一种多核苷酸、试剂盒、等温检测方法及预测早产的方法与流程
1.本发明涉及生物技术及医学领域，具体涉及一种多核苷酸、试剂盒、等温检测方法及预测早产的方法。
背景技术：
2.早产定义为胎龄小于37周分娩，世界范围内，早产的发生率约为10％，每年约有1500万产妇发生早产，在中国，早产约占所有新生儿的7.3％。早产可导致新生儿多种并发症，是导致新生儿死亡最常见的原因之一，带来了沉重的家庭开销与社会医疗负担，但目前对早产的病因与发病机制并不清晰，缺乏对早产的针对性和有效的预防与措施，以及有效的、安全的孕早期的筛查手段。
3.传统的早产筛查方法包括宫颈长度、胎儿纤连蛋白、白介素、胰岛素样生长因子结合蛋白1等。孕24周使用宫颈长度小于25mm预测早产风险灵敏度约为37.3％，特异度为92.2％。胎儿纤连蛋白为由胎儿羊膜细胞与滋养层细胞分泌的蛋白，可在22周之前在子宫阴道分泌物中发现胎儿纤连蛋白，而其在24到34周出现表明有早产风险，其灵敏度与特异度在产妇有早产相关临床表现时较高，对无症状的自发性早产预测效果较差，对无症状孕周小于34周的早产，roc曲线下面积为0.61。胰岛素样生长因子结合蛋白1在胎盘的生长与发育过程中发挥重要作用，而发育的异常则可能导致该蛋白被分泌到宫颈液中，为早期诊断提供可能，通过在24～34周检测宫颈粘液中的胰岛素样生长因子结合蛋白1可预测早产，对无症状产妇预测灵敏度约在14～47％，特异性约在76～93％，对有临床表现的早产孕妇预测灵敏度约60-68％,特异度约为77～81％。炎性因子与前列腺素的合成有关，其中白介素6(il-6)在宫颈液的出现与早产有关，对有早产表现的人，il-6灵敏度约为69.4％，特异度约为68.2％。
4.传统的早产预测的方法灵敏度或特异度均不尽如人意，难以满足临床需求，这些方法通常对有临床表现的早产人预测较好，但对于无表现的人预测效能较差。而且大部分的检测都需要阴道或者宫颈口检测取样，对孕妇体验不友好。
技术实现要素：
5.根据第一方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含包含串联连接的第一锚定序列以及第一向导序列，所述第一锚定序列可与核酸酶结合，所述第一向导序列对目标核酸分子具有特异性，可以特异性结合目标核酸分子，所述第一锚定序列与所述核酸酶结合，所述第一向导序列与目标核酸分子结合后，导致所述目标核酸分子上的靶核酸分子被切割。
6.根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述多核苷酸。
7.根据第三方面，在一实施例中，提供表1所示基因中的至少一种作为生物标志物在制备和/或筛选胎龄预测试剂中的用途。
8.根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测早产的方法，包括：分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。
9.根据第五方面，在一实施例中，提供一种等温酶切检测方法，包括：将待测模板在等温条件下进行酶切反应，在酶切反应过程中和/或结束时采集荧光值。
10.根据第六方面，在一实施例中，提供一种预测早产的系统，包括：早产分析装置，用于分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。
11.根据第七方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
12.存储器，用于存储程序；
13.处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现第四方面所述的方法。
14.根据第八方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第四方面所述的方法。
15.依据上述实施例的多核苷酸、试剂盒、等温检测方法及预测早产的方法，本发明首次检测孕妇血清中有标志作用的基因表达量，用于无临床症状的孕妇的早产风险预测。主要优势在于血清学检测，无须像超声一样提前预约，无创检测，不需要阴道或者宫颈口取样，检测流程体验好。使用本发明的方法进行检测，简单，成本低。检测灵敏度，特异性高，可多次监测，相对于传统方法具有更好的临床应用前景。
附图说明
16.图1为转录组测序所用的母体样本的早产分娩时间分布图；
17.图2为转录组测序所用的母体样本的足月分娩时间分布图；
18.图3为转录组测序所用的母体样本的早产收样时间分布图；
19.图4为转录组测序所用的母体样本的足月收样时间分布图；
20.图5为lmcd1、snapc1与retsat基因表达量统计图；
21.图6为建模时的训练集roc曲线图；
22.图7为建模时的测试集roc曲线图；
23.图8为临床样本验证时的足月分娩孕周分布图；
24.图9为临床样本验证时的早产分娩孕周分布图；
25.图10为临床样本验证时的足月采样孕周分布图；
26.图11为临床样本验证时的早产采样孕周分布图；
27.图12为临床样本验证时的训练集roc曲线图；
28.图13为临床样本验证时的测试集roc曲线图；
29.图14为酶切反应原理图。
具体实施方式
30.下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。其中不同实施方式中类似元件采用了相关联的类似的元件标号。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本技术能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他元件、材料、方法所替代。在某些情况下，本申
请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本技术的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
31.另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
32.本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。而本技术所说“连接”、“联接，”如无特别说明，均包括直接和间接连接(联接)。
33.定义
34.如本文所用，术语“无细胞rna”或“cfrna”是指由母体、胎儿和/或胎盘的细胞表达且可从母体血液的非细胞部分回收的rna，尤其是mrna，并且包含全长rna转录物的片段。在一些实施方案中，“cfrna”不包含rrna。在一些实施方案中，“cfrna”不包含mirna。在一些实施方案中，“cfrna”是指mrna。cfrna也可以从母体尿液中回收。
