一种单座苣苔的分子育种方法
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种快速获得大量转基因单座苣苔新种质的分子育种方法。
背景技术：
2.单座苣苔(metabriggsia ovalifolia w.t.wang)为苦苣苔科、单座苣苔属植物，是一种分布在我国广西(那坡、靖西和环江三县)、贵州(荔波)和云南海拔1100米石灰岩林下区域特有植物，该植物既在苦苣苔科植物系统演化、特殊生境植物生长发育调控机理和生态物种多样性维持等方面具有重要的科学研究价值，又在园艺植物资源开发利用方面具有极高的经济开发价值，但由于其对特殊生境的需要，该植物已列入中国国家ⅰ级保护植物、列入《世界自然保护联盟濒危物种红名录》。拯救单座苣苔植物资源已到了刻不容缓的地步。
3.转基因生物技术无疑是现代生物技术应用最为迅速的重大技术之一，在培育植物优良品种方面具有独特的优势，特别是对于需要特殊生境下才能完成生活史的植物来说，传统的杂交、引种驯化、芽变、理化诱变等技术在这些植物上的应用研究受到限制，因此，转基因技术更是在这些植物分子育种中发挥极其重要的作用。
4.目前还未见有单座苣苔转基因技术研究论文和专利的报道。因此，开发单座苣苔分子育种技术具有重要的科学研究和生产意义。
技术实现要素：
5.本发明的目的是针对现有技术中没有单座苣苔转基因技术的不足，提供了一种快速获得大量转基因单座苣苔的分子育种方法，能够在4个月内获得大量的单座苣苔新种质，并应用该方法创制了早花的单座苣苔新种质，填补了国内外单座苣苔的遗传转化育种技术方面的空白，满足目前对单座苣苔濒危科学机理研究和观赏资源开发对其遗传转化技术的迫切需要，在其种质资源挽救、物种多样性维持、可持续发展中具有显著的科学、生态、经济和社会效益意义。
6.本发明的一种单座苣苔的分子育种方法，包括以下步骤：
7.s1.用于转化的外植体的培养：外植体为单座苣苔再生植株的叶片、叶柄或茎；所述的再生植株是通过以下步骤制备的：取单座苣苔幼叶消毒后，切成0.5-0.8cm长的切段，接种到芽诱导培养基，培养出现绿愈伤组织而后发育为芽，芽高达1cm时将芽切出转接入生根培养基培养，诱导生根获得再生植株；
8.所述的芽诱导培养基为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；
9.所述的生根培养基为1/2ms培养基添加30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；
10.s2.转化获得抗性植株：将步骤s1制备的外植体浸泡于含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌液中25-35分钟，然后取出外植体，吸干多余的菌液后将外植体移
至共培养基中，黑暗下培养3天，然后取出共培养后的外植体，漂洗后将外植体移至抗性芽诱导筛选培养基i中，光下培养，待长出抗性芽后，将抗性芽转接至新鲜抗性芽诱导培养基ii，待抗性芽高达1cm时，移到抗性芽生根培养基中，光下培养，抗性芽伸长并产生不定根，获得抗性植株；
11.所述的共培养基为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、20mg/l乙酰丁香酮、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.5；
12.所述的抗性芽诱导筛选培养基i为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15-30mg/l潮霉素、500mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；
13.所述的抗性芽诱导筛选培养基ii为ms培养添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15-30mg/l潮霉素和250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；
14.所述的抗性芽生根培养基为1/2ms培养基添加25-30mg/l潮霉素、250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；
15.s3.抗性植株的分子检测：利用植物表达载体上的筛选标记基因、报告基因或者目标基因的序列进行southern杂交检测基因是否已转入单座苣苔基因组，采用gus染或northern杂交检测目标基因的表达水平，检测抗性芽或者抗性植株是否为转基因材料；
16.s4.转基因植株的移栽：将检测确认为含有目标基因的抗性植株从培养瓶中移出，洗去根部培养基，定植在装有栽培基质的盆中，得到移栽成功的转基因植株。
