硝酸还原酶基因及其作为植物抗逆调控靶标的应用
1.本发明属于植物品种改良和抗逆领域，更具体地，本发明涉及硝酸还原酶基因及其作为植物抗逆调控靶标的应用。
背景技术：
2.随着世界城市化、工业化进程不断加快，人口持续增长，水土流失、土地盐碱化的发生，全球耕地数量不断减少。粮食短缺问题是大家共同面临的挑战。利用分子遗传学的理论方法深入研究作物品种改良、增强作物对不同环境胁迫的适应性，实现作物高产稳产，是本领域的重要方面。
3.作物在生长发育过程中经常受到诸如干旱、高盐、高温等环境胁迫，对作物产量造成重大影响。如何在提高作物产量的同时提高作物对环境胁迫的抗性，实现作物高产稳产，是科学家及育种家面对的重大课题。
4.禾本科植物水稻是世界上最重要的粮食作物之一，被广为播种，为世界一半人口提供主食。然而，为了更广泛地实现水稻培育以及提高其种植效率，如何实现在不同的环境下提高其环境适应性是本领域的重中之重。
5.一些粮食生产数据显示，在保持了化肥高投入的情况下，大面积的粮食单产并未显著提高。由于植物养分利用效率呈下降趋势，导致化肥的施用量逐渐增加，使得生产成本大大增加，从而导致在农业生产中普遍出现增产不增收现象。另一方面，由于作物氮肥利用效率低下，农业生产中施用的大部分氮肥进入环境，会直接导致水系富营养化、土壤酸化、水资源与土壤重金属积累等环境污染问题。迄今为止，影响植物氮素利用效率的分子机制仍然存在很多谜团，仍有许多参与植物氮素利用效率的关键组分亟待被发现。
6.在自然界条件下，由于不同的地理位置、气候条件以及人类活动等多方面原因，造成了各种不良环境，超出了植物正常生长、发育所能忍受的范围，致使植物受到伤害，甚至死亡。这些对植物产生伤害的环境称为逆境，或胁迫。逆境包括但不限于：冻、低温、高温、干旱、盐渍、土壤过湿和病害等各种逆境。植物虽经受逆境影响，但它通过生理反应而抵抗逆境，如果超过可忍范围，超出植物自身修复能力，损伤将变成不可逆的，植物将受害甚至死亡。
7.干旱会导致叶片和嫩茎萎蔫，气孔开度减小甚至关闭等生理生态变化，给植物的正常萌发、生长、成熟造成极大的影响。植物的耐干旱性是一个多基因控制的复杂性状，其中涉及多种机制与信号通路共同参与。涉及干旱胁迫的信号转导过程比较复杂，往往还与抗热、冷冻以及氧化胁迫的信号途径相互交叉。
8.一直以来，提高植物的耐干旱能力是本领域的重要课题。本领域亟待探索更多的提高植物的耐干旱能力的有效途径。
技术实现要素：
9.本发明的目的在于提供一种新的调控植物对氮素利用效率的硝酸还原酶基因。
10.本发明的目的还在于提供一种硝酸还原酶基因及其作为植物抗逆调控靶标的应用。
11.本发明的目的还在于提供所述硝酸还原酶基因在增强植物氮素利用效率的方面的潜在应用。
12.在本发明的第一方面，提供一种调节植物的性状的方法，包括：靶向下调植物中nr1.2的表达或活性，所述性状包括：增强植物的耐旱能力；和/或降低植物苗期的地上部高度(植株株高)。
13.在一个优选例中，所述降低植物中nr1.2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默nr1.2的编码基因，或抑制nr1.2的活性；优选地，所述在植物中敲除或沉默nr1.2的编码基因包括：以crispr系统进行基因编辑从而敲除nr1.2的编码基因；以同源重组的方法敲除nr1.2的编码基因；以特异性干扰nr1.2的编码基因表达的干扰分子来沉默nr1.2；在含有nr1.2的植物中将nr1.2进行功能丧失性突变；或，以特异性抑制nr1.2参与的信号通路的化学抑制剂进行nr1.2的抑制。
14.在另一优选方式中，所述方法包括：以crispr方法进行基因编辑从而敲除nr1.2的编码基因，包括：靶向于nr1.2的编码序列的第511位，将c进行删除；或，在nr1.2的编码序列的第513～514之间的位置插入至少一个碱基、优选地插入a，使编码序列发生移位。
15.在另一优选方式中，以seq id no:3～6所示的引物、基于crispr体系，靶向于nr1.2的编码基因，进行基因敲除。
16.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2的下调剂的用途，用于调节植物的性状，包括：增强植物的耐旱能力，或制备增强植物耐旱能力的制剂。
17.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2的下调剂的用途，用于降低植物苗期的地上部高度，或制备降低植物苗期的地上部高度的制剂。
18.在另一优选方式中，所述下调剂包括：敲除或沉默nr1.2的编码基因的试剂，抑制nr1.2活性的试剂；优选地，所述下调剂包括：所述下调剂包括：针对nr1.2的crispr基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将nr1.2进行功能丧失性突变，特异性干扰nr1.2的编码基因表达的干扰分子，特异性抑制nr1.2参与的信号通路的化学抑制剂。
19.在另一优选方式中，所述的增强包括提高、促进等，其为显著性的增强、提高或促进，如耐旱能力增强、提高或促进5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更高(如存活率提高5％、10％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更高)。
20.在另一优选方式中，所述的降低表达包括缺失表达。
21.在另一优选方式中，所述的降低表示显著性的降低，如降低20％、40％、60％、80％、90％或更低。
22.在另一优选方式中，所述降低植物苗期的地上部高度，其是具有统计学意义的降低，如降低5％、8％、10％、12％、15％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
23.在另一优选方式中，所述的植物为或所述nr1.2来自禾本科植物；优选地包括(但不限于)：水稻(oryza sativa)，玉米(zea mays)，小米(setaria italica)，小麦(triticum aestivum)，黍(panicum miliaceum)，大麦(hordeum vulgare)，燕麦(avena sativa l.)，高粱(sorghum bicolor)，二穗短柄草(brachypodium distachyum)，黑麦(secale cereale)。