35.如本文所用，术语“表达水平”等同于“表达谱，”“表达谱”是指从母体样本获得的一种或多种基因产物的表达水平。基因产物可以是cfrna或蛋白。对于从母体血浆中回收的基因产物，表达水平可以表示为每ml母体血浆中特定rna的转录物数、每ml母体血浆中特定多肽的质量、由rna-seq计算的转录物数或任何其他合适的单位。类似单位可用于从其他母体样本(如尿液)获得的基因产物。基因产物的表达可使用任何合适的方法(例如，如下所述)确定。通常对测量值进行归一化，以解释样本数量和质量、逆转录效率等方面的变化。当表达谱反映来自多个不同基因产物(例如，不同的cfrna转录物)的表达时，在生成或比较表达谱或参考谱时，可以赋予基因产物不同的权重。例如，当将来自孕妇的样本中包括cfrna 1和cfrna 2的表达谱与参考谱(下文讨论)进行比较时，在确定表达谱与参考谱之间相似性或差异程度时，cfrna 1值的2倍差相比cfrna 2的2倍差可以被赋予更大的权重。来自母体(例如，患者)样本的表达谱有时被称为“母体表达谱，”而在指定时间收集的样本中的母体表达谱可以被称为“[时间]母体表达谱，”例如“24周母体表达谱”。
[0036]
如本文所用，“参考谱”是衍生自参考体的表达谱。为了说明，参考体的示例是孕妇，足月分娩的孕妇或早产的孕妇。在一些实施方案中，参考体是以母体年龄(例如，足月分娩的20-25岁妇女)、种族或民族(例如，足月分娩的欧裔中国人妇女、美裔中国人妇女、非裔中国人妇女等等)为特征的孕妇亚。通过组合体中统计学上显著数量的妇女的表达谱来生成参考谱，对于指定的基因产物，该参考谱可以反映体中的平均转录水平、体中的中位转录水平，或者可以使用在流行病学和医学领域中已知的许多方法中的任何一种来确定。参考体通常将包括至少10个受试者(例如10-200个受试者)，有时50个或更多个受试者，有时1000个或更多个受试者。
[0037]
如本文所用，术语“谱组套”是指在特定测定中测量的基因产物集合。例如，在针对三(3)种不同的cfrna(“r na a-f”)的测定中，这三种cfrna将是谱组套。同样，在对来自母体血浆或尿液的三(3)种不同蛋白的测定中，这三种蛋白将成为谱组套。作为另一个例证，在一种收集了大量基因的转录物(例如整个转录组或大量胎盘基因转录物)的表达数据的
测定中，用于估算胎龄或分娩时间或者评估早产风险的子集可以称为谱组套。未包含在组套中的rna或蛋白的测量值可以用作对照，以将样本内或样本之间的测量值归一化，或用于类似用途。在一些实施方案中，谱组套可包含基因产物集合，该集合包含cfrna和蛋白两者。谱组套有时称为“组套”。
[0038]
如本文所用，术语“早产、”“足月妊娠”、“足月分娩”和“正常足月妊娠”具有其正常含义。足月是指胎儿达到37周胎龄之后的分娩，而早产是指胎儿达到37周胎龄之前的分娩。在某些情况下，早产是指在16周至35周胎龄或24周至30周胎龄期间的分娩。
[0039]
如本文所用，“母体样本”是指从孕妇获得的体液的样本。体液通常是血清、血浆或尿液，并且通常是血清。在一些实施方案中，可以使用不同体液的样本，例如唾液、脑脊髓液、胸腔积液等。可以在妊娠期间的多个不同时间点获得母体样本，并进行存储(例如冷冻)直至进行测定。应当理解，母体样本的收集日期是样本不可或缺的特性。
[0040]
如本文所用，“分娩时间”是指从怀孕起始时间到分娩日期或预计分娩日期的周数。分娩时间的计算方法是(分娩时的时间)减去(怀孕起始时间)。怀孕起始时间通常是推算得到，例如，怀孕之前的最后一次月经来潮的第一天起算，作为怀孕的开始时间，也可以通过b超检查进行推算，也可以通过孕吐出现的时间、胎动出现的时间、子宫底的高度、孕中期超声等其他方法来推测。本文中样本的取样时间的计算方法是(取样时的时间)减去(怀孕起始时间)，即胎龄。
[0041]
如本文所用，术语“蛋白”和“多肽”可互换使用。提及从母体样本获得的蛋白并不一定意味着该蛋白是全长基因表达产物。可以根据本发明检测和确认部分、片段和切割产物。
[0042]
本文中，如无特别说明，“血清”是指血浆除去纤维蛋白原后的胶状液体。血浆是指血液的细胞外基质。
[0043]
本文中，“lmcd1基因”的gene id:29995，转录本:nm_014583.4。
[0044]
本文中，“snapc1基因”的gene id:6617，转录本：nm_003082.4。
[0045]
本文中，“retsat基因”的gene id:54884，转录本:nm_017750.4。
[0046]
本文中，“p2ry10基因”的gene id:27334，转录本:nm_014499.4。
[0047]
本文中，“tmem159”的gene id:233806，转录本:nm_145586.1。“teme159”与“tmem159”可互换使用。
[0048]
本中文，“背景基因”是指等温荧光检测时，进行荧光矫正时，矫正公式中分母上所用荧光值对应的基因，该基因通常是在大多数细胞中表达较为恒定的基因。
[0049]
本文中，“gapdh”的gene id:2597，转录本:nm_002046.7。
[0050]
鉴于现有技术存在的缺陷，开发新的高性能的早产早筛方法是非常有必要的。
[0051]
根据第一方面，在一实施例中，提供一种多核苷酸，所述多核苷酸包含串联连接的第一锚定序列以及第一向导序列，所述第一锚定序列可与所述核酸酶结合，所述第一向导序列对目标核酸分子具有特异性，可以特异性结合目标核酸分子，所述第一锚定序列与所述核酸酶结合，所述第一向导序列与目标核酸分子结合后，导致所述目标核酸分子上的靶核酸分子被切割。
[0052]
在一实施例中，所述第一向导序列对表1中所示基因、背景基因中的至少一种具有特异性。
[0053]
在一实施例中，所述第一向导序列对lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因、背景基因中的至少一种具有特异性。
[0054]
在一实施例中，所述第一向导序列对lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、gapdh基因中的至少一种具有特异性。
[0055]
在一实施例中，所述第一向导序列含有如下碱基序列中的至少一种：
[0056]
1)5
’‑
acacaggaauccauuacauu-3’；
[0057]
2)5
’‑
aguggaacagaguucacugc-3’；
[0058]
3)5
’‑
caagacuugcauauuuuccu-3’；
[0059]
4)5
’‑
cugguaugacaacgaauuug-3’。
[0060]
根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，所述试剂盒包含第一方面所述多核苷酸。
[0061]
在一实施例中，所述试剂盒还包含核酸酶以及crrna，所述crrna包含第一方面所述多核苷酸。
[0062]
在一实施例中，所述试剂盒还包含第二向导rna、带第一空泡序列的第一序列、带第二空泡序列的第二序列，所述第二向导rna包含依次串联连接的第二锚定序列、第三结合序列、第四结合序列，所述第二锚定序列包含第一结合序列、第二结合序列，所述第二锚定序列可与核酸酶结合，导致目标核酸分子上的靶核酸分子被切割。
