半抗原、人工抗原和的检测方法
1.本发明涉及食品安全检测技术领域，具体地，涉及半抗原、人工抗原和的检测方法。
背景技术：
2.，作为拟除虫菊酯类杀虫剂的一种，是一类神经毒剂，由于其低毒和易生物降解等优良特性，该类杀虫剂于20世纪80年代得到大力发展。其主要作用途径为触杀和胃毒，原理是抑制生物体atp酶活性，对钠离子通道造成干扰，扰乱昆虫神经的正常生理，使之由兴奋、痉挛到麻痹而死亡。
3.随着有机磷、氨基甲酸酯类等高毒农药的禁用，该类农药具备了更广泛的使用空间，但同时也带来了环境污染和食品安全的问题。20世纪90年代以来,国内外大量检测结果表明,拟除虫菊酯类农药中和氟氯氰菊酯是蔬菜中残留出现频率和残留量最高的农药之一。现有研究证实，对水生动物毒性高，对某些益虫也有伤害，长期重复使用还易导致害虫产生抗药性。喷洒于蔬菜水果上的农药部分残留甚至被植物所吸收，人类食用会导致其进入人体并进一步富集。拟除虫菊酯类农药进入人体后会快速代谢，发生酯键断裂和氧化作用生成cis/trans-3-(2,2-二氯苯乙烯基)-2,2-二甲基环丙基-1-羧酸和3-苯氧基苯甲醇，3-苯氧基苯甲醇进一步氧化成3-苯氧基苯甲酸(3-phenoxybenzoic acid,3-pba)。根据gb 2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》，的最大残留限量为0.01-5mg/kg。可见拟除虫菊酯类杀虫剂对多种生物体构成的潜在健康风险不容忽视，发展更为先进、有效、灵敏的农残检测技术就显得尤为重要。
4.目前，的检测方法较少，传统检测方法有气相谱法(gc)、高效液相谱法(hplc)，气相谱和质谱联用技术(gc-ms/ms)等。仪器检测技术虽具有较好的准确性，但所需要的仪器昂贵，样品前处理复杂，且检测时间长，不能满足现场检测的要求。酶联免疫分析技术具有灵敏度高、快速、高通量等优点，被广泛应用于农药残留的检测。瞿建宏等制备了的多克隆抗体，建立了水产品中该农药残留的elisa检测方法，检出限为20μg/kg(瞿建宏，马晓燕，刘洪波，等.水产品中残留的elisa快速检测[j].安全与环境学报.2007(04):1-5.)。该多抗虽有较好的灵敏度，但与单克隆抗体相比其亲和力及稳定性较差，抗体效果受免疫动物影响较大且无法大量制备。罗香文等同样制备了的多克隆抗体，获得了更高灵敏度，elisa方法检出限为8.5μg/l(罗香文，张德咏，刘勇，等.多克隆抗体的制备[j].农药.2009,48(12):872-874.)，但该抗体暴露出特异性较差的缺点，与氰戊菊酯有15％以上的交叉率。
[0005]
为进一步完善我国食品安全监测体系，满足农药残留现场快速检测的需求，胶体金试纸条检测技术越来越受到青睐。胡静等建立了菊酯类农药的广谱型免疫层析检测方法，对的最低检出限为0.5μg/ml(胡静，郭逸蓉，梁晓，等.菊酯类农药广谱型免疫层析试纸条的研究及应用[j].分析化学.2016,44(12):1900-1906)梁科等评价了广州达元绿洲所研发的胶体金试纸条，其最低检出限为2mg/kg(梁科，黄紫茵，叶秋雄，等.
