取中国石蒜叶片总RA，用oligo(dT)18(购于Thermo Fisher，货号SO131)反转录后，根据中国石蒜转录组设计全长引物CLA1-F(记为SEQ ID O.2)：5’-TTGACGGGCAGGAGGGAC-3’和CLA1-R(记为SEQ ID O.3)：5’-GCGGAGGAAGCAGTTTAGGC-3’，PCR扩增获得LcCLA特异条带，进行琼脂糖凝胶电泳、切胶纯化、克隆测序，从而获得最终序列。

(2)载体构建

根据步骤(1)最终序列设计用于扩增LcCLA基因CDS结构域上的特异性片段的引物CLA1-XbaI-F和CLA1-KpnI-R，在上游引物的5’末端添加XbaI酶切位点，下游引物的5’末端添加KpnI酶切位点，PCR扩增LcCLA基因特异性片段。

用RA提取试剂盒(购于北京华越洋生物科技有限公司，货号0416-50gk)提取中国石蒜叶片总RA，用oligo(dT)18(购于Thermo Fisher,货号SO131)进行反转录，获得cDA模板。

PCR反应体系(20μL)为：cDA模板1μL、上下游引物(10μM)各1μL、dTPs(10mM)0.4μL、5×Phusion HF缓冲液4μL、Phusion DA聚合酶0.2μL，补加双蒸水至20μL。扩增条件为：98℃预变性30s；98℃变性5s，60℃退火20s，72℃延伸10s，35个循环；72℃终延伸7mim，得到LcCLA共852bp的特异性序列(SEQ ID O.1)，4℃保存。

PCR切胶纯化后加A尾，连接T载体(购于TaKaRa，货号D101A)后转化大肠杆菌，挑取阳性克隆摇菌并至通用生物公司测序。选取测序结果与已知序列一致的克隆，摇菌并提取质粒，命名为pMD19-LcCLA。然后用XbaI/KpnI双酶切pMD19-LcCLA和pTRV2载体质粒，并分别回收酶切产物，连接、转化和筛选阳性克隆；从而获得VIGS重组载体pTRV2-LcCLA。

(3)侵染液制备及侵染方法

①侵染Buffer的配置：100mL渗透液含1mL MgCl2溶液(1mol/L)，1mL MES溶液(1mol/L)，200μL乙酰丁香酮溶液(1mol/L)，调节pH至5.6，用灭菌蒸馏水定容，需要现配现用。

②菌液准备：将获得的重组载体pTRV2-LcCLA质粒、pTRV2空载体质粒和pTRV1(购买自https://www.addgene.org/148968/)质粒采用冻融法转化农杆菌GV3101。将转化农杆菌GV3101的pTRV1质粒、pTRV2质粒和pTRV2-LcCLA质粒分别在LB(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)琼脂板划板培养。28℃培养48h后挑取新鲜培养的含pTRV1质粒、pTRV2质粒和pTRV2-LcCLA质粒的农杆菌GV3101转化子单菌落加入到3mLYEB液体培养基(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)中，在28℃、170rpm/min摇床中培养16h。取1mL培养的菌液加入到100mLYEB液体培养基(Kan，50μg/mL；Rif，25μg/mL)中，28℃，170rpm/min，培养20-24h。检测菌液OD600为1.0左右时，取40mL，4000rpm离心10min收集菌体细胞，加入适当体积的侵染Buffer重悬至终浓度为2.0(OD600)。

③侵染液准备：将步骤②中带有pTRV1载体的农杆菌GV3101菌液分别与携带pTRV2的菌液和携带pTRV2-LcCLA质粒的菌液的重悬液按体积比1∶1混匀，制成2种混合菌液。将混合的重悬液置于25℃摇床100rpm/min，暗培养4h，用于侵染中国石蒜叶片。

④农杆菌液侵染：如图1中(a)所示，采用叶片针头注射法侵染中国石蒜叶片，步骤为：先吸取步骤③中培养好的侵染液，用注射器针头插入叶片尖端叶脉导管处，并用手指紧捏针头部位，将菌液慢慢推入，直至浸润整个叶片。(两种不同菌液注射时均需要更换手套与注射器)。

注射后培养：侵染后置于18℃的黑暗条件下培养2d，之后在空气相对湿度70％-80％的条件下，进行光暗交替培养，其中光培养的强度为4000lx，温度为25℃；暗培养的温度为22℃，光暗比为16h/8h。

对比例1

同实施例1，区别在于步骤(3)中④进行农杆菌液侵染时，采用如图1中(b)所示的叶片渗透法进行浸染。

测试例1

农杆菌液侵染效率的比较

实施例1针头注射法，浸润一整片叶子只需要1-2mL菌液即可，耗时15-20s；对比例1叶片渗透法属于传统的渗透注射法，因石蒜属植物叶片表层有蜡质，浸润时菌液难以注射到整个叶片中，想达到浸润整片叶子的效果，需要制造多个伤口，因此，浸润过程中极易造成菌液流失，且伤口多也不利于植物正常的生长发育，影响实验结果，叶片渗透法浸润一整片叶子至少需要5mL菌液，且耗时1-2min。