[0063]
在一实施例中，所述第一序列包含第一空泡序列、串联至所述第一空泡序列一端的第五结合序列、串联至所述第一空泡序列另一端的第六结合序列；
[0064]
所述第二序列包含第二空泡序列、串联至所述第二空泡序列一端的第七结合序列、串联至所述第二空泡序列另一端的第八结合序列；
[0065]
所述锚定序列的第一结合序列可与所述第一序列的第六结合序列反向互补配对，所述锚定序列的第二结合序列与所述第一序列的第五结合序列反向互补配对；
[0066]
所述第二向导rna的第三结合序列与所述第二序列的第八结合序列反向互补配对，所述第二向导rna的第四结合序列与所述第二序列的第七结合序列反向互补配对。
[0067]
在一实施例中，所述第一空泡序列、第二空泡序列的一端独立地修饰有第一标记分子，所述第一空泡序列、第二空泡序列的另一端独立地修饰有第二标记分子，所述第一空泡序列、第二空泡序列可以被所述核酸酶从所述第一序列、第二序列上切割。切割前，荧光报告基团与荧光淬灭基团物理靠近，发生荧光淬灭，切割后，荧光报告基团与荧光淬灭基团物理远离，在荧光报告基团的激发波长下，可以检测到强荧光信号。
[0068]
在一实施例中，所述第二向导rna上修饰有第三标记分子。
[0069]
在一实施例中，所述第二向导rna为单链rna，所述带第一空泡序列的第一序列、带第二空泡序列的第二序列独立地为为单链dna。
[0070]
在一实施例中，所述第二向导rna可与带第一空泡序列的第一序列、带第二空泡序列的第二序列反应得到可被核酸酶切割的引导rna(即scgrna)。
[0071]
在一实施例中，所述多核苷酸还包含由第二向导rna与带第一空泡序列的第一序列、带第二空泡序列的第二序列反应后得到的产物。该产物即为可被核酸酶切割的引导rna(即scgrna)。
[0072]
在一实施例中，所述试剂盒还包含辅助核酸分子。
[0073]
在一实施例中，所述辅助核酸分子包含可与所述第二向导rna中的部分碱基序列反向互补配对的碱基序列。
[0074]
在一实施例中，所述辅助核酸分子包含可与所述第二向导rna的第三结合序列、第四结合序列中的至少一种反向互补配对的碱基序列。
[0075]
在一实施例中，所述辅助核酸分子包含可与所述第二向导rna的第三结合序列、第四结合序列中的全部反向互补配对的碱基序列。
[0076]
在一实施例中，所述辅助核酸分子还包含可供所述核酸酶识别的pam序列。
[0077]
在一实施例中，所述辅助核酸分子为双链dna。
[0078]
在一实施例中，所述第一锚定序列、第二锚定序列独立地含有如下碱基序列：
[0079]5’‑
uaauuucuacuaaguguagau-3’。
[0080]
在一实施例中，所述第一标记分子、第三标记分子为同一种标记分子。
[0081]
在一实施例中，所述第一标记分子、第三标记分子为荧光报告基团。
[0082]
在一实施例中，所述第二标记分子为荧光淬灭基团。
[0083]
在一实施例中，所述第一标记分子与第三标记分子物理靠近时发生荧光能量共振转移，所述第二标记分子与第三标记分子物理靠近时发生荧光能量共振转移，具体可以是发生荧光猝灭。
[0084]
在一实施例中，所述荧光报告基团包括但不限于fam、hex、vic、rox、cy5中的至少一种。
[0085]
在一实施例中，所述荧光淬灭基团选自bhq1、bhq2中的至少一种。
[0086]
在一实施例中，所述试剂盒还包含对lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一种具有特异性的crrna。
[0087]
在一实施例中，所述试剂盒还包含对背景基因具有特异性的crrna。
[0088]
在一实施例中，所述背景基因包括但不限于gapdh基因。
[0089]
在一实施例中，所述核酸酶包括但不限于cas9蛋白、cas12a蛋白中的至少一种。核酸酶可以从市场上购买得到，也可以通过重组表达、蛋白纯化等方式获得。
[0090]
在一实施例中，所述cas12a蛋白包括但不限于lbcas12a、ascas12a、fncas12a中的至少一种。
[0091]
在一实施例中，所述crrna为单链rna。
[0092]
在一实施例中，所述试剂盒还含有酶切反应所需的其他试剂，包括但不限于缓冲液、kcl、mgcl2、dtt(二硫苏糖醇，dithiothreitol)、甘油、水等等。
[0093]
在一实施例中，所述目标核酸分子含有供所述核酸酶识别的pam序列(protospacer adjacent mot，原始间隔区相邻结构)。
[0094]
在一实施例中，所述pam序列通常为tttn，切割靶标通常位于pam序列下游。
[0095]
在一实施例中，所述第一锚定序列位于所述第一向导序列的上游。即第一锚定序列的3’端串联至第一向导序列的5’端。
[0096]
根据第三方面，在一实施例中，提供表1所示基因中的至少一种作为生物标志物在制备和/或筛选胎龄预测试剂中的用途。
[0097]
在一实施例中，所述生物标志物包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一种。
[0098]
在一实施例中，所述生物标志物包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一种。
[0099]
在一实施例中，所述生物标志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0100]
在一实施例中，所述生物标志物包括相应基因在母体样本中的表达谱。
[0101]
在一实施例中，所述表达谱包括相应基因在母体样本中的rna表达量。
[0102]
在一实施例中，所述rna表达量是指mrna表达量。通常是先通过逆转录，获得所有逆转录产物的集合，然后计算出mrna表达量。
[0103]
在一实施例中，所述表达谱包括相应基因在母体样本中的蛋白表达量。
[0104]
在一实施例中，所述表达谱包括待测的母体样本中相应基因相对于基线过量表达。
[0105]
在一实施例中，所述表达谱包括待测的母体样本中相应基因相对于基线不足表达。在一些实施例中，可以是待测的母体样本中一部分生物标志物相对于基线过量表达，另一部分生物标志物相对于基线不足表达。在另一些实施例中，可以是待测的母体样本中全部生物标志物相对于基线过量表达。在另一些实施例中，可以是待测的母体样本中全部生物标志物相对于基线不足表达。
[0106]
在一实施例中，所述基线可以是足月分娩的母体样本中相应基因的表达谱。
[0107]
在一实施例中，所述表达谱通过测量母体样本中的无细胞rna(cfrna)来确定。
[0108]
在一实施例中，所述表达谱通过测量母体样本中的蛋白来确定。
[0109]
在一实施例中，所述母体样本包括但不限于体液样本、组织样本中的至少一种。优选为体液样本。
[0110]
在一实施例中，所述体液样本包括但不限于母体血液、血浆、血清、尿液中的至少一种。
[0111]