胶体金法快速检测茶叶中农药残留[j].食品安全导刊.2021(30):54-55.)。
[0006]
目前，关于的胶体金试纸条研究报道较少，且灵敏度较差，因此，需制备一种针对的特异性单克隆抗体，发明的灵敏、快速、简便的检测方法。
技术实现要素：
[0007]
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供半抗原、人工抗原和的检测方法。
[0008]
本发明的第一个目的是提供一种半抗原。
[0009]
本发明的第二个目的是提供另一种半抗原。
[0010]
本发明的第三个目的是提供一种半抗原。
[0011]
本发明的第四个目的是提供另一种半抗原。
[0012]
本发明的第五个目的是提供所述半抗原在制备人工抗原中的应用。
[0013]
本发明的第六个目的是提供一种用于检测的组合物
[0014]
本发明的第七个目的是提供所述的半抗原、所述的人工抗原在、或所述组合物在制备检测试剂盒中的应用。
[0015]
本发明的第八个目的是提供一种的检测试剂盒。
[0016]
本发明的第九个目的是提供一种非疾病诊断目的的的检测方法。
[0017]
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
[0018]
一种半抗原(半抗原1)，其特征在于，其结构式如式(i)所示，
[0019][0020]
采用系统命名法命名为(z)-3-(3-((氰基(3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基环丙基)-2-甲基丙烯酸。
[0021]
其制备方法，包括如下步骤：
[0022]
(1)将高效氯氰菊酯溶于二氯甲烷并转移至冷阱中，在-78℃下通入预干燥并预冷却的臭氧，反应完成后通入预干燥并预冷却的氮气，加入二甲硫醚，-78℃通氮气鼓泡反应后取出，蒸干溶剂过柱纯化得无油状中间体1，
[0023][0024]
(2)称取(叔丁氧羰基亚甲基)三苯基膦烷，用二氯甲烷溶解，冰水浴下滴加，滴加完成后室温反应过夜。反应完成后加饱和碳酸氢钠萃取，有机相干燥旋干，
[0025][0026]
(3)取中间体1再加入甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯，用绝干四氢呋喃溶解。室温搅拌反应5h。反应完成后加适量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，蒸干后过柱纯化，得到无油状中间体2，
[0027][0028]
(4)取中间体2溶于二氯甲烷中，再加入三氟乙酸。室温搅拌反应2h。反应完成后旋蒸除去溶剂，加乙酸乙酯，用柠檬酸-柠檬酸钠饱和溶液洗涤两次，再用水洗涤两次，最后用饱和食盐水洗涤一次，有机相干燥后旋干,得无油状物，
[0029][0030]
一种人工抗原(人工抗原1)，为所述构式如式(i)所示半抗原(半抗原1)偶联载体蛋白，其结构式如式(iii)所示，
[0031][0032]
优选地，所述载体蛋白为乳铁蛋白(lf)、牛血清白蛋白(bsa)、卵清白蛋白(ova)、或血蓝蛋白(klh)中的一种或几种
[0033]
其制备方法包括如下步骤：
[0034]
将载体蛋白溶于bb缓冲溶液(硼酸缓冲液)中得载体蛋白溶液；将结构式如式(i)所示半抗原溶于dmf(n,n-二甲基甲酰胺)中，加入edc(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基))和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)室温避光搅拌反应过夜，得结构式如式(i)所示半抗原活化液；将结构式如式(i)所示半抗原活化液缓慢滴加入溶解有载体蛋白的溶液中，搅拌均匀，室温避光偶联4h；偶联混合物低温下透析3天，得到结构式如式(iii)所示人工抗原。
[0035]
优选地，所述结构式如式(i)所示半抗原与载体蛋白的摩尔比为1:125。
[0036]
优选地，所述结构式如式(iii)所示人工抗原1的制备方法，包括如下步骤：
[0037]
(1)将16mg载体蛋白溶解于1.6ml的bb缓冲液(0.1m ph＝9.0)中，得载体蛋白溶液，并加入0.5ml dmf；
[0038]
(2)取16.2mg的结构式如式(i)所示半抗原溶解于0.5ml dmf溶液中，得结构式如式(i)所示半抗原溶液；
[0039]
(3)将12mg的edc和10mg的nhs加入到步骤(2)的结构式如式(i)所示半抗原溶液中，室温反应过夜，得活化液；
[0040]
(4)取步骤(3)活化液150μl缓慢滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，室温避光偶联4h；偶联混合物于4℃、pbs缓冲液透析3天，得到结构式如式(iii)所示人工抗原。