24.在另一优选方式中，所述降低植物苗期的地上部高度(植株株高)，是降低低氮条件下植物苗期的地上部高度。
25.在另一优选方式中，下调植物中nr1.2的活性后，所述的植物通过在苗期降低氮的利用效率来提高对干旱的抵抗能力。
26.在另一优选方式中，所述的旱/干旱包括(但不仅限于)以下情形导致的旱/干旱：土壤水分不足形成的干旱，植物的蒸腾失水超过根部吸水形成的干旱，土壤中缺乏氧气形成的干旱，盐碱土壤环境形成的干旱。
27.在另一优选方式中，所述的nr1.2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个(如1-20个，1-15个，1-10个，1-5个，1-3个或1-2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％(较佳地≥90％，≥95％，≥98％或≥99％)，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。
28.在本发明的另一方面，提供一种用于增强植物耐旱能力的nr1.2的下调剂，其为crispr基因编辑试剂；优选地，靶向于nr1.2的编码序列的第511位，将c进行删除；或，在nr1.2的编码序列的第513～514之间的位置插入至少一个碱基、优选地插入a，使编码序列发生移位。
29.在另一优选方式中，所述的crispr基因编辑试剂可以是sgrna构建体。
30.在本发明的另一方面，提供一种植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的所述的下调剂。
31.在一个优选方式中，所述的植物细胞、组织或器官不具有繁殖能力。
32.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2或编码其的基因的应用，用于作为硝酸还原酶；优选地，所述硝酸还原酶为nadh依赖型硝酸还原酶。
33.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2或编码其的基因的应用，用于促进植物对硝酸盐的吸收利用，或制备促进植物对硝酸盐的吸收利用的制剂。
34.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2或编码其的基因的应用，用于提高植物的氮利用效率，或制备提高植物的氮利用效率的制剂；优选地，所述植物为禾本科植物。
35.在本发明的另一方面，提供一种促进植物对硝酸盐的吸收利用或提高植物的氮利用效率的方法，包括在植物中提高nr1.2的表达或活性；优选地，包括将nr1.2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对nr1.2进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进nr1.2表达；或，以增强子促进nr1.2表达；优选地，所述植物为禾本科植物。
36.在本发明的另一方面，提供一种nr1.2作为筛选标记的应用，包括用于作为特异性筛选具有耐旱能力的植物的分子标记物，或用于作为鉴定植物耐旱能力的分子标记。
37.在本发明的另一方面，提供一种特异性选择或鉴定植物的方法，包括：鉴定测试植物中的nr1.2的表达或序列特征或活性；若是该测试植物的nr1.2高表达或高活性，则其为对硝酸盐的吸收利用高或氮利用效率高的植物；若是该测试植物的nr1.2低表达或不表达、
低活性或没有活性，则其为耐旱能力高的植物。
38.在另一优选方式中，所述高表达或高活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的提高，如提高10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
39.在另一优选方式中，所述低表达或低活性，是指与同类或同种植物的表达或活性的平均值相比，表达或活性具有统计学意义的降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低。
40.在另一优选方式中，所述耐旱能力高是指与同类或同种植物的耐旱能力相比，有统计学意义的耐旱能力的增强，如存活率提高5％、10％、20％、40％、60％、80％、90％或更高。
41.在本发明的另一方面，提供一种筛选增强植物耐旱能力的物质(包括潜在物质)的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达nr1.2的体系中；和(2)检测所述体系，观测其中nr1.2的表达或活性，若其表达或活性降低(显著降低，如降低10％、20％、40％、60％、80％、90％或更低)，则表明该候选物质为可用于增强植物耐旱能力的物质。
42.在另一优选方式中，所述方法还包括：设置不添加所述候选物质的对照组，从而明确分辨测试组中nr1.2表达或活性与对照组的差异。
43.在另一优选方式中，所述的候选物质包括(但不限于)：针对nr1.2或其编码基因或其上游或下游蛋白或基因设计的调控分子(如上调剂、下调剂、小分子化合物基因编辑构建物等。
44.本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
45.图1、水稻nr1.2的转基因敲除材料的基因型鉴定。
46.图2、zh11与nr1.2的转基因敲除材料osnr1.2-19，osnr1.2-29对硝酸有毒类似物chlorate的耐受性反应。
47.图3、正常氮/低氮条件下，转基因osnr1.2敲除植株与野生型生长情况比较。
48.图4、zh11与nr1.2的转基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29中硝酸还原酶活性的测定结果。
49.图5、体外表达纯化osnr1.2蛋白，鉴定nr1.2蛋白为一个nadh依赖型硝酸还原酶而非nadph依赖型硝酸还原酶。