本发明针头注射法更容易浸润整个叶片，效率更高，操作更简便，且可以节省更多的菌液。

测试例2。

侵染后中国石蒜LcCLA沉默效率检测

(1)实施例1侵染10-15d后，观察注射后的中国石蒜叶片的表型变化，结果如图2所示，其中，图2从左到右(a-c)依次为实施例1中国石蒜侵染pTRV1+pTRV2-LcCLA后的叶片，实施例1中国石蒜侵染pTRV1+pTRV2后的叶片以及不侵染正常生长的中国石蒜叶片。根据图2可以看出，侵染pTRV1+pTRV2-LcCLA后的中国石蒜叶片失绿，叶片变白，说明本发明针头注射的方式能够使中国石蒜LcCLA基因沉默，发挥功能。

(2)中国石蒜叶片表型为白时，取其叶片，用华越洋快速通用植物RA提取试剂盒分别提取未注射、注射pTRV1+pTRV2、pTRV1+pTRV2-LcCLA叶片的总RA，每组三个重复，然后以各样品的1μg总RA为模板，利用Prime Script TM RT reagent Kit with gDAEraser(Perfect Real Time)试剂盒(Takara)去除基因组DA并反转录合成cDA第一链，于-20℃储藏备用。

利用PCR检测注射效率，具体的：所用引物为：LcCLA1-RAi-RT-F(记为SEQ IDO.6)：5’-GTTGCTCATTTCTTGGCACTCA-3’和LcCLA1-RAi-RT-R(记为SEQ ID O.7)：5’-CAGCACCAACGGTCTCCACT-3’，检测结果见图3，其中1-3为未注射叶片样品，4-6为注射pTRV1+pTRV2叶片样品，7-9为注射pTRV1+pTRV2-LcCLA叶片样品。根据图3可以看出1-3未注射叶片孔未见条带，4-9注射叶片孔在大约250bp处条带明显，说明本发明针头注射法实现了中国石蒜叶片的侵染，注射成功；

通过qRT-PCR检测基因表达量，以EXP为内参基因，引物序列为EXP1-RT-F(记为SEQID O.8)：5’-TTGATGTTGACAAGGTAAGGTGC-3’和EXP1-RT-R(记为SEQ ID O.9)：5’-AGGCAGGAAATCTCCAAAGC-3’，检测结果见图4，其中CK为对照组，为空载体pTRV2侵染的叶片，LcCLA基因相对表达量为1.00；LcCLA为实施例1重组病毒载体pTRV2-LcCLA侵染的叶片，LcCLA基因相对表达量为0.37。与对照CK相比，受到携带pTRV2-LcCLA重组病毒载体农杆菌侵染的中国石蒜叶片中LcCLA基因表达量显著降低，说明本发明沉默体系构建成功。

本发明提供的中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默体系能够诱导中国石蒜内源LcCLA发生沉默，有效降低了中国石蒜LcCLA基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默性状。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 江苏省中国科学院植物研究所

<120> 一种中国石蒜LcCLA基因VIGS沉默载体、沉默体系及其构建方法和应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 852

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgacgggca ggagggacaa aatgcccaca atgagacaaa caaacggatt agctgggttt 60

accaaacgct ccgagagcga gcatgattgc ttcggtactg gccacagctc aaccagcatc 120

tcagcagcac taggaatggc agttggaaga gacttgaagg gaggaaagaa caatgtgatt 180

gcagtgatag gagatggagc catgacagca ggccaagctt atgaagcaat gaataatgca 240

gggtatttgg attctgatat gattgtaata ttaaatgata ataagcaggt ttctctgccg 300

actgcaaatc ttgatgggcc tataccacct gttggagctt taagcagtgc tcttagtaaa 360

ttgcagtcta gcaggcctct tagagaactc agggaggtgg caaagggagt aacaaaacag 420

cttggtgggg ggatgcacga attagcagca aaagttgatg aatatgctcg aggaatgatc 480

agtggatcgg gttccacctt gttcgaggag cttggccttt actacatagg tccagttgat 540

ggccacaaca ttgacgacct tgtcacaatt ctcaaagaag tgaagagcac aaaaacaact 600

ggtccagttc taatccatgt cataacagag aaaggaagag gatatcccta tgcagaaaga 660

gctgctgata agtaccatgg tgtggtgaag tttgacccag caacgggaaa acagttcaaa 720

accagttctc agactcagtc ctataccaat tattttgctg aggctttgat agccgaagct 780

gaagtagaca aggacattgt tgcaattcat gctgcaatgg ggggaggaac tggcctaaac 840

tgcttcctcc gc 852

<210> 2

<211> 18

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgacgggca ggagggac 18

<210> 3

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcggaggaag cagtttaggc 20

<210> 4

<211> 28

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctagtctaga ttgacgggca ggagggac 28

<210> 5

<211> 29

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cggggtaccg cggaggaagc agtttaggc 29

<210> 6

<211> 22

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gttgctcatt tcttggcact ca 22

<210> 7

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cagcaccaac ggtctccact 20

<210> 8

<211> 23

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttgatgttga caaggtaagg tgc 23

<210> 9

<211> 20

<212> DA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aggcaggaaa tctccaaagc 20