[0041]
一种半抗原(半抗原2)，其结构式如式(ⅱ)所示，
[0042][0043]
其采用系统命名法命名为3-((氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基环丙烷-1-羧酸。
[0044]
其制备方法，包括如下步骤：
[0045]
用混合液体积比为ch3cn:ccl4:h2o＝10:10:15的溶剂溶解氟氯氰菊酯，加入高碘酸钠，三氯化钌，升温至60℃，反应1.5h。旋蒸溶剂，萃取，饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥，过滤，过柱纯化得黑油状物。
[0046]
一种人工抗原(人工抗原2)，为所述结构式如式(ii)所示的半抗原偶联载体蛋白，其结构式如式(iv)所示，
[0047][0048]
结构式如式(iv)所示人工抗原制备方法，包括如下步骤：
[0049]
将载体蛋白溶于cb缓冲溶液(碳酸缓冲溶液)中得载体蛋白溶液；将结构式如式(ii)所示的半抗原溶于dmf中，加入edc和nhs室温避光搅拌反应4h，得结构式如式(ii)所示的半抗原活化液；将结构式如式(ii)所示的半抗原活化液缓慢滴加入溶解有载体蛋白的溶液中，搅拌均匀，室温避光偶联过夜；偶联混合物低温下透析三天，得到结构式如式(iv)所示人工抗原。
[0050]
优选地，所述半抗原2与载体蛋白的摩尔比为1：30。
[0051]
优选地，所述结构式如式(iv)所示人工抗原的制备方法，包括如下步骤：
[0052]
(1)将50mg载体蛋白溶解于5ml的cb缓冲液中(0.01m ph＝9.8)，得载体蛋白溶液；
[0053]
(2)取8.72mg的半抗原2溶解于0.5ml dmf溶液中，得结构式如式(ii)所示的半抗原溶液；
[0054]
(3)将6.75mg的edc和4mg的nhs加入到步骤(2)的结构式如式(ii)所示的半抗原溶液中，室温反应4h，得活化液；
[0055]
(4)取步骤(3)活化液滴加到步骤(1)的载体蛋白溶液中，室温避光偶联过夜；偶联混合物于4℃、pbs缓冲液透析3天，得到结构式如式(iv)所示人工抗原。
[0056]
以上所述半抗原中的一个或几个在制备人工抗原中的应用，也属于本发明的保护范围。
[0057]
本发明还要求保护一种用于检测的组合物，含有所述的结构式如式(iii)所示人工抗原和结构式如式(iv)所示人工抗原，所述的结构式如式(iii)所示人工抗原作为免疫原，所述的结构式如式(iv)所示人工抗原作为包被原。
[0058]
优选地，所述的结构式如式(iii)所示人工抗原的载体蛋白为乳铁蛋白作为免疫原，所述的结构式如式(iv)所示人工抗原的载体蛋白为牛血清白蛋白作为包被原。
[0059]
以上所述的半抗原、以上所述的人工抗原在、或所述组合物在制备检测试剂盒中的应用，也属于本发明的保护范围。
[0060]
本发明还要求保护一种的检测试剂盒，含有所述组合物。
[0061]
本发明还要求保护一种非疾病诊断目的的的检测方法，利用所述组合物。
[0062]
优选地，所述的结构式如式(iv)所示的，载体蛋白为牛血清白蛋白的人工抗原作为包被原，结构式如式(iii)所示的，载体蛋白为乳铁蛋白的人工抗原，作为免疫原免疫动物制备得到的抗体为检测抗体进行检测。
[0063]
优选地，包被浓度为4μg/ml，抗体稀释倍数为16000倍。
[0064]
所述免疫分析方法包括但不局限于酶免疫分析、免疫层析、免疫传感、或免疫胶体金等中的一种或几种。
[0065]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0066]
本发明制备得到了结构式如式(i)所示半抗原，其偶联载体蛋白结构式如式(iii)所示得到人工抗原；制备得到了结构式如式(ii)所示半抗原，其偶联载体蛋白结构式如式(iv)所示得到人工抗原，并进一步制备得到用于检测的特异性抗体，应用结构式如式(iii)所示得到人工抗原作为包被原，结构式如式(iv)所示得到人工抗原作为人工包被原，该抗体对具有良好的灵敏度，半抑制浓度为42.92ng/ml，最低检测限为15.11ng/ml。对常见菊酯类农药的交叉反应率均低于1％，说明该抗体对具有良好的特异性，可有效的排除其他菊酯类药物的干扰，为建立的免疫检测方法提供了核心试剂。利用本发明的半抗原、人工抗原、抗体实现了快速准确检测相关样品中的目的。
附图说明
[0067]
图1为本技术实施例1的半抗原1的合成路线图。
[0068]
图2为本技术实施例1的半抗原1的质谱鉴定图。
[0069]
图3为本技术实施例2的半抗原1、人工抗原1(半抗原1-lf)、lf紫外扫描图。
[0070]
图4为本技术实施例3的半抗原1、人工抗原2(半抗原1-bsa)、bsa紫外扫描图。
[0071]