50.图6、peg 4000模拟干旱环境下野生型zh11以及转基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29的抗旱表型比较。
51.图7、土壤干旱环境下野生型zh11以及转基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29的抗旱表型比较。
具体实施方式
52.本发明中，披露了一种新的调控植物对氮素利用效率的硝酸还原酶基因，称为nr1.2，其编码的蛋白称为nr1.2。本发明人意外地发现，nr1.2与植物的耐旱性性状密切相
关，在植物中降低nr1.2的表达/活性后、植物苗期的株高降低、从而植物的耐旱性增强。因此，可以以nr1.2为调控植物耐旱性状的靶点，下调nr1.2的材料或方法可应用于实现植物品种的改良。
53.如本文所用，所述的“耐旱能力/耐旱性”与“抗旱能力/抗旱性”可互换使用。
54.如本文所用，所述的“植物”为基因组中包含有本发明的nr1.2或其同源物(同源基因/同源多肽(蛋白))的植物，所述的植物可包括单子叶植物或多子叶植物；如：禾本科植物、十字花科植物、豆科植物等。优选地包括禾本科植物。在一些优选方式中，所述的植物为作物，较佳地为禾谷类作物。较佳地，所述禾本科植物如禾本科稻属植物水稻，禾本科小麦属植物如小麦，禾本科玉米属植物如玉米等。例如包括：水稻、高粱、玉米、大麦、小麦、燕麦、黑麦。本领域技术人员应理解，适用于本发明的技术方案的植物不仅限于上述列举的，可通过鉴定其中nr1.2同源物的存在情况来确定适当的植物。
55.如本文所用，所述的“苗期”是指植物萌芽期之后、成熟期之前的生长阶段；例如对于水稻这一植物，通常其苗期是从水稻种子萌芽到移栽插秧前，一共大约需要35天时间，插秧10天后进入到分蘖期。
56.如本文所用且本领域人员能够理解，选择合适的“对照植物”是实验设计的例行部分，可以包括对应的野生型植物或无目的基因的相应转基因植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同或属于同一类的品种。对照植物也可以是因分离而丢失转基因植物的个体。如本文所用的对照植物不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
57.如本文所用，所述的“地上部”也称为“地上部分”是指植物植株的部分组织，当植株种植于土地中或培养于培养液中时，该部分组织位于植株的地面或培养液面以上的部分。本发明中，所述的“地上部”的高度与植株株高代表相同的意义。
58.如本发明所用，所述的nr1.2或其编码基因的“下调剂”可以是蛋白水平的调控试剂/制剂，也可以是基因水平的调控试剂/制剂，包括了抑制剂、拮抗剂、阻滞剂、阻断剂等，它们之间可被互换使用。
59.本发明中，通过改变植物的遗传组成，使其可更能耐受胁迫条件。本发明公开的方法/用途是通过调节植物的硝酸还原酶或其编码基因来实现改善植物的胁迫耐受性。
60.nr1.2基因的功能尚未由本领域技术人员进行分析研究，本发明人首次发现nr1.2基因对植物耐旱性具有作用。
61.本发明中，来源于水稻的“osnr1.2”包括具有loc_os08g36500中所示序列的基因及其编码的多肽。对于氨基酸序列，技术人员可以理解，对多肽或蛋白质序列作出的会改变、添加或缺失所编码的序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的各个置换、缺失或添加，在该变更导致氨基酸为化学类似的氨基酸所置换时，为“保守修饰的变体”。因而，还可变更选自1至30的整数的任何数目的氨基酸残基。因而，例如，可作出1、2、3、4、5、7、10、15、20或25个变更。保守修饰的变体通常提供与它们所源自的未经修饰的多肽序列类似的生物活性。例如，酶活通常为天然蛋白质对于其天然底物的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。提供功能上相似的氨基酸的保守置换表是本领域所熟知的。
62.任何与本发明中所具体引用的nr1.2同源性高(比如同源性为70％或更高；优选地同源性为80％或更高；更优选地同源性为90％或更高，如同源性95％，98％或99％)的、且具
有所述nr1.2相同功能的多肽/基因也包括在本发明内。本发明中，所述的nr1.2也包括其同源物，也即存在于水稻以外的其它物种中、与本发明上述的序列具有同源性且功能与本发明中nr1.2相同的多肽/基因、或在同样或相近的信号通路中发挥同样或相近作用的多肽/基因。由于nr1.2在多种物种中保守性地存在，应理解，尽管优选本发明实施例中所提出的该nr1.2基因，本发明中并不仅限于实施例中具体列举的该基因。
63.本发明发现，所述nr1.2在植物的氮素利用效率方面有作用，而其缺失表达则可使得植物在苗期氮素利用效率降低、株高降低。本发明通过调节nr1.2的表达或活性，调节植物硝酸还原能力，进而影响植物氮素利用效率，可为农作物氮素高效利用育种提供基因资源和技术支持。
64.硝酸盐的类似物氯酸盐(chlorate)被植物吸收到体内经过同化作用变为亚次氯酸盐后对植物有非常明显的毒害效用，因此chlorate抗性常被用来指征植物对硝酸根的吸收或还原效率。本发明人发现，用chlorate对osnr1.2基因功能缺失突变体及野生型进行处理，突变体对chlorate毒性具有更强的耐受性，这表明该osnr1.2基因涉及植物氮素利用途径。此外，在植物中敲除osnr1.2基因能显著降低植物中硝酸还原酶的活性。为此，本发明人研究了该基因功能，通过体外表达纯化osnr1.2蛋白进行检测，发现与osnr1.2蛋白为一个nadh依赖型硝酸还原酶而非nadph依赖型硝酸还原酶。田间试验显示，与zh11相比osnr1.2基因敲除植物在低氮条件下相对分蘖数和产量降低更多。
65.令人意外的是，当osnr1.2基因能显著降低植物中硝酸还原酶的活性是具有针对性的，本发明观测到其在苗期植物中的影响最为显著，使得苗期植物的株高降低，从而有利于其耐旱能力的增强，有效提高干旱环境下苗期植物的存活率。这一下调osnr1.2基因对于苗期植物的影响作用，在低氮条件下表现得尤其显著。所述低氮条件如土壤氮素含量降低至20％以下、15％以下、10％以下、5％以下、2％以下、1％以下、0.8％以下、05％或更低。