17.优选，所述的步骤s1的消毒为将幼叶用自来水冲洗干净后，放入质量分数0.1％的多菌灵水溶液中浸泡5-10分钟，取出后用自来水冲洗干净；用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30秒，再用无菌水冲洗3遍后，将幼叶移入含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％水溶液中浸泡12分钟，用无菌水冲洗6遍，然后将叶片置于无菌滤纸上吸干水分。
18.优选，所述的步骤s2的漂洗为将共培养后的外植体用质量分数0.05％吐温80无菌水溶液冲洗5～6次，然后用500mg/l头孢霉素无菌水溶液冲洗一次，置外植体于无菌纸上吸干水。
19.优选，所述的步骤s2中，将外植体浸泡于含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌液中25分钟。
20.优选，所述的步骤s2中，所述的抗性芽诱导筛选培养基i为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15mg/l潮霉素、500mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；所述的抗性芽诱导筛选培养基ii为ms培养添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15mg/l潮霉素和250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8。
21.优选，所述的步骤s2中，所述的抗性芽生根培养基为1/2ms培养基添加25mg/l潮霉素、250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8。
22.优选，所述的步骤s1和s2中的培养温度为23-26℃。
23.优选，所述的含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌是通过以下方法构建的：将目标基因插入表达载体启动子之后，通过冻融法将构建好的携带目标基因的植物表达载体导入根癌农杆菌，经抗性筛选，获得含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌。
24.优选，所述的含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌菌液是通过以下步骤制备的：先将含有携带目标基因的植物表达载体的根癌农杆菌悬浮在含有20mg/l乙酰丁
香酮的ms培养基中，其ph为5.2，培养至od600＝0.4-0.5。
25.优选，所述的植物表达载体为pcambia1301载体(其含有由camv 35s启动子驱动β-葡萄糖醛糖苷酶报告基因gus和潮霉素磷酸转移酶筛选基因hpt作为筛选基因)、或p1390ubi载体。所述的p1390ubi载体是采用hindiii和bamhi从质粒pahc27中切下ubiquitin启动子并将该启动子片段插到质粒pcambia1390的hindiii和bamhi位点处构建得到的，其含有由camv 35s启动子驱动潮霉素磷酸转移酶筛选基因hpt作为筛选基因和玉米ubiquitin启动子。根据研究需要，目标基因可插入在以上载体的camv 35s启动子或ubiquitin启动子之后。
26.所述的ms培养基为国际通用的培养基，其成份和配置方法见toshio murashige,folke skoog(1962)a revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures.physiollogia plantarum,15:473-497。1/2ms培养基是将ms培养基中各元素减半的培养基。
27.本发明先采用植物组织培养技术获得大量供基因转化所用的单座苣苔无菌苗；根据实际研究或育种目标的需要构建含有由烟草花椰菜花叶病毒的camv35s启动子或玉米的ubiquitin启动子驱动的目标基因和筛选标记基因的植物表达载体，将表达载体导入根癌农杆菌，使根癌农杆菌与叶片、叶柄、茎外植体共培养，使用筛选标记基因相应的抗生素筛选得到的抗性芽、抗性植株，经gus染、southern杂交检测技术证明均是转基因的材料。从无菌苗切取叶片、叶柄、茎节外植体进行根癌农杆菌浸染到获得可以移栽的转基因植株，整个操作过程为4个月。一次操作100个叶片外植体，平均可以获得大约11个株系的转基因株系，每个转基因叶片经6周培养可以产生20个以上的芽，再生植株的生根率为100％，转基因植株移栽到土壤的存活率达100％。
28.利用本发明方法在4个内就可以获得大量转基因单座苣苔新种质，满足目前对单座苣苔生物学研究及培育技术的迫切需要，同时还为单座苣苔种质资源的创新、研发、培育优良新品种的研究等提供一种有效的研究方法和宝贵的研究材料，具有显著的科学、生态、经济和社会效益意义。