图5为本技术实施例4的半抗原2的合成路线图。
[0072]
图6为本技术实施例4的半抗原2的质谱鉴定图。
[0073]
图7为本技术实施例5的半抗原2、人工抗原3(半抗原2-bsa)、bsa紫外扫描图。
[0074]
图8为本技术实施例6以人工抗原1(半抗原1-lf)为免疫原所制备的抗体对的抑制曲线。
具体实施方式
[0075]
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
[0076]
实施例1半抗原1的合成与鉴定
[0077]
一、实验方法
[0078]
1、半抗原1的合成
[0079]
称取(5.00g，2.011mmol)高效氯氰菊酯(cas：65731-84-2)，用40ml二氯甲烷溶解后转移至冷阱中，在-78℃下通入预干燥并预冷却的臭氧反应5h。反应完成后通入预干燥并预冷却的氮气15min(提供惰性气体环境保护，防止副反应发生)，再加入3.73g(60.053mmol 4.41ml)二甲硫醚，-78℃通氮气鼓泡反应30min后取出(保证液体处于惰性环境中)，蒸干溶剂，使用300～400目硅胶柱纯化得无油状物即中间体1(臭氧不可由空气制备必须使用纯氧制备)。
[0080]
称取3.76g(9.988mmol)(叔丁氧羰基亚甲基)三苯基膦烷，用30ml二氯甲烷溶解，得到(叔丁氧羰基亚甲基)三苯基膦烷的二氯甲烷溶液。冰水浴下，向(叔丁氧羰基亚甲基)三苯基膦烷的二氯甲烷溶液滴加(1.56g 10.987mmol)，滴加完成后室温反应过夜。反应完成后加饱和碳酸氢钠萃取，将有机相进行旋蒸，得到甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯。
[0081]
取(1.243g，3.558mmol)中间体1再加入(2.08g，5.336mmol)甲基化三苯基磷乙酸叔丁酯，用无水四氢呋喃20ml溶解。室温搅拌反应5h。反应完成后加适量水用乙酸乙酯萃取2～3遍，合并有机相，将有将有机相进行旋蒸，蒸干后过柱纯化，得到无油状物即中间体2。
[0082]
取(1.296g，2.808mmol)中间体2溶于10ml二氯甲烷中，再加入5ml三氟乙酸，室温搅拌反应2h。反应完成后旋蒸除去溶剂(二氯甲烷和三氟乙酸)，加乙酸乙酯，用柠檬酸-柠檬酸钠饱和溶液(0.1m ph＝6.0的柠檬酸缓冲盐，由0.1m柠檬酸和0.1m柠檬酸三钠
混合配制)洗涤两次，再用水洗涤两次，最后用饱和食盐水洗涤一次，有机相干燥后旋干，得无油状物。
[0083]
2、半抗原1的鉴定
[0084]
对半抗原1进行质谱及核磁氢谱分析，以确定其分子量及结构特征。
[0085]
二、实验结果
[0086]
半抗原1的核磁结果：1h nmr(600mhz,dmso)δ12.23(s,3h),7.52(d,j＝8.0hz,3h),7.43(t,j＝8.0hz,7h),7.35(s,2h),7.20(s,3h),7.19(d,j＝17.3hz,6h),7.18(s,3h),7.14
–
7.08(m,3h),7.07(dd,j＝8.3,7.3hz,6h),7.11
–
7.02(m,6h),7.01(dd,j＝8.9,7.8hz,2h),6.72(d,j＝7.0hz,2h),6.69
–
6.49(m,1h),5.76(s,4h),5.76(s,3h),2.32
–
2.20(m,2h),2.15(dd,j＝4.6,1.9hz,5h),2.15(dd,j＝4.6,1.9hz,3h),1.82(dd,j＝7.7,1.1hz,6h),1.82(dd,j＝7.7,1.1hz,6h),1.18(dt,j＝9.0,3.6hz,21h),1.22
–
1.11(m,25h).
[0087]
半抗原1的esi-ms鉴定结果：如图2所示，该半抗原1的ms：c
24h23
no5：405.45，esi-[m-h]-：404.10。
[0088]
半抗原1的结构式如式(i)所示：
[0089][0090]
半抗原1采用系统命名法命名为(z)-3-(3-((氰基(3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基环丙基)-2-甲基丙烯酸。
[0091]
实施例2人工抗原1的合成与鉴定
[0092]
一、实验方法
[0093]
1、人工抗原1的合成
[0094]
利用实施例1制备得到的半抗原1，通过活泼酯法偶联乳铁蛋白(lf)制备人工抗原1，其方法具体如下：
[0095]
取16.2mg实施例1制得的半抗原1溶于0.5ml dmf溶液中，搅拌加入12mg edc和10mg nhs，室温避光搅拌反应过夜，得半抗原1活化液；取16mg lf溶解于1.6ml ph＝9.0的bb缓冲液中后，搅拌加入150μl半抗原1活化液，搅拌均匀后，室温避光偶联4h，得到偶联混合物；偶联混合物于4℃下用pbs缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得到的人工抗原1(半抗原1-lf)，人工抗原1以1mg/ml的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