在一实施例中，所述母体样本的取样时间为第7～20孕周。
[0112]
在一实施例中，所述生物标志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0113]
在一实施例中，所述生物标志物为相应基因在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值。
[0114]
在一实施例中，所述酶切反应为等温反应。即酶切反应过程中，控制反应体系的温度保持不变。
[0115]
在一实施例中，所述酶切反应的温度为35～42℃，优选为37℃。
[0116]
在一实施例中，在酶切反应过程中的某一时间点或某一时间段采集荧光值；
[0117]
在一实施例中，采集荧光值的时间点为酶切反应第30～120分钟中的某一时间点或某一时间段。
[0118]
在一实施例中，采集荧光值的时间点为酶切反应第90分钟。该时间包含从室温升至目标温度的时间。
[0119]
在一实施例中，所述酶切反应的起始点通常是指反应仪启动时。从室温(23
±
2℃)升温至37℃的升温速率通常可以为4℃/s。
[0120]
在一实施例中，所述生物标志物为母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含
有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值。
[0121]
在一实施例中，所述酶切反应体系还含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述试剂盒中的组分。
[0122]
在一实施例中，通过母体样本中相应基因的表达谱计算得到受试者早产的概率值。
[0123]
在一实施例中，通过母体样本中相应基因的表达谱计算得到受试者早产的概率值，根据所述概率值与阈值的大小关系，预测受试者是否会早产。在一实施例中，可以通过挑选训练集中灵敏度与特异度之和最大的阈值作为阈值。
[0124]
在一实施例中，所述阈值为0.4～0.7。在一实施例中，所述阈值为0.45。
[0125]
在一实施例中，如果所述概率值≥阈值，则预测受试者为早产，如果所述概率值＜阈值，则预测受试者为足月分娩。
[0126]
在一实施例中，通过相应基因的荧光值计算得到受试者早产的概率值。
[0127]
在一实施例中，通过相应基因的荧光矫正值计算得到受试者早产的概率值。矫正的目的是为了避免计算得到的数值过小。
[0128]
在一实施例中，所述荧光值为荧光矫正值。
[0129]
在一实施例中，母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值的计算方法如下：将母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值除以母体样本中背景基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值，得到商值，将所述商值乘以矫正系数，得到所述荧光矫正值。
[0130]
在一实施例中，所述矫正系数包括但不限于10^5。矫正系数可以为其他任意常数，具体可以根据需要而定，旨在避免计算得到的数值过小。
[0131]
在一实施例中，通过母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值计算受试者早产概率值的公式如下：
[0132]
其中，所述f
lmcd1
为母体样本中lmcd1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述f
snapc1
为母体样本中snapc1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述f
retsat
为母体样本中ret sat基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值。
[0133]
根据第四方面，在一实施例中，提供一种预测早产的方法，包括：分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。
[0134]
需要说明的是，本发明提供的预测早产的方法所检测的是离体样本，并且，预测结果仅仅作为临床参考，医生在进行早产检测和/或诊断时，还需要通过临床推算(通常是根据以往月经周期进行推算)、超声检查(例如，胎儿头径、头围、腹围股骨长度与胎龄及体重密切相关，根据超声测量值可估计孕周与胎儿大小)，胎儿纤维连接蛋白(ffn)棉拭子检测(胎儿纤维连接蛋白是由羊膜、蜕膜、绒毛膜联合分泌，存在于蜕膜和绒毛膜之间的糖蛋白，对胎膜起到黏附作用。孕21周以后，绒毛膜与蜕膜的融合阻止了ffn的释放，因此，正常的孕妇在22～35孕周时，ffn的含量极低。在绒毛膜与蜕膜分离、绒毛膜与蜕膜界面的细胞外基
质遭到机械损伤或蛋白水解酶的降解时，ffn漏入阴道后穹窿分泌物中，孕22～35周宫颈阴道分泌物ffn水平，与早产有很好的相关性)等其他手段，才能得出是否早产的最终结果。因此，本发明的预测结果并非最终结果，而是属于中间参考结果，不属于疾病的诊断方法，更不属于疾病的方法。
[0135]
在一实施例中，所述基因包括表1所示基因中的至少一种。
[0136]
在一实施例中，所述基因包括但不限于lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tm em159基因中的至少一种；
[0137]
在一实施例中，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一种。
[0138]
在一实施例中，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部。
[0139]
在一实施例中，所述表达谱为相应基因在母体样本中的表达量。
[0140]
在一实施例中，所述表达谱为相应基因经酶切反应后的荧光值。
[0141]
在一实施例中，所述表达谱为相应基因在母体样本中的rna的逆转录产物经过酶切反应后的荧光值。该方法无需对母体样本构建文库进行测序分析，无需使用昂贵的测序设备及试剂，并有效简化检测流程。无需pcr反应升温降温过程，无需复杂的pcr仪，只需要荧光读取装置。
[0142]
在一实施例中，所述荧光值为荧光矫正值。
[0143]
在一实施例中，所述酶切反应为等温反应。等温反应是指酶切反应过程中温度保持不变，或者，温度的波动极小。
[0144]
在一实施例中，酶切反应体系中还含有荧光试剂。
[0145]
在一实施例中，酶切反应体系含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述试剂盒中的组分。
[0146]
根据第五方面，在一实施例中，提供一种等温酶切检测方法，包括：将待测模板在等温条件下进行酶切反应，在酶切反应过程中和/或结束时采集荧光值。该方法可用于目标基因相对表达量的检测，或者用于靶序列的定性检测。该酶切检测方法具有定量检测、等温检测、高灵敏度、操作简便等优点。