66.在阅读了本发明中所提出的所述nr1.2的功能后，可以采用本领域人员熟知的或本领域正在发展的多种方法来调节所述的nr1.2的表达或活性，尤其是降低nr1.2表达或使之缺失表达。发明还提供了用于下调所述的nr1.2的物质(如生物分子或生物制剂，化学小分子或其制剂等)，其通过下调nr1.2从而发挥改良植物的性状的功能。
67.如本发明所用，所述的nr1.2或其编码基因的下调剂是指任何可降低nr1.2或其编码基因的稳定性、下调nr1.2的表达、降低nr1.2蛋白的活性、减少nr1.2蛋白的有效作用时间、或抑制nr1.2基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调nr1.2有用的物质，从而可用于增强植物耐旱性。例如，所述的下调剂是：特异性干扰nr1.2基因表达的干扰rna分子或反义核苷酸；是特异性与nr1.2基因编码的蛋白结合的抗体或配体；等等。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括dna、rna)的，也可以是蛋白水平的，也可以设计为两种水平的组合调控。
68.作为本发明的一种优选的方式，采用靶向的基因编辑技术进行nr1.2基因敲除/敲低，这通常可以利用crispr/cas(如cas9)系统。常见的敲除/敲低nr1.2基因的方法包括：将sgrna或能形成所述sgrna的核酸、cas9 mrna或能形成所述cas9 mrna的核酸共转到靶向区域或靶向细胞中。在确定了待突变的靶基因/靶位点之后，可以采用已知的方法来将sgrna及cas9引入到靶细胞内。例如，所述的能形成所述sgrna的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述cas9 mrna的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到
靶细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgrna及cas9mrna。本发明的实施例中提供了经优选的靶向性基因编辑试剂，其可适当且高效地对nr1.2进行靶向性地突变，从而实现适当而有效的下调(例如下调20～30％，30～40％，下调40～50％，下调50～60％，下调60～70％，下调80～90％，或下调90～100％)。
69.作为本发明的一种可选的方式，可采用同源重组的方法，特异性地靶向于nr1.2，进行nr1.2基因敲除/敲低。也可应用cre和loxp方法使动物或细胞的基因组中相关基因选择性的敲除，表达降低或失活。
70.作为一种可选方式，所述的下调剂可以是nr1.2特异性的干扰rna分子(如shrna、sirna、mirna等)，可根据本发明中提供的nr1.2序列信息制备获得此类干扰rna分子。对干扰rna分子的制备方法可以是但并不限于：体外转录法，人工合成法等。所述的干扰rna可通过采用适当的转染试剂被输送到细胞内。rnai用于抑制nr1.2。rnai是一种进化上保守的细胞防御机制，用于控制包括人在内的大多数真核生物中外源基因的表达。rnai通常由双链rna(dsrna)触发，并引起单链靶rna的序列特异性mrna降解。mrna降解的介体是小干扰rna双链体(sirnas)，通常由长dsrna在细胞内酶切产生。sirnas的长度通常约为21个核苷酸(例如21-23个核苷酸)。在将干扰rna导入细胞后，该序列被传递到称为risc(rna诱导沉默复合物)的酶复合物。risc识别目标并用核酸内切酶切割它。如果较大的rna序列被传递到细胞，rna酶iii酶(dicer)会将较长的dsrna转化为21-23nt的ds-sirna片段。作为另一种可选方式，可利用shrna技术进行干扰作用。shrna是一种rna序列，它可以使一个紧密的发夹旋转，可以用来沉默基因表达通过rna干扰。shrna使用导入细胞的载体并利用启动子来确保shrna始终被表达。这种载体通常传递给子细胞，使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构被细胞机制切割成sirna，然后与rna诱导沉默复合物(risc)结合。这种复合物结合并切割与它结合的sirna相匹配的mrnas。shrna由rna聚合酶iii转录。
71.作为其它可选的实施方式，使用与编码nr1.2的一个或多个核酸特异性杂交的反义化合物来调节nr1.2表达。寡聚物与其靶核酸的特异性杂交干扰了核酸的正常功能。这种通过与靶核酸特异性杂交的化合物对靶核酸功能的调节通常被称为“反义”。
72.作为一种可选方式，所述的下调剂是针对nr1.2的小分子化合物。可以采用适于小分子化合物的筛选的方法，来进行这类小分子化合物的筛选。所述的筛选可以依托本领域现有的或将要开发的各种化合物库，或自行建立一些新化合物库。
73.作为本发明的一种优选的实施方式，利用基因工程技术构建crispr-cas9敲除表达载体，通过农杆菌侵入法转入野生型植物愈伤组织中，使nr1.2在野生型中缺失表达。缺失突变体植株表现为低氮敏感。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，转化载体具有抗性的抗生素标记物(卡那霉素、潮霉素)。携带有本发明osnr1.2基因的crispr-cas9敲除载体可通过使用ti质粒、ri质粒、农杆菌介导浸花法等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物经组织培育成植株。
74.本发明还提供了包含以上任一种具有下调活性的生物分子的表达载体，优选植物表达载体；更优选适合于进行后续转基因操作(如应用农杆菌的转基因操作)的表达载体。可以运用本领域已知的方法来构建表达载体，一般其含有启动子和目的基因序列。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点、转录终止子等。