29.本发明具有以下优点：
30.(1)加速单座苣苔科学研究
31.转基因技术是植物科学研究的重要手段，本发明提供的转基因技术，可为单座苣苔基因功能、发育、繁殖、特性等科学研究提供必需的研究技术，促进单座苣苔这种濒危物种的科学研究。
32.(2)快速创制单座苣苔遗传改良新品种
33.单座苣苔花奇特，利用本发明方法可以在4个月内获得大量的单座苣苔新种质，创制一系列突变体，且可以根据育种、景观或生态需要有目的性地改良单座苣苔的性状，开发单座苣苔的观赏园艺价值。
34.(3)高效的单座苣苔组织培养植株再生体系
35.前人有关单座苣苔的芽诱导采用高浓度的tdz、ba、naa、iba，芽生根同时采用naa和iba。本发明建立的单座苣苔组织培养植株再生体系非常高效：从本发明培养的无菌苗切取的叶片、叶柄、茎节均100％能在本发明中提供的芽诱导培养基中诱导长芽，芽诱导培养基只采用ba和naa；再生芽在本发明的生根培养基中生根率100％，生根培养基不加激素；
100％的再生植株均能成功移栽土壤存活。
36.(4)转化用的外植体培养简单
37.本发明提供的方法，无菌苗可长期在实验室条件下无菌保存，外植体的来源不受限制，随时可以进行转基因的操作。
38.(5)严格有效的筛选转化植株的方法
39.经25mg/l潮霉素筛选压得到的抗性植株，经gus染、southern杂交、northern杂交实验证明均是转基因的材料。这样确保了通过该技术方法所获得的抗性植株是转基因植株、减少了后期采用分子检测的工作量。
40.(6)转化效率高、重复性好
41.本发明提供的技术方法经多次重复实验，证明转化率为11％-15.2％(表4)。因转化所用的外植体易大量获得，所以一次转化实验操作就可以获得大量所需的转基因株系。
42.(7)育种效率高
43.通过以上操作，每个阳性转化外植体均能产生丛生芽，丛生芽又能通过继代增殖，每1个继代增殖周期(21天)由1个叶片可增殖形成20个以上芽，且都能生根发育成植株，因此应用本发明方法在4个月内能获得大量的转基因株，100％转基因株能够成功地移栽到土壤中，保证了分子育种方法培育的品种栽培成功。
附图说明
44.图1为植物表达载体的t-dna区域示意图；其中，35s pro为烟草花椰菜花叶病毒的camv35s的启动子；ubi为玉米的ubiquitin启动子。
45.图2为接种于抗性芽诱导筛选培养基42天时的转pcambia1301的抗性丛芽。
46.图3为与根癌农杆菌eha105/pcambia1301共培养3天之后的单座苣苔叶片外植体gus基因瞬时表达检测结果。
47.图4为gus染呈现蓝的转pcambia1301的抗性丛生芽(42天；图a)和抗性芽(80天；图b)。
48.图5为无gus染的未转化再生植株(图a)和有gus染的转pcambia1301的抗性再生植株(图b)。
49.图6为southern杂交检测pcambia1301转化株中的hpt的结果；其中，wt为未转化株，显示没有杂交信号；t1、t2、t3、t4、t5为pcambia1301转化株，均有杂交信号且均是不同转化株系。
50.图7为移栽生长间(22
±
1℃)蛭石基质中22天(图a)、40天(图b)、67天(图c)、90天(图d)时的hd3a植株开花时的表型，移栽1个月(图e)、1年时还未见有开花的野生型wt再生植株和转pcambia1301的植株(图f)。
51.图8为southern杂交检测hd3a(图a)和northern杂交检测hd3a的表达(图b)；其中，wt为未转化株，显示没有检测到hd3a特有的杂交信号和hd3a的表达；h1、h2、h3、h4为转hd3a植株，分别对应图7中的a、b、c、d植株样品。
具体实施方式
52.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
53.实施例1
54.本实施例的一种单座苣苔的分子育种方法，包括以下步骤：
55.a.用于转化的外植体的培养
56.取单座苣苔生长良好的幼叶，用自来水冲洗干净后，放入质量分数0.1％的多菌灵水溶液中浸泡5-10分钟，取出后用自来水冲洗干净。用体积分数75％乙醇水溶液浸泡30秒，再用无菌水冲洗3遍后，将幼叶移入含质量分数0.05％吐温80的质量分数0.1％水溶液中浸泡12分钟，用无菌水冲洗6遍，然后将叶片置于无菌滤纸上吸干水分。将叶片分切成长0.6cm切段，用于转化实验或逐个接种到芽诱导培养基，所述的芽诱导培养基为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8。置于温度24
±
1℃，光照度50μmol