[0147]
在一实施例中，采集荧光值的时间点为第30～120分钟中的某一时间点或某一时间段。
[0148]
在一实施例中，采集荧光值的时间点为第90分钟。
[0149]
在一实施例中，所述酶切反应的温度为35～42℃，包括但不限于35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等等，优选为37℃。
[0150]
在一实施例中，所述酶切反应体系中含有第一方面所述多核苷酸或第二方面所述试剂盒中的组分。
[0151]
在一实施例中，所述待测模板可以为母体样本中待测基因的rna的逆转录产物。
[0152]
在一实施例中，所述rna包含信使rna(mrna)。
[0153]
根据第六方面，在一实施例中，提供一种预测早产的系统，包括：早产分析装置，用于分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。
[0154]
根据第七方面，在一实施例中，提供一种装置，包括：
[0155]
存储器，用于存储程序；
[0156]
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现第五方面所述的方法。
[0157]
根据第八方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第五方面所述的方法。
[0158]
在一实施例中，本发明提供的试剂盒适用于待测模板为母体样本中待测基因的rna的逆转录产物的酶切反应以及荧光检测。
[0159]
在一实施例中，所述试剂盒为用于孕妇早产预测的试剂盒。
[0160]
在一实施例中，本发明提供了一种基于lmcd1、snapc1与retsat基因表达量进行人类早产早期筛查的的定量检测方法。
[0161]
在一实施例中，本发明首次检测孕妇血清中lmcd1、snapc1与retsat基因表达量，用于无临床症状的孕妇的早产风险预测。主要优势在于血清学检测，无须像超声一样提前预约，无创检测，不需要阴道或者宫颈口取样，检测流程体验好。采用免疫层析的方法进行检测，简单，成本低。检测灵敏度，特异性高，可多次监测，相对于传统方法具有更好的临床应用前景。
[0162]
在一实施例中，本发明根据检测的mrna标志物的表达量，通过机器学习预测早产的风险高低。检测阳性的样本，作为辅助诊断供临床医生参考。
[0163]
在一实施例中，本发明的检测原理如下：孕妇血清中lmcd1、snapc1与retsat基因表达量能够反映孕妇可能发生早产的风险，该检测不受孕妇是否有相关临床症状的影响，无检测禁忌症，通过监测lmcd1、snapc1与retsat基因表达量即可预测无症状早产风险。
[0164]
在一实施例中，本发明提供的检测试剂针对的检测样本为孕妇外周血。
[0165]
在一实施例中，本发明检测的样本采样无禁忌症，可以多次采样。
[0166]
在一实施例中，本发明所检测的mrna是lmcd1，snapc1与retsat。
[0167]
在一实施例中，本发明基于酶切反应的荧光检测可在固定条件下完成检测，酶切反应时，升温至目标温度后，无需升温降温过程。
[0168]
在一实施例中，本发明提供一种小插件用于三个标志物的含量对比分析，自动化出具风险值。所述小插件包含通过母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值计算受试者早产概率值的公式，具体如下：
[0169]
其中，所述f
lmcd1
为母体样本中lmcd1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述f
snapc1
为母体样本中snapc1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述f
retsat
为母体样本中retsat基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值。
[0170]
在一实施例中，本发明的高灵敏度、高特异性能够有效提升孕妇早产筛查的准确性，能够弥补现有临床手段的不足。
[0171]
在一实施例中，本发明采用孕妇外周血检测，无创，不需要进行阴道宫颈口取样，方便临床取样检测。
[0172]
在一实施例中，本发明采用基于cas12a的等温高灵敏度检测方法，对检测条件要求不高，简便，成本低廉。
[0173]
在一实施例中，本发明可为无症状孕妇提供早产风险评估方法，可筛查出早产高
危孕妇提前进行宫内转运等措施，从而降低早产的风险或者提高早产儿的存活率，对于提高我国出生人口具有重大意义。
[0174]
以下实施例中，以怀孕之前的最后一次月经来潮的第一天起算，作为怀孕的开始时间。
[0175]
实施例1：采样与血浆分离
[0176]
edta的抗凝管(紫头管)收集5ml血液，收集后暂存在4℃环境中，交由相应实验人员或实验室在8小时内进行离心，收集血浆与白细胞，迅速冻存于-80℃环境中。
[0177]
血浆分离具体步骤如下：
[0178]
1)上下颠倒10次每支采血管后，放至预冷的大型离心机中。
[0179]
2)4℃，1600
×
g，离心10分钟。
[0180]
3)小心的将采血管从离心机中取出，放回15ml离心管架上。
[0181]
4)血样离心后，分为底部红细胞层，中间白细胞层以及上清血浆层(正常的血浆为淡黄，在该层顶部可能会有些许白絮状物，为脂类物质)。
[0182]
5)将1000μl移液器量程调至500μl，小心地将血浆转至1.5ml离心管中，每管500μl，最后将中间层的白细胞转至1.5ml离心管中。
[0183]
6)将3管血浆放入小型离心机中，室温，16000
×
g，离心10分钟(主要目的是去除细胞碎片等)。
[0184]
7)将1000μl移液器量程调至500μl，小心的将血浆转至1.5ml离心管中。
[0185]
8)血浆与白细胞均置于-80℃长期保存，白细胞在后续实施例中不再使用。
[0186]
实施例2：cfrna提取
[0187]
1)在≥12,000
×
g的离心力下离心血浆样品15分钟，以去除细胞杂质和沉淀。
[0188]
2)按照每200μl样品添加200μl游离rna消化液，放入一个15ml的离心管，混匀。如果样品体积≥1.5ml，则使用50ml的离心管。游离rna消化液、蛋白酶k溶液、rna溶液1、rna溶液2为一个试剂盒，该试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司，货号tr159-50。
[0189]
3)按照每200μl血浆样品添加10μl的蛋白酶k溶液，涡旋混匀10秒，37℃下孵育2小时。
[0190]
4)添加等体积的游离rna结合液到消化的样品中并且涡旋混匀10秒。
[0191]
5)添加1.5倍体积的100％的异丙醇到步骤4)中的混合物中，涡旋混匀10秒。
[0192]