[0096]
2、人工抗原1的鉴定
[0097]
对载体蛋白乳铁蛋白(lf)、半抗原1及人工抗原1进行紫外扫描测定(190～400nm)。
[0098]
二、实验结果
[0099]
测定结果如图3所示，从图3可以看出完全抗原的紫外特征吸收峰相对于半抗原和载体蛋白都有不同程度的偏移，且发现人工抗原1同时具备半抗原和lf的特征吸收峰，说明半抗原1与lf偶联成功，成功制备得到人工抗原1，其结构式如式(iii)，其中protein为lf。
[0100][0101]
实施例3人工抗原2的合成与鉴定
[0102]
一、实验方法
[0103]
1、人工抗原2的合成
[0104]
利用实施例1制备得到的半抗原1，通过活泼酯法偶联牛血清白蛋白(bsa)制备人工抗原2，其方法具体如下：
[0105]
取16.2mg实施例1制得的半抗原1溶于0.5ml dmf溶液中，搅拌加入12mg edc和10mg nhs，室温避光搅拌反应过夜，得半抗原1活化液；取24mg bsa溶解于2.4ml ph＝9.0的bb缓冲液中后，搅拌加入225μl半抗原1活化液，搅拌均匀后，室温避光偶联4h，得到偶联混合物；偶联混合物于4℃下用pbs缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得到的人工抗原2(半抗原1-bsa)，人工抗原2以1mg/ml的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
[0106]
2、人工抗原2的鉴定
[0107]
对载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)、半抗原1及人工抗原2进行紫外扫描测定(190～400nm)。
[0108]
二、实验结果
[0109]
测定结果如图4所示，从图4可以看出完全抗原的紫外特征吸收峰相对于半抗原和载体蛋白都有不同程度的偏移，且发现人工抗原2同时具备半抗原和bsa的特征吸收峰，说明半抗原1与bsa偶联成功，成功制备得到人工抗原2，其结构式如上式(iii)，其中protein为bsa，
[0110][0111]
实施例4半抗原2的合成与鉴定
[0112]
一、实验方法
[0113]
1、半抗原2的合成
[0114]
用体积比为ch3cn:ccl4:h2o＝10:10:15的混合液作为溶剂，溶解氟氯氰菊酯，加入高碘酸钠，三氯化钌，升温至60℃，反应1.5h。旋蒸溶剂，加入水、乙酸乙酯多次萃取，保留有机相。用饱和食盐水洗涤，加入无水硫酸钠干燥，过滤，用300～400目硅胶柱过柱纯化得黑油状物。
[0115]
2、半抗原2的鉴定
[0116]
对半抗原2进行质谱及核磁氢谱分析，以确定其分子量及结构特征。
[0117]
二、实验结果
[0118]
半抗原2的核磁结果：1h nmr(600mhz,meod)δ7.60
–
7.30(m,1h),7.19(ddd,j＝16.3,8.2,1.8hz,0h),7.08
–
6.86(m,0h),6.54(d,j＝30.6hz,0h),2.14(dt,j＝103.3,7.6hz,0h),1.47
–
1.03(m,6h).
[0119]
半抗原2的esi-ms鉴定结果：如图6所示，该半抗原2的ms：c
21h18
fno5：383.38，esi-[m-h]-:：382.0。
[0120]
半抗原2的结构式如式(ⅱ)所示：
[0121][0122]
半抗原2采用系统命名法命名为3-((氰基(4-氟-3-苯氧基苯基)甲氧基)羰基)-2,2-二甲基环丙烷-1-羧酸。
[0123]
实施例5人工抗原3的合成和鉴定
[0124]
利用实施例4制备得到的半抗原2，通过活泼酯法偶联牛血清白蛋白(bsa)制备人工抗原3，其方法具体如下：
[0125]
取8.72mg实施例4制得的半抗原2溶于0.5ml dmf溶液中，搅拌加入6.75mg edc和4mg nhs，室温避光搅拌反应4h，得半抗原2活化液；取50mg bsa溶解于5ml的cb缓冲液中，搅拌缓慢滴加半抗原2活化液，搅拌均匀后，室温避光偶联过夜，得到偶联混合物；偶联混合物于4℃下用pbs缓冲溶液透析3天，每天更换透析液2次，得到的人工抗原3(半抗原2-bsa)，人工抗原3以1mg/ml的浓度分装，冻存于-20℃冰箱。
[0126]