·m–2·s–1，光照12h/天条件下培养。培养21天左右，可见有绿愈伤组织出现，后发育为芽，芽高约1cm时将芽切出转接入生根培养基，所述的生根培养基为1/2ms培养基添加30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8；所述的1/2ms培养基指将ms培养基中的所有元素减半得到的培养基。相同条件下进行生根诱导。后以21天为1个继代，不断将高1cm左右的芽切下转接至生根培养基中培养。从高约1.5cm的无菌苗切取叶片作为转化用的外植体。
57.b.含有目标基因植物表达载体的工程菌种的制备
58.通过冻融法将pcambia1301载体(pcambia1301载体含有由camv 35s启动子驱动β-葡萄糖醛糖苷酶报告基因gus和潮霉素磷酸转移酶筛选基因hpt作为筛选基因，目标基因可根据育种目标需要置于camv 35s启动子后面，图1，本实施例以β-葡萄糖醛糖苷酶报告基因gus作为实验测试基因)导入根癌农杆菌eha105，然后接种在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的yep培养基中，28℃条件下培养24小时，通过离心收集菌液，将菌细胞悬浮在含有20mg/l乙酰丁香酮的ms培养基(ph5.2)中，od600＝0.4-0.5，由此得到含有pcambia1301载体的根癌农杆菌eha105菌液，命名为根癌农杆菌eha105/pcambia1301。
59.c.含有抗潮霉素再生植株的获得
60.将叶片外植体浸泡于根癌农杆菌eha105/pcambia1301菌液中，时间为25分钟，然后取出外植体，置于无菌纸上吸干多余的菌液，后将外植体移至共培养基，所述的共培养基为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、20mg/l乙酰丁香酮、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.5，置25
±
1℃，黑暗下培养3天。取出共培养后的外植体，用质量分数0.05％吐温80无菌水溶液冲洗5～6次，最后用500mg/l头孢霉素无菌水溶液冲洗一次，置外植体于无菌纸，吸干水，将外植体移至抗性芽诱导筛选培养基i，所述的抗性芽诱导筛选培养基i为ms培养基添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15mg/l潮霉素、500mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8。置24
±
1℃，光下培养21天。
61.将带有抗性芽的外植体转移至抗性芽诱导筛选培养基ii，所述的抗性芽诱导筛选培养基ii为ms培养添加1mg/l ba、0.1mg/l naa、15mg/l潮霉素和250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8。置24
±
1℃，光下培养21天(图2)。每21天更换新鲜抗性芽诱导筛选培养基ii，培养至抗性芽高为1cm时，转接到抗性芽生根培养基，所述的抗性芽生根培养基为1/2ms培养基添加25mg/l潮霉素、250mg/l头孢霉素、30g/l蔗糖和8g/l琼脂，ph5.8，置24
±
1℃，光下培养，可观察到抗性芽的伸长和不定根的产生。由此获得转pcambia1301的抗潮霉素再生植株(抗性植株)。
62.d.转基因植株的分子检测
63.由于pcambia1301含有gus报告基因，可按jefferson等(1987)的gus染方法进行染检测gus基因的表达情况。取与根癌农杆菌eha105/pcambia1301共培养3天之后的叶片外植体、抗性芽、未转化再生植株和转化抗性植株分别浸于x-gluc染液中，于37℃保温3-5小时，用70％乙醇脱，观察蓝着情况。可见与根癌农杆菌eha105/pcambia1301共培养3天之后的外植体(图3)表面有明显的蓝斑，说明根癌农杆菌eha105/pcambia1301能吸附浸染单座苣苔外植体，抗性芽(图4)和抗性植株(图5)也均呈现蓝，而未转化再生植株(图5)则没有呈现蓝，说明通过以上操作，gus基因已成功地导入了单座苣苔并在转化株中稳定表达。采用筛选基因hpt的特异性引物：hfw(5
’‑
cgatcttagccagacgagcgggttc-3’)和hre(5
’‑
gctggggcg tcggtttccactatcgg-3’)合成探针，通过southern杂交的方法，在抗性植株t1、t2、t3、t4、t5中均能观察到杂交信号，而且带型不一样(图6)，说明t1、t2、t3、t4、t5均为不同的转基因株系，而未转化株wt(野生型)没有信号，再次说明通过以上该方法，hpt基因已成功地导入了单座苣苔的基因组。
64.e.转基因再生植株的移栽