6)将25ml漏斗套到3号柱y(黄)内，连接紧密后放置在负压多连器上。
[0193]
7)倒入上述步骤6)的混合液，打开真空开关使液体完全通过柱子。确保液体完全通过柱子并且没有残留液体下流后，关闭真空泵并拔掉连接的25ml漏斗。
[0194]
8)倒入600μl rna洗涤液1到柱子上，打开真空开关，让液体完全通过3号柱y(黄)，关闭真空泵。
[0195]
9)将3号柱y(黄)套在2ml收集管上，然后放置在台式离心机上全速离心2分钟以去除液体残留，然后将3号柱y(黄)套在一个干净的1.5ml离心管内。
[0196]
10)添加200μl的rna回收液到3号柱y(黄)中，室温放置3分钟，离心，保存滤出液。
[0197]
11)添加300μl无水乙醇(95-100％)到滤出液中，混匀。
[0198]
12)将1号柱套在一个新的2ml收集管上。添加步骤11)制得的混合物到柱中，离心
去除滤出液。
[0199]
13)添加400μl的rna洗涤液1，离心去除滤出液。
[0200]
14)添加700μl的rna洗涤液2，离心去除滤出液。
[0201]
15)添加400μl的rna洗涤液2到1号柱中，离心2分钟完全去除柱子上残留的液体，将1号柱转移到一个干净的离心管内。
[0202]
16)添加15μl的rnase-free水到柱基质上，放置2分钟然后离心，以洗脱游离rna。
[0203]
实施例3：通过转录组测序筛选生物标志物
[0204]
1.分别在孕早期(8-20周)收集早产病例39例，收集足月42例外周血样本，从所有样本分别提取外周血清游离rna，并进行全转录组测序。此处是对细胞内所有转录产物的集合，包括信使rna、核糖体rna、转运rna及非编码rna等等进行测序，后续再筛选出目标信使rna(mrna)。
[0205]
图1所示为早产分娩时间分布图，图2所示为足月分娩时间分布图，图3所示为早产收样时间分布图，图4所示为足月收样时间图。
[0206]
2.通过deseq2筛选差异表达基因，以p值小于0.05作为阈值，总计筛选出差异表达基因935个，如表1所示。此处的差异表达是指以足月分娩的样本为基线，早产分娩的样本中的相应基因存在差异表达，此处的差异表达包括相对于基线的高表达以及低表达。
[0207]
表1
[0208]
[0209]
[0210]
[0211]
[0212]
[0213][0214]
3.对tpm数据，使用r软件caret包，通过随机森林算法，以十折交叉验证的方式，筛选最重要的rna标志物，最终筛选出5个基因对应的rna标志物(mrna)。5个基因为p2ry10、lmcd1、snapc1、ret sat、tmem159。
[0215]
4.使用logistic回归对5个基因进行回归分析，最终确定三个最重要的rna标志物(只包括mrna)，即lmcd1、snapc1与retsat的mrna，可用于早产的预测。
[0216]
图5所示为各个组中lmcd1、snapc1与retsat基因的表达量统计图，可见，lmcd1、snapc1基因相对于足月样本不足表达，retsat基因相对于足月样本过量表达。
[0217]
图6所示为训练集的roc曲线图(receiver operating characteristic curve，亦称接收者操作特征曲线)，其中，auc(area under curve，roc曲线下与坐标轴围成的面积)为0.908。
[0218]
图7所示为测试集的roc曲线图，其中，auc(area under curve，roc曲线下与坐标轴围成的面积)为0.846。
[0219]
实施例4：逆转录
[0220]
逆转录体系如下：
[0221]
表2
[0222][0223]
可使用表2中两种体系中的任意一种进行逆转录，本实施例中具体选用的是20μl的体系。
[0224]
表2中使用的试剂盒为购自fapon公司的aktaqone-steprt-pcrmix产品编号：md103。
[0225]
处理步骤如下表所示：
[0226]
表3
[0227]
步骤温度时间142℃5min295℃10s
[0228]
实施例5：等温荧光检测
[0229]
本实施例中，等温荧光检测所用的核苷酸分子由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0230]
针对需要检测的基因lmcd1、snapc1与retsat，以ahcb设计并优化相应的cas12a对应的crrna(c rispr-derived rna，一种衍生rna)序列如下：
[0231]
表4
[0232][0233]
表4中，特异性靶向retsat基因的grna用于引导lbcas12a酶切割，具体是切割逆转录后的retsat mrna生成的cdna序列，启动正反馈级联反应。其他三种grna的作用与retsat基因的grna作用类似。表4中基因的mrna逆转录后的cdna上含有pam序列，供lbcas12a酶识别，pam序列具体为tttn。
[0234]
表4中，加粗的碱基为第一锚定序列。未加粗的碱基为可结合至靶基因的第一向导序列。
[0235]
酶切反应原理如图14所示，靶向靶序列的grna引导cas12a切割靶序列，产生非特异性切割活性，切割空泡产生荧光，同时与两个idna结合的rna释放产生针对辅助双链dna的grna，引导cas12a切割辅助双链dna，并激活非特异性切割活性，进一步切割与两个idna结合的rna(scgrna)，产生荧光，如是产生正反馈放大信号。
[0236]
grna-fam序列：fam序列：fam为一种绿荧光报告基团，英文名称为6-carboxy-fluorescein，中文名称为6-羧基荧光素。grna-fam序列用于产生自反馈放大效应。加粗的碱基为第二锚定序列，点-短线下划线标示的序列为第二锚定序列的第一结合序列，下划双直线标示的序列为第二锚定序列的第二结合序列，下划单直线标示的序列为第三结合序列，下划单虚线标示的序列为第四结合序列。
[0237]
与grna-fam相结合的带有空泡的序列1(idna1)：fam相结合的带有空泡的序列1(idna1)：点-短线下划线标示的序列(即第六结合序列)可与grna-fam序列中点-短线下划线标示的序列反向互补配对，双直下划线标示的序列(即第五结合序列)可与grna-fam序列中双直下划线标示的序列反向互补配对，中部用单波浪线标示的序列为第一空泡序列，不能与grna-fam序列互补配对，用于被切割后产生荧光信号。
[0238]
与grna-fam相结合的带有空泡的序列2(idna2)：
下划单直线标示的序列(即第八结合序列)可与grna-fam序列中下划单直线标示的序列反向互补配对，下划单虚线标示的序列(即第七结合序列)可与grna-fam序列中下划单虚线标示的序列反向互补配对。
[0239]