75.本发明还提供遗传工程化的宿主细胞，其含有基因编辑分子(如crispr/cas编辑
试剂)、干扰分子或沉默体序列或含有包含干扰分子或沉默体序列的载体。宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法等。
76.本领域此前的研究中，nr1.2基因的功能未被分析研究，本发明人首次发现nr1.2基因对植物耐旱性具有作用。在本发明人作出这一发现的基础上，本发明还涉及利用nr1.2作为分子标记的应用，其可作为基因转化植株后代的追踪标记。本发明也包括早期确定植物的耐旱性能的方法，这通过检测植物中nr1.2的表达情况或活性来进行。
77.本发明的特异性鉴定植物的耐旱性的方法包括：鉴定待测植物的nr1.2，若是该测试植物的nr1.2低表达或不表达，则其为具有耐旱性的植物。同时，这一植物在苗期的地上部高度低于常规的野生型植株，这种株型上的差异也可作为本发明所述鉴定方法的辅助性手段。此外，也可采用本领域已知的或正在发展的多种技术来进行核酸序列分析或蛋白分析。
78.在种植早期或种植前就能够鉴定出植物的耐旱性，可为植物育种工作带来便利；例如，可以在种子阶段即进行鉴定，决定种子的优劣，根据鉴定结果加以合适的选择。
79.在得知了nr1.2的功能及其分子机制以后，也可以基于此进行植物的定向筛选。也可基于该新发现来筛选通过调节nr1.2从而靶向调控植物耐旱性的潜在物质。
80.本发明提供了一种筛选提高植物耐旱性的潜在物质的方法，所述方法包括：(1)用候选物质处理一表达体系，该体系表达nr1.2；和(2)检测所述体系中nr1.2的表达或活性；若所述候选物质在统计学上降低nr1.2的表达或活性，则表明该候选物质是提高植物耐旱性的潜在物质。
81.以蛋白或基因或其上特定的区域作为靶点，来筛选作用于该靶点的物质的方法是本领域人员所熟知的，这些方法均可用于本发明。所述的候选物质可以选自：肽、聚合肽、拟肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、抗体或抗体片段、配体、有机小分子、无机小分子和核酸序列等。根据待筛选的物质的种类，本领域人员清楚如何选择适用的筛选方法。
82.经过大规模的筛选，可以获得一类特异性作用于nr1.2或其参与的信号途径或其上下游途径相关基因有调控作用的物质。
83.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
84.试剂和溶液
85.1000x yoshida母液分别为：
[0086][0087]
序列信息
[0088]
loc_os08g36500(seq id no:1)
[0089]
atggccgcttccgtgcagccgcggcagttcggccacctcgagccgggctccgcgccggtgtgcggcgccgcatcctcgaacggcgccaaggcgtaccctcccgcgaacggcatcccgcgccgcgccgactcaccggtgcgcgggtgcggcttccctcccctcgtctcgccaccttcgcggaagccgcccagcgatgggtcggacgacgaggaggaggagcaggaggactggcgggagctgtacggctcgcacctgcagctggaggtggaaccgtcggtgcgcgacgcgcgcgacgagggcaccgccgacgcgtggatcgagcgcaacccgttgctgatccggctcaccgggaaacacccgctgaactgcgaggcgccgctggcgaggctcatgcaccacggcttcatcaccccggctgcgctgcacttcgtgcgcaaccacggcgcagtgccgcggggtgactggtcgacgtggaccgtcgaggtgacggggctcgtcaagcgtcccatgcggctcaccgtggacgagctggtcaacggcttccccgccgtggaggtccccgtcacgctggcctgctcggggaaccgccgcaaggagcagaacatggtgcagcagactgtggggttcaactttggcgccgccgccgtgtccacgtcggtgtggcacggcgcccgcctccgcgacgtgctccggcggtgcggcatcatgcccagcaagggcggtgcgctcaacgtgtgcttcgagggcgccgaggacctccccggcggcggcggctccaagtacggcaccagcatcacacgccagtgggcgctggacccgtcgcgggacatcatgctcgcctacatgcagaatggcgagccgctgctccccgaccacggcttccccgtccgcgccatcatccccggctgcaccggcggccgcatggtcaagtgggtcaagcgcatcatcgtcaccaccgccgagtccgacaactactaccattacaaggacaaccgcgtcttcccgtcccatgtcgacgccgagctcgccaacgccgatgcgtggtggtacaagccggagtacatcatcaacgagctgaacgtgaactcggtgatcacggcgcccgggcacgacgagatcctgcccatcaacggcatcaccacgcagcgcggctacaccatgaagggatacgcctactccggcggcggcaagaggatcacgcgggtggaggtgacgctggacggcggcgagacatggctggtgtgcgtgctggacctcccggagaagcccaccaagtacggcaagcactggtgctggtgcttctggtccgtcgaggtcgaggtgctcgacctcctcggcgccaaggagatcgccgtgcgcgcctgggaccagtcgcacaacacccagcccgagaagctcatctggaatctcatggggatgatgaacaactgctggttcaaggtgaaggtgaacgtgtgccggccgcacaagggtgagatcgggctggtgttcgagcacccgacgcagcccgggaaccagaccggcgggtggatggcgaggcagaagcacctggagacggcggaggcggccgcaccggggctgaagcggagcacgtcgacgccgttcatgaacaccaccgacggcaagcagtttaccatgtccgaggtgcgcaagcactcgtcgcaggactcggcgtggatcgtcgtc