65.将高于2cm的非转基因株和转基因植株从培养瓶中移出，洗去根部培养基，定植在装有蛭石的盆中，用保鲜膜罩住，在保鲜膜上打些小孔，5天后揭开，存活率达100％。定植31天后，观察比较二者的生长情况，如图7e和f所示，转pcambia1301的抗潮霉素再生和未转化株的再生植株生长状况基本相同，说明所获得的转pcambia1301没有明显影响植物的生长和表型。
66.利用本实施例方法，从无菌苗切取叶片外植体进行根癌农杆菌浸染到获得可以移栽的转基因植株，整个操作过程为4个月。一次操作100个叶片外植体，平均可以获得大约11个株系的转基因株系，每个转基因叶片经6周培养可以产生20个以上的芽，再生植株的生根率为100％，转基因植株移栽到土壤的存活率达100％。
67.关于抗性芽诱导培养基中潮霉素筛选剂的浓度：
68.实施例2
69.本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用的抗性芽诱导筛选培养基i、ii中的潮霉素浓度为10mg/l，对应的筛选效果表1所示。
70.实施例3
71.本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用的抗性芽诱导筛选培养基i、ii中的潮霉素浓度为20mg/l，对应的筛选效果如表1所示。
72.实施例4
73.本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用的抗性芽诱导筛选培养基i、ii中的潮霉素浓度为30mg/l，对应的筛选效果如表1所示。
74.对比例1
75.本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体为茎切片(取茎宽约0.5cm的植株，横向切取约0.1cm茎薄片为外植体)，对应的筛选效果如表1所示。
76.对比例2
77.本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体为叶柄(横向切取长度约0.5cm的叶柄为外植体)，对应的筛选效果如表1所示。
78.分别按照实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、对比例1和对比例2的方法进行平行培养，培养时间42d，经统计，结果如表1所示。
79.表1不同浓度的潮霉素对叶片外植体芽诱芽的影响
80.分组潮霉素浓度(mg/l)样本量(外植体数量)42天后抗性芽产生率(％)实施例115750实施例210755.3实施例320750实施例430750对比例115200对比例215200
81.从表1可以看出，潮霉素剂量在15-30mg/l，经过42天的培养，均没有芽的产生，说明在抗性芽诱导筛选培养基i、ii中可以采用15mg/l潮霉素对叶片、茎、叶柄外植体进行转化的筛选。
82.关于农杆菌侵染时间：
83.实施例5
84.本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例在步骤c中外植体浸泡于根癌农杆菌eha105/pcambia1301菌液中的时间为15分钟，对应的获得抗性芽的效率如表2所示。
85.实施例6
86.本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：在步骤c中外植体浸泡于根癌农杆菌eha105/pcambia1301菌液中的时间为35分钟，对应的获得抗性芽的效率如表2所示。
87.对比例3
88.本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体为茎切片(取茎宽约0.5cm的植株，横向切取约0.1cm茎薄片为外植体)，对应的获得抗性芽的效率如表2所示。
89.对比例4
90.本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体为叶柄(横向切取长度约0.5cm的叶柄为外植体)，对应的获得抗性芽的效率如表2所示。
91.对比例5
92.本对比例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本对比例使用的外植体取材于培养在生长间蛭石中高10cm植株的由上往下数第3片叶子，消毒方法同实施例1步骤a中幼叶的消毒方法，对应的获得抗性芽的效率如表2所示。
93.分别按照实施例1、实施例5、实施例6、对比例3、对比例4和对比例5的方法进行平行培养，结果如表2所示。
94.表2不同农杆菌侵染时间对抗性芽产生率的影响
[0095][0096][0097]
从表2可以看出，农杆菌侵染时间25-35min，外植体gus瞬时表达的效率高于70％，抗性芽的产生率以实施例1、实施例6和对比例3最高，抗性芽gus阳性率以实施例1最高。对比例5，可能因为外植体来源于消毒后的叶片，外植体受损，影响农杆菌的吸附效果。综上，以组培无菌苗叶片、茎、叶柄，非组培苗的叶片作农杆菌侵染的外植体，均能得到转基因芽，其中，以组培苗的叶片获得的转化效率最高，因为单座苣苔的茎、叶柄极短，野外取材的外植体要经消毒，造成外植体损伤，而相对的组培苗叶片大，因此，以组培苗叶片为转化外植体效果最好。