idna1、idna2中，“i6-famdt”是指6-fam(6-羧基荧光素)荧光标记的dt核苷酸(d表示脱氧)，“ibhq1dt”是指带有bhq1淬灭基团标记的dt核苷酸，dt核苷酸是指脱氧核苷，“d”是英文单词“deoxidized”的首字母缩写，“de”是一个前缀，表示脱离、脱去，“oxidize”即氧化作用。bhq1是指黑洞猝灭基团。idna1、idna2用于切割后产生荧光。
[0240]
辅助双链dna(adna)序列：下划单虚线标示的序列(第九结合序列)可以与grna-fam序列中的下划单虚线标示的序列反向互补配对，下划单直线标示的序列(即第十结合序列)可以与grna-fam序列中的下划单直线标示的序列反向互补配对。
[0241]
idna1、idna2与grna-fam通过以下步骤生成scgrna(自切割的向导rna)：
[0242]
idna1与idna2、grna-fam按照1.2:1的摩尔比(即idna1与grna-fam的摩尔比为1.2:1，idna2与grna-fam的摩尔比也为1.2:1)混合，在退火buffer(20mm tris-hcl(ph 7.5),150mm kcl,1mm ed ta,and 50mm mgcl2)中95℃处理4分钟，随后以0.1℃每秒的速度降温至25℃，得到scgrna，将该产物作为表4的反应物，进行后续反应。
[0243]
然后配制表5所示的体系。
[0244]
表5
[0245]
组分终浓度逆转录模板dna500nmgrna-t50nmlbcas12a(购自neb公司)1μmscgrna1μmadna0.5μmtris-hcl(ph 7.5)20mmkcl100mmmgcl25mmdtt(二硫苏糖醇，dithiothreitol)1mm甘油5％(体积百分比)超纯水补足至20μl总体积20μl
[0246]
表5中，grna-t是指表4所示的crrna中的某一种(“t”为target的简称，grna-t表示靶向目标基因的grna，即crrna)，共配制4个体系，每个体系装入一个反应管中，每个体系中含有一种grna，配制得到分别含有四种grna的体系。
[0247]
将上述体系加入pcr管中，分为4管，每一管含有表4中的一种crrna，于美国赛默飞abi 7500实时荧光定量pcr仪(简称abi 7500)中反应，设置温度为37℃，从室温(23
±
2℃)升温至37℃的升温速率为4℃/s，每30s采集荧光值，发射光波长为520nmn，反应时间90分
钟。
[0248]
实施例六：数据分析
[0249]
在abi 7500中反应90分钟)后，采集荧光值作为最终的表达量，使用retsat、snapc1与lmcd1的荧光值(由于是在不同的pcr管中反应，因此，可以单独各rna标志物的荧光值)，除以gapdh的荧光值，再乘以10^5，作为最终的相对表达量。随着酶切反应的进行，荧光值的增长通常经历基线期、指数期、线性期、平台期，本实施例采集荧光值的时间点(即第90分钟)处于指数增长期。
[0250]
实施例七：临床样本验证性能
[0251]
收集125例足月样本，123例早产样本，分娩孕周与收样孕周如图8～图11所示，具体地，图8所示为足月分娩孕周统计图，图9所示为早产分娩孕周统计图，图10所示为足月采样孕周统计图，图11所示为早产采样孕周统计图。
[0252]
分别提取cfrna进行荧光测定，荧光值如下表所示：
[0253]
表6
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259]
[0260][0261]
表5中各样本基因的荧光值为采集到的原始值(未进行矫正)。
[0262]
将样本随机按照7:3的比例分为测试集与训练集，利用训练集进行模型的训练，测
试集进行模型的验证，图12所示为训练集的roc曲线图，auc为0.838，图13所示为测试集的roc曲线图，auc为0.849，在阈值为0.450时，训练集灵敏度为0.753，特异度为0.765，测试集灵敏度为0.711，特异度为0.889。概率计算公式如下：
[0263]
其中，所述flmcd1为母体样本中lmcd1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述fsnapc1为母体样本中snapc1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述fretsat为母体样本中retsat基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值。
[0264]
本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。
[0265]
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
技术特征：
1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含串联连接的第一锚定序列以及第一向导序列，所述第一锚定序列可与核酸酶结合，所述第一向导序列对目标核酸分子具有特异性，可以特异性结合目标核酸分子，所述第一锚定序列与所述核酸酶结合，所述第一向导序列与目标核酸分子结合后，导致所述目标核酸分子上的靶核酸分子被切割。2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述第一向导序列对表1中所示基因、背景基因中的至少一种具有特异性；和/或，所述第一向导序列对lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因、背景基因中的至少一种具有特异性；和/或，所述第一向导序列对lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、gapdh基因中的至少一种具有特异性；和/或，所述第一向导序列含有如下碱基序列中的至少一种：1)5
’‑
acacaggaauccauuacauu-3’；2)5
’‑
aguggaacagaguucacugc-3’；3)5
’‑
caagacuugcauauuuuccu-3’；4)5
’‑
cugguaugacaacgaauuug-3’。3.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1～2任意一项所述多核苷酸。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含核酸酶以及crrna，所述crrna包含权利要求1所述多核苷酸；和/或，所述试剂盒还包含第二向导rna、带第一空泡序列的第一序列、带第二空泡序列的第二序列，所述第二向导rna包含依次串联连接的第二锚定序列、第三结合序列、第四结合序列，所述第二锚定序列包含第一结合序列、第二结合序列，所述第二锚定序列可与核酸酶结合，导致目标核酸分子上的靶核酸分子被切割；和/或，所述试剂盒还包含辅助核酸分子；和/或，所述辅助核酸分子包含可与所述第二向导rna中的部分碱基序列反向互补配对的碱基序列；和/或，所述辅助核酸分子为双链dna；和/或，所述第一锚定序列含有如下碱基序列：5