对载体蛋白牛血清白蛋白(bsa)、半抗原2及人工抗原3进行紫外吸收峰扫描测定(190～400nm)，测定结果如图7所示，半抗原2紫外峰值略低，这是由于其溶解稀释后浓度偏低导致，但通过对比发现，完全抗原3的紫外特征吸收峰相对于半抗原2和载体蛋白bsa都有不同程度的偏移，且发现人工抗原3同时具备半抗原2和bsa的特征吸收峰，说明半抗原2和bsa偶联成功，成功制备得到人工抗原3，其结构式如式(iv)，其中protein为bsa，
[0127][0128]
实施例6抗体的制备及鉴定
[0129]
1、小鼠的免疫：取250μl实施例2制备并稀释为1mg/ml的人工抗原1(半抗原1-lf)与等量的免疫佐剂(第一次免疫用弗氏完全佐剂，以后加强免疫均用弗氏不完全佐剂)乳化均匀，免疫动物。将6～7周大的bal b/c小鼠分别采用背部皮下、各部位皮下、腹腔和脚部多种注射方式免疫，免疫计量为100μl/只，2周后第二次免疫，以后每间隔2周加强免疫一次。第三次加强免疫1周后小鼠尾部取血，并利用间接竞争elisa测定血清效价。当效价不再上升时，取100μl浓度为1mg/ml人工抗原1腹腔注射冲击免疫。
[0130]
2、细胞融合：在冲击免疫三天后，使用peg(聚乙二醇)进行细胞融合，具体步骤如下：
[0131]
a、收集小鼠脾细胞：颈椎脱臼法处死小鼠，立即放入75％酒精中浸泡杀菌，无菌操作取出小鼠的脾脏放入200目细胞筛网中，用无菌注射器的胶头适度研磨，用基础培养基冲洗得到脾细胞悬液，收集，离心(1000rpm，7min)，基础培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
[0132]
b、收集sp2/0细胞：融合前7-10天，将sp2/0骨髓瘤细胞用完全培养基在5％co2培养箱中培养。融合前要求sp2/0瘤细胞数量达到1～4
×
107，保证融合前sp2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集骨髓瘤细胞，悬浮于基础培养基中，进行细胞计数；
[0133]
c、按照脾细胞：sp2/0＝5：1的比例混合两种细胞，离心，弃上清，得沉积在离心管底部的混合细胞；
[0134]
d、融合：第一分钟，向离心管底部细胞缓缓滴加1ml peg；第二分钟，保持离心管匀速摇动；第三分钟，滴加1ml预热好的基础培养基；第四分钟，滴加3ml预热好的基础培养基；第五分钟，滴加8ml预热好的基础培养基；第六分钟，滴加8ml预热好的基础培养基；离心(1000rpm，7min)，弃上清，重悬入含hat筛选培养液中，按照200μl/孔加到96孔细胞板，置于37℃，5％co2培养箱中培养。
[0135]
3、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第5天用ht培养基对融合细胞进行半换液，第8天进行全换液，在第10天取细胞上清，通过ic-elisa进行筛选，对阳性细胞进行效价抑制效果测定。选择对标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复4～5次，获得细胞株c5b6。
[0136]
4、单克隆抗体的制备与鉴定：取10周龄以上的bal b/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射液体石蜡500μl；7天后每只小鼠腹腔注射约1
×
106杂交瘤细胞，再过7天待小鼠腹部肿胀收集腹水，将收集到的腹水通过层析柱法纯化。使用1ml protein g填料装柱，加入经pbs缓冲液稀释后的腹水50ml，将流穿液反复上样7～8次，之后用甘氨酸洗脱，用tris-hcl将洗脱液及时调至中性。透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体c5b6，分装后置于-20℃保存。
[0137]
5、利用间接竞争elisa测定抗体的效价和抑制率，具体方法为：
[0138]
(1)包被：用包被液稀释包被原到1μg/ml，100μl/孔，37℃水浴中包被过夜；
[0139]
(2)封闭：弃去包被液，洗板2次，吸水纸上拍干，每孔加120μl封闭液，37℃水浴孵育封闭3h。甩干，37℃烘箱倒置1h烘干；
[0140]
(3)加抗体及药物：单克隆抗体c5b6用pbs稀释1k(1000)、2k、4k、8k、16k、32k、64k等倍数，标准品用pbs稀释至100ng/ml，备用。
[0141]
效价列：每孔先加入50μl pbs缓冲液，后将倍比稀释好的单克隆抗体c5b6按50μl/孔依次加入孔内，最后一个孔加pbs作空白对照；
[0142]
抑制列：每孔先加入50μl经pbs缓冲液稀释的药物，后将经梯度稀释的抗体50μl/孔依次加入孔内，最后一个孔加pbs作空白对照；
[0143]
37℃温育40min，洗板5次；
[0144]
(4)加二抗：加入经pbst缓冲液稀释5000倍的羊抗鼠二抗(100μl/孔)，温育37℃30min，洗板5次；
[0145]