cacggtcacgtctacgactgcacggccttcctcaaggaccaccccggcggcgccgacagcatcctcatcaacgccggcaccgactgcaccgaggagttcgacgccatccactccgacaaggccaaggcgctcctcgacacctaccgcatcggcgagctcatcaccaccggcgccgggtacagctccgacaactccgtccacggcgcgtccaacctctcccagctcgcccccatccgcgaggccatcaaggcgccggcgcccgtcgcgctctccagcccgcgcgacaaggtcccctgccaactcgtcgacaagaaggagctctcccgcgacgtccgcctcttccgcttcgcgctgccgtcctccgaccaggtgctcggcctccccgtcggcaagcacatcttcgtgtgcgccagcatcgaagggaagctgtgcatgcgggcgtacacgccgacgagcatggtcgacgaggtcggccacttcgacctcctcatcaaggtgtacttcaagaacgagcaccccaagttccccgatggcgggctcatgacgcagtacctggactcgctccccgtgggcgcctacatcgacgtcaaggggccactcggccacgtcgagtacaccggccgcggcgagttcgtcatcaacggcaagccgcggaacgcgcggcggctggcgatgatcgccggcgggagcgggatcacgcccatgtaccaggtcatccagtcggtgctgcgcgaccagccggaggacacgacggagatgcacctggtgtacgcgaaccggacggaggacgacatcctcctccgcgacgagctcgaccggtgggcggcggagtacccggacaggctcaaggtgtggtacgtcatcgaccaggtgaagcggccggaggaagggtggaagtacggcgtcgggttcgtcacggaggaggtgctgcgggagcacgtgccggagggcggcgacgacacgctcgcgctcgcctgcgggccgccgccgatgatcaagttcgccgtctcgccgaacctggagaagatgaagtacgacatggccaattctttcatcgtgttctaa
[0090]
osnr1.2蛋白(seq id no:2)
[0091]
maasvqprqfghlepgsapvcgaassngakayppangiprradspvrgcgfpplvsppsrkppsdgsddeeeeqedwrelygshlqlevepsvrdardegtadawiernpllirltgkhplnceaplarlmhhgfitpaalhfvrnhgavprgdwstwtvevtglvkrpmrltvdelvngfpavevpvtlacsgnrrkeqnmvqqtvgfnfgaaavstsvwhgarlrdvlrrcgimpskggalnvcfegaedlpggggskygtsitrqwaldpsrdimlaymqngepllpdhgfpvraiipgctggrmvkwvkriivttaesdnyyhykdnrvfpshvdaelanadawwykpeyiinelnvnsvitapghdeilpingittqrgytmkgyaysgggkritrvevtldggetwlvcvldlpekptkygkhwcwcfwsvevevldllgakeiavrawdqshntqpekliwnlmgmmnncwfkvkvnvcrphkgeiglvfehptqpgnqtggwmarqkhletaeaaapglkrststpfmnttdgkqftmsevrkhssqdsawivvhghvydctaflkdhpggadsilinagtdcteefdaihsdkakalldtyrigelittgagyssdnsvhgasnlsqlapireaikapapvalssprdkvpcqlvdkkelsrdvrlfrfalpssdqvlglpvgkhifvcasiegklcmraytptsmvdevghfdllikvyfknehpkfpdgglmtqyldslpvgayidvkgplghveytgrgefvingkprnarrlamiaggsgitpmyqviqsvlrdqpedttemhlvyanrteddillrdeldrwaaeypdrlkvwyvidqvkrpeegwkygvgfvteevlrehvpeggddtlalacgpppmikfavspnlekmkydmansfivf*
[0092]
实施例1、osnr1.2 crispr-cas9敲除的转基因突变体植物的建立
[0093]
1、突变载体的构建与纯合突变体的鉴定
[0094]
(1)osnr1.2敲除突变载体的构建。
[0095]
设计点突变体载体的引物：
[0096][0097]
以稀释100倍的pcbc-dt1t2(获自中国农业大学生物学院)为模板进行四引物pcr扩增。osnr1.2-dt1-bsf/osnr1.2-dt2-bsr为正常引物浓度(浓度为10μm)；osnr1.2-dt1-f0/os-nr1.2-dt2-r0稀释20倍。纯化回收pcr产物，建立酶切-连接体系将目的片段连入表达载体phee401(获自中国农业大学生物学院)中。
[0098]
(2)将酶连正确的载体转入农杆菌备用。
[0099]
(3)osnr1.2突变体的鉴定：基因扩增引物
[0100]
osnr1.2-crispr-f：gccaaagttgaaccccacag(seq id no:7)；
[0101]