’‑
uaauuucuacuaaguguagau-3’；和/或，所述试剂盒还包含对背景基因具有特异性的crrna；和/或，所述核酸酶包括cas9蛋白、cas12a蛋白中的至少一种；和/或，所述cas12a蛋白包括lbcas12a、ascas12a、fncas12a中的至少一种；和/或，所述crrna为单链rna；和/或，所述目标核酸分子含有供所述核酸酶识别的pam序列(protospacer adjacent mot，原始间隔区相邻结构)；和/或，所述第一锚定序列位于所述第一向导序列的上游。5.表1所示基因中的至少一种作为生物标志物在制备和/或筛选胎龄预测试剂中的用途。6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物标志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一种；
和/或，所述生物标志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一种；和/或，所述生物标志物包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部；和/或，所述生物标志物包括相应基因在母体样本中的表达谱；和/或，所述表达谱包括相应基因在母体样本中的rna表达量；和/或，所述表达谱包括相应基因在母体样本中的mrna表达量；和/或，所述表达谱通过测量母体样本中的无细胞rna(cfrna)来确定；和/或，所述表达谱通过测量母体样本中的蛋白来确定；和/或，所述母体样本包括体液样本、组织样本中的至少一种；和/或，所述体液样本包括母体血液、血浆、血清、尿液中的至少一种；和/或，所述母体样本的取样时间为第7～28孕周；和/或，所述母体样本的取样时间为第7～20孕周；和/或，所述生物标志物为相应基因在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值；和/或，所述酶切反应为等温反应；和/或，所述酶切反应的温度为35～42℃，优选为37℃；和/或，在酶切反应过程中的某一时间点或某一时间段采集荧光值；和/或，采集荧光值的时间点为酶切反应第30～120分钟中的某一时间点或某一时间段；和/或，采集荧光值的时间点为酶切反应第90分钟。7.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述生物标志物为母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值；和/或，所述体系还含有权利要求1～2任意一项所述多核苷酸和/或权利要求3～4任意一项所述试剂盒中的组分；和/或，通过母体样本中相应基因的表达谱计算得到受试者早产的概率值；和/或，通过母体样本中相应基因的表达谱计算得到受试者早产的概率值，根据所述概率值与阈值的大小关系，预测受试者是否会早产；和/或，如果所述概率值≥阈值，则预测受试者为早产，如果所述概率值＜阈值，则预测受试者为足月分娩；和/或，所述阈值为0.4～0.7；和/或，所述阈值为0.45；和/或，通过相应基因的荧光值计算得到受试者早产的概率值；和/或，通过相应基因的荧光矫正值计算得到受试者早产的概率值；和/或，母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值的计算方法如下：将母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值除以母体样本中背景基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光值，得到商值，将所述商值乘以矫正系数，得到所述荧光矫正值；和/或，所述矫正系数为10^5；和/或，通过母体样本中相应基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反
应后的产物荧光矫正值计算受试者早产概率值的公式如下：其中，所述flmcd1为母体样本中lmcd1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述fsnapc1为母体样本中snapc1基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值，所述fretsat为母体样本中retsat基因的rna的逆转录产物在含有荧光试剂的体系中酶切反应后的产物荧光矫正值；和/或，所述表达谱包括待测的母体样本中相应基因相对于基线过量表达；和/或，所述表达谱包括待测的母体样本中相应基因相对于基线不足表达；和/或，所述基线是足月分娩的母体样本中相应基因的表达谱。8.一种预测早产的方法，其特征在于，包括：分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述基因包括表1所示基因中的至少一种；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因、p2ry10基因、tmem159基因中的至少一种；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的至少一种；和/或，所述基因包括lmcd1基因、snapc1基因、retsat基因中的全部；和/或，所述表达谱为相应基因经酶切反应后的荧光值；和/或，所述表达谱为相应基因在母体样本中的rna的逆转录产物经过酶切反应后的荧光值；和/或，所述荧光值为荧光矫正值；和/或，所述酶切反应为等温反应；和/或，酶切反应体系含有权利要求1～2任意一项所述核苷酸和/或权利要求3～4任意一项所述试剂盒中的组分。10.一种等温酶切反应方法，其特征在于，包括：将待测模板在等温条件下进行酶切反应，在酶切反应过程中和/或结束时采集荧光值。11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，采集荧光值的时间点为第30～120分钟中的某一时间点或某一时间段；和/或，采集荧光值的时间点为第90分钟；和/或，所述酶切反应的温度为35～42℃，优选为37℃；和/或，所述酶切反应体系中含有权利要求1～2任意一项所述核苷酸和/或权利要求3～4任意一项所述试剂盒中的组分。12.一种预测早产的系统，其特征在于，包括：早产分析装置，用于分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。
技术总结
一种多核苷酸、试剂盒、等温检测方法及预测早产的方法，预测早产的方法包括：分析母体样本中的任意一种或至少两种基因的组套的表达谱，根据所述表达谱预测受试者是否早产。本发明首次检测孕妇血清中有标志作用的基因表达量，用于无临床症状的孕妇的早产风险预测。主要优势在于血清学检测，无须像超声一样提前预约，无创检测，不需要阴道或者宫颈口取样，检测流程体验好。测流程体验好。测流程体验好。