[0098]
关于生根培养基中潮霉素筛选剂的浓度：
[0099]
实施例7
[0100]
本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用的抗性芽生根培养基中的潮霉素浓度为15mg/l，对应的获得生根的抗性植株的效率如表3所示。
[0101]
实施例8
[0102]
本实施例与实施例1的方法其余步骤均相同，不同仅在于：本实施例使用的抗性芽生根培养基中的潮霉素浓度为30mg/l，对应的获得生根的抗性植株的效率如表3所示。
[0103]
分别按照实施例1、实施例7、实施例8的方法进行平行培养，结果如表3所示。
[0104]
表3不同浓度的潮霉素对抗性芽生根的影响
[0105][0106]
从表3可以看出，生根培养基中潮霉素浓度25-30mg/l，能长出生根的抗性植株，
gus的阳性率100％，因此，在抗性芽生根培养基中潮霉素的筛选剂量为25mg/l，以确保获得的抗性植株均为阳性，减少分子检测的工作量。
[0107]
实施例9
[0108]
采用实施例1建立的单座苣苔转基因方法将来源于水稻的开花基因hd3a导入单座苣苔基因组，促进单座苣苔提早开花，实现利用该单座苣苔分子育种方法创制单座苣苔的早花新种质。
[0109]
本实施例与实施例1的方法步骤基本相同，不同在于：
[0110]
a.含有目标基因植物表达载体的工程菌种的制备：根癌农杆菌eha105/p1390ubihd3a菌液的制备
[0111]
以来源于水稻的开花基因hd3a为目的基因，我们通过以下方法构建了由来源于玉米的ubiquitin启动子驱动的hd3a的植物表达载体。采用hindiii和bamhi从质粒pahc27中切下ubiquitin启动子，将该片段插到质粒pcambia1390的hindiii和bamhi位点处，构建质粒p1390ubi。提取水稻叶片mrna，反转录为cdna，根据水稻hd3a基因(genebank登录号为：os06g0157700)的序列设计引物hd3afw：5
’‑
aatgaattc(ecori位点)atggccggaagtggcagggac-3和hd3are：5
’‑
aatgaattc(ecori位点)ctaggggtagaccctcctg-3’，从cdna中扩增hd3a片段，将该片段克隆至pgem-t载体，经测序验证后再将该片段插到质粒p1390ubi的ecori位点处，经酶切和测序验证，即获得构建好的质粒p1390ubihd3a，具体结构如图1中所示。该质粒还含有筛选标记基因hpt，可用于筛选转化的细胞。通过冻融法将p1390ubihd3a导入根癌农杆菌eha105，然后接种在含有50mg/l卡那霉素和50mg/l利福平的yep培养基中，28℃条件下培养24小时，通过离心收集菌液，将菌细胞悬浮在含有20mg/l乙酰丁香酮的ms培养基(ph5.2)中，od600＝0.4-0.5，由此得到含有p1390ubihd3a载体的根癌农杆菌eha105菌液，命名为根癌农杆菌eha105/p1390ubihd3a。
[0112]
b.转hd3a的再生植株的表型
[0113]
转hd3a植株表现为提早开花，图7a-d分别为转基因株移至生长间22天、40天、67天和90天时开花时的表型，而wt未转化株和转pcambia1301株在生长间培育1年均未见有开花(图7e-f)。
[0114]
c.转hd3a植株的分子检测
[0115]
采用hd3a的特异性引物hd3afw:5
’‑
atggccggaagtggcagggac-3’；hd3are:5
’‑
ctaggggtagaccctcctg-3’合成探针，通过southern杂交的方法，在提早开花的转hd3a植株a、b、c、d中均能观察到杂交信号，而且带型不一样(图8a)，说明a、b、c、d均为不同的转基因株系，而未转化株wt(野生型)没有信号，说明通过以上方法，hd3a基因已成功地导入了单座苣苔的基因组。northern杂交结果(图8b)表明，在转hd3a植株a、b、c、d中均能检测到hd3a表达的信号，而未转化株(wt)则没有hd3a的表达。证明hd3a基因的表达促进了转hd3a单座苣苔植株的提早开花。
[0116]
分别按照实施例1、实施例9的方法进行3次转化平行操作，转化效率结果如表4所示。
[0117]
表4不同批次转化效率的比较
[0118]
分组批次样本量(叶片外植体数量)pcr扩增hpt阳性率(％)实施例117311
实施例126914.5实施例137414.9实施例916615.2实施例928212.2实施例937911.4
[0119]
从表4可以看出，本发明建立的单座苣苔转基因方法，重复性好，转化频率均超过11％。