osnr1.2-crispr-r：aggaggagcaggaggactg(seq id no:8)。
[0102]
(4)提取植物叶片的总dna，以dna为模板，利用设计的突变体引物进行两轮pcr验证突变体的纯合性。
[0103]
(5)将鉴定出的纯合突变体提取rna进行荧光定量pcr鉴定基因osnr1.2的表达量。
[0104]
(6)纯合突变体命名为osnr1.2。
[0105]
2、转基因苗的分子鉴定
[0106]
提取转基因材料不同株系叶片的总rna，反转录总cdna，进行荧光定量pcr鉴定。所述鉴定包括：进行总rna的提取，总cdna的合成，定量pcr。
[0107]
经过筛选，本发明人得沉默效果明显的植株，称为osnr1.2-19和osnr1.2-29转基因株系(图1)。
[0108]
其中，osnr1.2-19转基因株系中，在osnr1.2基因(cds序列)的第511位，删除1bp碱基，即删除1个c，从而导致该基因所编码的蛋白质从该密码子起发生移位突变；
[0109]
其中，osnr1.2-29转基因株系中，从osnr1.2基因(cds序列)的第513位之后，插入1bp碱基，即插入1个a，从而导致该基因所编码的蛋白质从该密码子起发生移位突变。
[0110]
实施例2、野生型及转基因植物的氯酸钠(chlorate)耐受性分析
[0111]
硝酸盐的类似物氯酸盐(chlorate)被水稻吸收到体内经过同化作用变为亚次氯酸盐后对水稻有非常明显的毒害效用，因此chlorate抗性可被用来指征植物对硝酸根的吸收或还原效率。
[0112]
本实施例中，就zh11及前述构建的osnr1.2 crispr-cas9敲除突变体植株，进行chlorate的耐受性分析。
[0113]
chlorate耐受性分析的处理方法如下：
[0114]
(1)水稻种子发芽后，自来水培养3天；
[0115]
(2)yoshida培养液培养5～7天；
[0116]
(3)将母液a中的nh4no3换为2mm kno3培养2天；
[0117]
(4)然后用2mm氯酸钠(chlorate)处理1～2天，随时观察表型。
[0118]
步骤(4)处理后的2天后，zh11与nr1.2的转基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29对硝酸有毒类似物chlorate的耐受性反应如图2所示，可见，处于苗期的野生型zh11在2mm氯酸钠后叶子、茎干枯黄，不能存活；而处于苗期的转基因osnr1.2敲除植株则尽管与未处理组相比叶子颜有变浅，但仍能保持存活。
[0119]
转基因敲除突变体植株更为耐受chlorate毒性，说明其对chlorate的吸收利用少，这一结果说明其对硝酸盐的吸收利用少，氮利用效率变低。
[0120]
实施例3、苗期株高分析
[0121]
同时，本技术人在正常氮(2mm kno3)以及低氮(0.01mm kno3)条件下水培培养野生型以及转基因osnr1.2敲除植株，观测它们的生长情况。
[0122]
本技术人观察到，正常氮条件下，转基因osnr1.2敲除植株与野生型生长情况相近。但是，在低氮条件下，苗期的转基因osnr1.2敲除植株的株高变矮、地上部的鲜重下降，如图3所示。这种株高的显著下降有利于植物抵抗干旱环境。
[0123]
进一步的生长观测可见，转基因株系进入成熟期后，其株高与野生型接近，也即转基因植物在苗期这一易于受到干旱影响的阶段增强对干旱
[0124]
上述结果提示，转基因株系通过在苗期降低氮的利用效率来提高对干旱的抵抗能力。
[0125]
实施例4、硝酸还原酶(nr)活性测定
[0126]
将水稻水培3周后，取地上部进行硝酸还原酶的测定，根据购自上海优选生物公司的硝酸还原酶活性检测试剂盒操作完成。每个样品一个测定管和对照管，同时加标准管及空白管，加样过程中保证各组分按照顺序依次加入。
[0127]
zh11与nr1.2的转基因敲除材料osnr1.2-19和osnr1.2-29中硝酸还原酶活性的测定结果如图4。结果显示，野生型zh11中硝酸还原酶活性高；而转基因osnr1.2敲除植株中则硝酸还原酶活性发生显著性下降。
[0128]
因此，osnr1.2编码的蛋白质为一种硝酸还原酶。
[0129]
实施例5、osnr1.2为nadh依赖型硝酸还原酶
[0130]
osnr1.2原核表达表达载体的构建与大肠杆菌转化：
[0131]
根据osnr1.2的cdna序列，分别设计去掉终止密码子的特异引物，以cdna全长为模板利用高保真酶kodplus(toyobo公司)进行pcr扩增。pcr产物经电泳回收后通过同源重组的方法克隆到原核表达载体pgex4t-1中。阳性克隆进行测序验证正确后保存。
[0132]
将所获得的重组质粒转入到感受态的大肠杆菌bl21菌株中，经过蛋白表达及纯化，获得纯化的osnr1.2蛋白。随后委托上海优选生物公司进行osnr1.2纯化蛋白的硝酸还原酶活性测定及nadh、nadph依赖性检测。
[0133]
结果如图5。结果显示，体外表达纯化osnr1.2蛋白鉴定该蛋白为一个nadh依赖型硝酸还原酶而非nadph依赖型硝酸还原酶。
[0134]
实施例6、peg 4000模拟干旱环境下植物的抗旱表型
[0135]
本实施例中，以20％peg 4000来模拟干旱环境，测定zh11及osnr1.2crispr-cas9敲除突变体对干旱的耐受性。实验步骤如下：
[0136]
1)水稻种子发芽后，自来水培养3天；
[0137]
2)yoshida培养液培养3周；
[0138]
3)用20％peg 4000处理20天，随后再换回yoshida培养液恢复10天，随时观察表型。
[0139]
结果如图6。根据该图所示，野生型zh11对于干旱的耐受性低；而转基因osnr1.2敲除植株则对于干旱的耐受性显著地提高；尤其是osnr1.2-29转基因osnr1.2敲除对于干旱的耐受性更为理想。
[0140]
实施例7、土壤干旱环境下植物抗旱表型研究
[0141]
将水稻种在土壤中直接进行干旱处理，测定zh11及osnr1.2crispr-cas9敲除突变体对干旱的耐受性。实验步骤如下：
[0142]
1)水稻种子发芽后，自来水培养3天；
[0143]