(5)显：tmb底物缓冲液a、b液等体积混合得到底物液，加入底物液(100μl/孔)，37℃孵育10min；
[0146]
(6)终止：在酶标板上加入10％h2so4的终止液(50μl/孔)终止反应；
[0147]
(7)读数：在波长450nm条件下用酶标仪读取吸光值(od)。选择吸光度值在1.0～1.5区间内的抗体稀释倍数为抗体效价，抗体的药物识别性能由其抑制率得出。抑制率的计算方式如式1所示。抗体效价和结果如表1所示。
[0148][0149]
表1不同包被原组合的抗血清效价和抑制率
[0150][0151]
从表1可知，同源包被表现出较高效价为45k，但相应抑制率较低，仅为21％。而使用异源包被后，抗体效价为8k，此时抑制率显著提升为79％，因此可以通过使用异源包被的方式提高检测方法的灵敏度。同时，还可以通过进一步浓缩抗体或者提高包被浓度的方式解决抗体效价较低的缺陷。
[0152]
实施例7包被浓度与抗体稀释倍数对ic
50
的影响
[0153]
一、实验方法
[0154]
在检测免疫分析方法中，使用棋盘检测法检测包被浓度与单克隆抗体浓度对检测的影响。
[0155]
以实施例5制备的人工抗原3(半抗原2-bsa)作为包被原，以实施例6制得的抗体(单克隆抗体c5b6)为抗体。
[0156]
分别用浓度为8、6、4、2、1μg/ml的包被原在96孔酶标板上包被；将抗体分别稀释
1000、2000、4000、8000、16000、32000、64000倍，标准品配制成浓度为100ng/ml的溶液；将50μl经系列梯度稀释的抗体(实施例6制得的单克隆抗体c5b6)和50μl 100ng/ml的标准品加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标仪读出吸光值在1.0～1.5的抗体浓度及包被浓度组合。
[0157]
二、实验结果
[0158]
以药物浓度为横坐标，b/b0为纵坐标，采用归一法绘制标准曲线，根据标准曲线计算半数抑制浓度ic
50
并选取最大吸光度a
max
，取ic
50
值最小，a
max
/ic
50
值最大为最佳工作浓度。该抗体(单克隆抗体c5b6)的最佳包被浓度为4μg/ml，抗体稀释倍数为16k。
[0159]
实施例8一种检测的方法
[0160]
一种检测的间接竞争elisa方法，包括以下步骤：
[0161]
(1)将实施例5制备的人工抗原3(半抗原2-bsa，其结构式如式(iv)，其中protein为bsa)作为包被原，用碳酸盐缓冲液(cb，0.1m ph＝9.8)稀释至4μg/ml，包被96孔酶标板，每孔加入100μl，37℃孵育过夜(12h)，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存
[0162][0163]
(2)弃去包被液，洗涤两次，拍干；
[0164]
(3)每孔加入120μl封闭液(即质量比5％脱脂奶粉)，37℃封闭3h；
[0165]
(4)弃去封闭液，拍板，37℃烘干30min后取出，用自封袋装好备用；
[0166]
(5)用磷酸盐缓冲液(pbs，0.01m，ph＝7.4)1：16000倍稀释实施例6制备的单克隆抗体，并将待检测药物2倍梯度稀释至2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.8125ng/ml、3.90625ng/ml、1.953125ng/ml；
[0167]
(6)每行加入50μl待检测药物稀释液(三组平行)，再加入50μl/孔实施例6制备的单克隆抗体稀释液，37℃孵育40min，洗涤五次，拍干；
[0168]
(7)加入经磷酸吐温缓冲液(pbst，0.01m)5000倍稀释后的羊抗鼠二抗-hrp，100μl/孔，37℃孵育30min，洗涤五次，拍干；
[0169]
(8)加入显液，每孔100μl，显10min；
[0170]
(9)加入50μl 10％的h2so4溶液终止反应，并在450nm处读取od值。
[0171]
(10)按上述步骤(1)到(9)进行操作，将步骤(6)中待测稀释液替换成经过提取的待测样品稀释液，结合所绘制的标曲，即可测定未知样品中实际药物的含量。
[0172]
二、实验结果
[0173]
用于检测药物的抗体间接竞争elisa标准曲线如图8所示，从图8可知用于检测药物的抗体半抑制浓度(ic
50
)为42.92ng/ml，定量检测范围为21.63～91.36ng/ml，最低检测限(lod)为15.11ng/ml；说明本发明制备得到的用于检测的抗体灵敏度高，可以满足检测要求。
[0174]
实施例9一种检测的试剂盒
[0175]
一、组成
[0176]
检测的试剂盒，包含下述各部分：
[0177]