2)直接种到土壤中正常培养(正常给水)2周；
[0144]
3)停止给水，干旱处理10天，随时观察表型。
[0145]
结果如图7。根据该图所示，野生型zh11对于干旱的耐受性低；而转基因osnr1.2敲除植株则对于干旱的耐受性显著地高于野生型植株。
[0146]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
技术特征：
1.一种调节植物的性状的方法，包括：靶向下调植物中nr1.2的表达或活性，所述性状包括：增强植物的耐旱能力；和/或降低植物苗期的地上部高度。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述降低植物中nr1.2的表达或活性包括：在植物中敲除或沉默nr1.2的编码基因，或抑制nr1.2的活性；优选地，所述在植物中敲除或沉默nr1.2的编码基因包括：以crispr系统进行基因编辑从而敲除nr1.2的编码基因；以同源重组的方法敲除nr1.2的编码基因；以特异性干扰nr1.2的编码基因表达的干扰分子来沉默nr1.2；在含有nr1.2的植物中将nr1.2进行功能丧失性突变；或，以特异性抑制nr1.2参与的信号通路的化学抑制剂进行nr1.2的抑制。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以crispr方法进行基因编辑从而敲除nr1.2的编码基因，包括：靶向于nr1.2的编码序列的第511位，将c进行删除；或，在nr1.2的编码序列的第513～514之间的位置插入至少一个碱基、优选地插入a，使编码序列发生移位。4.一种nr1.2的下调剂的用途，用于调节植物的性状，包括：增强植物的耐旱能力，或制备增强植物耐旱能力的制剂；和/或降低植物苗期的地上部高度，或制备降低植物苗期的地上部高度的制剂。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述下调剂包括：敲除或沉默nr1.2的编码基因的试剂，抑制nr1.2活性的试剂；优选地，所述下调剂包括：所述下调剂包括：针对nr1.2的crispr基因编辑试剂、同源重组试剂或定点突变试剂，所述试剂将nr1.2进行功能丧失性突变，特异性干扰nr1.2的编码基因表达的干扰分子，特异性抑制nr1.2参与的信号通路的化学抑制剂。6.如权利要求1～5任一所述，其特征在于，所述的植物为或所述nr1.2来自禾本科植物；优选地包括：水稻(oryza sativa)，玉米(zea mays)，小米(setaria italica)，小麦(triticum aestivum)，黍(panicum miliaceum)，大麦(hordeum vulgare)，燕麦(avena sativa l.)，高粱(sorghum bicolor)，二穗短柄草(brachypodium distachyum)，黑麦(secale cereale)；或所述降低植物苗期的地上部高度，是降低低氮条件下植物苗期的地上部高度；或下调植物中nr1.2的活性后，所述的植物通过在苗期降低氮的利用效率来提高对干旱的抵抗能力。7.如权利要求1～5任一所述，其特征在于，所述的nr1.2的多肽的氨基酸序列选自下组：(i)具有seq id no:2所示氨基酸序列的多肽；(ii)将如seq id no:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，具有所述调控性状功能的、由(i)衍生的多肽；(iii)氨基酸序列与seq id no:2所示氨基酸序列的同源性≥85％，具有所述调控性状功能的多肽；(iv)seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的活性片段；或(v)在seq id no:2所示氨基酸序列的多肽的n或c末端添加标签序列或酶切位点序列，
或在其n末端添加信号肽序列后形成的多肽。8.一种用于增强植物耐旱能力的nr1.2的下调剂，其为crispr基因编辑试剂；优选地，靶向于nr1.2的编码序列的第511位，将c进行删除；或，在nr1.2的编码序列的第513～514之间的位置插入至少一个碱基、优选地插入a，使编码序列发生移位。9.一种植物细胞、组织或器官，其中含有有外源的权利要求8所述的下调剂。10.一种nr1.2或编码其的基因的应用，用于：作为硝酸还原酶；优选地，所述硝酸还原酶为nadh依赖型硝酸还原酶；促进植物对硝酸盐的吸收利用，或制备促进植物对硝酸盐的吸收利用的制剂；提高植物的氮利用效率，或制备提高植物的氮利用效率的制剂；优选地，所述植物为禾本科植物。11.一种促进植物对硝酸盐的吸收利用或提高植物的氮利用效率的方法，包括在植物中提高nr1.2的表达或活性；优选地，包括将nr1.2的编码基因或含有该编码基因的表达构建物或载体转入植物中；对nr1.2进行功能获得性突变；以表达增强型启动子或组织特异性启动子促进nr1.2表达；或，以增强子促进nr1.2表达；优选地，所述植物为禾本科植物。12.一种nr1.2作为筛选标记的应用，包括用于：作为特异性筛选具有耐旱能力的植物的分子标记物；或作为鉴定植物耐旱能力的分子标记。13.一种特异性选择或鉴定植物的方法，包括：鉴定测试植物中的nr1.2的表达或序列特征或活性；若是该测试植物的nr1.2高表达或高活性，则其为对硝酸盐的吸收利用高或氮利用效率高的植物；若是该测试植物的nr1.2低表达或不表达、低活性或没有活性，则其为耐旱能力高的植物。14.一种筛选增强植物耐旱能力的物质的方法，包括：(1)将候选物质加入到表达nr1.2的体系中；和(2)检测所述体系，观测其中nr1.2的表达或活性，若其表达或活性降低，则表明该候选物质为可用于增强植物耐旱能力的物质。
技术总结
本发明提供了一种硝酸还原酶基因及其作为植物抗逆调控靶标的应用。本发明揭示了一种新的调控植物对氮素利用效率的硝酸还原酶基因，称为R1.2。R1.2与植物的耐旱性性状密切相关，在植物中降低R1.2的表达/活性后、植物苗期的株高降低、同时植物的耐旱性增强。因此，可以以R1.2作为调控植物耐旱性状的靶点，下调R1.2的材料或方法可应用于实现植物品种的改良。改良。