(1)包被有包被原的酶标板的制备：将实施例5制备的人工抗原3(半抗原2-bsa，其结构式如式(iv)，其中protein为bsa)作为包被原，用碳酸盐缓冲液(cb，0.1m ph＝9.8)将包被原稀释成4μg/ml，每孔加入100μl，37℃避光孵育过夜，倾去孔中液体，用洗涤液洗涤2次，每次30s，拍干，然后在每孔中加入200μl封闭液，37℃避光孵育2h，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密封保存；其中，包被缓冲液为ph值为9.6的0.05mol/l的碳酸盐缓冲液，封闭液为ph值为7.1～7.5，含有质量比1％～3％酪蛋白和0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液；
[0178]
(2)标准品溶液：8个浓度梯度，分别为25000μg/l，5000μg/l，1000μg/l，200μg/l，40μg/l，8μg/l，1.6μg/l，0.32μg/l；
[0179]
(3)实施例6制备的单克隆抗体(单克隆抗体c5b6)；
[0180]
(4)酶结合物：辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗；
[0181]
(5)底物显液：由a液和b液组成，a液为过氧化脲，b液为四甲基联苯胺；
[0182]
(6)终止液为体积分数为10％h2so4；
[0183]
(7)洗涤液为ph值为7.4，含有0.5％～1.0％吐温-20、0.01
‰
～0.03
‰
叠氮化钠防腐剂、0.1～0.3mol/l的磷酸盐缓冲液，所述百分比为重量体积百分比。
[0184]
二、使用方法
[0185]
同实施例8。
[0186]
实施例10对及其他常见菊酯类农药检测的灵敏度
[0187]
一、实验方法
[0188]
使用实施例9的试剂盒，将50μl系列浓度的标准品和50μl稀释16k的实施例6制备得到的抗体加入96孔酶标板中，竞争反应后通过酶标仪分析仪测定吸光值(od)。
[0189]
二、实验结果
[0190]
以b/b0为纵坐标，相应的标准品浓度为横坐标，采用归一法绘制标准曲线半数抑制量浓度为ic
50
，以ic
10
为检测限，以ic
20
～ic
80
为检测范围。以为标准品建立elisa的标准曲线，结果如图8，相关标准曲线参数见表2。
[0191]
表2抗体对的检测参数
[0192][0193]
结合图8和表2可知，以为标准品建立的标准曲线具备典型的s型曲线，说
明利用本发明的抗体进行检测灵敏度良好。
[0194]
实施例11对对及其他常见菊酯类农药检测的特异性
[0195]
一、实验方法
[0196]
使用实施例9的试剂盒，对及其他常见菊酯类农药进行检测。
[0197]
二、实验结果
[0198]
结果如表3。交叉反应率的计算方式如式2所示。
[0199][0200]
表3：
[0201]
[0202][0203]
由表3可知，以抗体对的交叉反应率为100％，ic
50
值为42.92ng/ml，对其他菊酯类农药的交叉反应率均低于1％，说明本技术的抗体可特异性识别，进一步检测的含量。
[0204]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
技术特征：
1.一种半抗原，其特征在于，其结构式如式(i)所示，2.一种人工抗原，其特征在于，为权利要求1所述半抗原偶联载体蛋白，其结构式如式(iii)所示，3.一种半抗原，其特征在于，其结构式如式(ⅱ)所示，4.一种人工抗原，其特征在于，为权利要求3所述半抗原偶联载体蛋白，其结构式如式(iv)所示，5.权利要求1和/或3所述半抗原在制备人工抗原中的应用。6.一种用于检测的组合物，其特征在于，含有权利要求2和4所述的人工抗原，权利要求2所述的人工抗原作为免疫原，权利要求4所述的人工抗原作为包被原。7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，权利要求2所述的人工抗原载
体蛋白为乳铁蛋白作为免疫原，权利要求4所述的人工抗原载体蛋白为牛血清白蛋白作为包被原。8.权利要求1和/或3所述的半抗原、权利要求2和/或3所述的人工抗原在、或权利要求6所述组合物在制备检测试剂盒中的应用。9.一种的检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求6所述组合物。10.一种非疾病诊断目的的的检测方法，其特征在于，利用权利要求6所述组合物。
技术总结
本发明公开了半抗原、人工抗原和的检测方法，所述检测方法对具有良好的灵敏度，半抑制浓度为42.92ng/mL，最低检测限为15.11ng/mL。对常见菊酯类农药的交叉反应率均低于1％，具有良好的特异性，可有效的排除其他菊酯类药物的干扰。利用本发明的半抗原和人工抗原实现了快速准确检测相关样品中的目的。测相关样品中的目的。测相关样品中的目的。
