高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用
1.本发明具体涉及高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
2.四氢嘧啶属于杂环氨基酸，是一种极性、易溶且生理ph范围内不带电荷的相容性溶质，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能。由于四氢嘧啶易于在蛋白质表面形成水化层，可以缓解高渗、高温、冻融、干燥、辐射和化学试剂对dna双螺旋结构和蛋白质、生物膜及整个细胞的毒害作用，能够稳定细胞膨胀压力但不影响细胞正常生理功能，是微生物细胞的能源物质、渗透压调节物质和细胞及大分子物质的生物保护剂，因此，在化妆品、生物技术和医药行业等领域应用广泛。
3.四氢嘧啶的生产方法是微生物发酵法和细胞转化法。目前，发酵法主要是以葡萄糖为底物利用嗜盐微生物采用“细菌挤奶”工艺进行生产，通过高盐诱导合成、低盐刺激促进释放，渗透压多次循环冲击实现四氢嘧啶的胞内积累和分泌。“细菌挤奶法”虽然可以获得较高的产量，但复杂的工艺流程对生产设备的要求高，高盐浓度的培养基不仅会腐蚀设备而且会增加下游纯化的难度，导致生产成本居高不下。细胞转化法是以l-天冬氨酸盐和甘油为底物利用重组微生物或者静息细胞进行催化合成，然而以l-天冬氨酸盐为底物，虽然避免了“细菌挤奶法”的一些弊端，但由于四氢嘧啶的生物合成过程中需要大量谷氨酸和乙酰辅酶a作为辅因子，细胞转化法得率低，生产成本较高。利用大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌在低盐条件下发酵葡萄糖合成四氢嘧啶，由于代谢途径长，碳代谢流分配不均，碳原子经济性差，产量不高，严重制约了重组菌用于发酵葡萄糖生产四氢嘧啶的工业化生产和大规模应用。因此，构建新型的四氢嘧啶高产菌株，平衡葡萄糖的碳流分配，提高碳原子经济性，降低生产成本，对四氢嘧啶的应用有重要的实践意义，同时也是生产四氢嘧啶的重要研究方向。
4.专利号为zl201510410080.2的中国专利公开了一种产生四氢嘧啶的基因工程菌及其构建方法与应用，具体公开了利用lysa、thra、iclr三个基因缺陷的大肠杆菌表达来源于伸长盐单胞菌ectabc基因簇，并利用lac启动子强化谷氨酸棒状杆菌lysc基因的表达，trc启动子增强ppc基因的表达，但是重组菌发酵 20-28h后，四氢嘧啶产量为12-18g/l；公开号为cn109182236a的中国专利公开了一种重组大肠杆菌及合成四氢嘧啶的应用，具体公开了重组大肠杆菌是将大肠杆菌e.coli mg1655的二氨基庚二酸脱羧酶lysa基因敲出，并导入核苷酸序列为seq id no.1所示四氢嘧啶合成基因簇ectabc获得的，并将重组大肠杆菌应用在转化合成四氢嘧啶中，以l-天冬氨酸钠为底物，生物转化制备四氢嘧啶，但是利用该专利的基因重组构建大肠杆菌，进行四氢嘧啶合成的最高转化率仅为35％。
技术实现要素：
5.本发明目的在于提供高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，并将其应
用在四氢嘧啶的生产中，能够实现四氢嘧啶的高产量、高转化率、低成本且生产工艺简单，为后续工业化生产四氢嘧啶奠定基础。
6.本发明的技术方案如下：
7.本发明目的之一在于提供高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到高产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；
8.所述二氨基丁酸氨基转移酶(ectb)基因编码氨基酸序列是seq id no.1 的蛋白质或者在seq id no.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸氨基转移酶活性的衍生的蛋白质；
9.所述二氨基丁酸乙酰基转移酶(ecta)基因编码氨基酸序列是seq id no.2 的蛋白质或者在seq id no.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸乙酰基转移酶活性的衍生的蛋白质；
10.所述四氢嘧啶合成酶(ectc)基因编码氨基酸序列是seq id no.3的蛋白质或者在seq id no.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有四氢嘧啶合成酶活性的衍生的蛋白质；
11.进一步的，所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述d1和d2中任一种基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：
12.d1、将丙酮酸激酶i基因pykf敲除，该改造以“δpykf”表示；
13.d2、将丙酮酸激酶ii基因pyka敲除，该改造以“δpyka”表示。
14.进一步的，所述丙酮酸激酶i基因编码氨基酸序列seq id no.4所示的蛋白质；所述丙酮酸激酶ii基因编码氨基酸序列seq id no.5所示的蛋白质；
15.其中，所述丙酮酸激酶i基因为d11-d13中的任一种dna分子：
16.d11、其编码序列是seq id no.10的cdna分子或基因组dna；
17.d12、在严格条件下与d11限定的dna分子杂交且编码所述丙酮酸激酶i 的cdna分子或基因组dna；
18.d13、与d11或d12限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶i的cdna分子或基因组dna；
19.所述丙酮酸激酶ii基因为d21-d23中的任一种dna分子：
20.d21、其编码序列是seq id no.14的cdna分子或基因组dna；
21.d22、在严格条件下与d21限定的dna分子杂交且编码所述丙酮酸激酶ii 的cdna分子或基因组dna；
22.d23、与d21或d22限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述丙酮酸激酶ii的cdna分子或基因组dna；
23.进一步的，所述突变型大肠杆菌还为对野生型大肠杆菌进行下述d3、d4和 d5中任一种基因改造或任意两种基因改造集合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：
24.d3、将l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因thra截短得到保留 l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra*)，该改造以“δthra*”表示；
25.d4、将二氨基庚二酸脱羧酶基因lysa替换为谷氨酸脱氢酶基因gdha，该改造以“δ
lysa::gdha”表示；
26.d5、将l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ii基因metl截短得保留 l-天冬氨酸激酶活性的突变体ii基因(metl
*
)，该改造以“δmetl
*”表示。
27.进一步的，保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因编码氨基酸序列seq id no.6所示的蛋白质；
28.保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ii基因编码氨基酸序列seq id no.7所示的蛋白质；
29.所述二氨基庚二酸脱羧酶基因编码氨基酸序列为seq id no.8的蛋白质；
30.所述谷氨酸脱氢酶基因编码氨基酸序列为seq id no.9的蛋白质；
31.其中，所述l-天冬氨酸激酶突变体i基因为d31-d33中的任一种dna分子：
32.d31、其编码序列是seq id no.11的cdna分子或基因组dna；
33.d32、在严格条件下与d31限定的dna分子杂交且编码所述天冬氨酸激酶突变体i的cdna分子或基因组dna；
34.d33、与d31或d32限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述天冬氨酸激酶突变体i的cdna分子或基因组dna；
35.所述二氨基庚二酸脱羧酶基因为d41-d43中的任一种dna分子：
36.d41、其编码序列是seq id no.12的cdna分子或基因组dna；
37.d42、在严格条件下与d41限定的dna分子杂交且编码所述二氨基庚二酸脱羧酶的cdna分子或基因组dna；
38.d44、与d41或d42限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述二氨基庚二酸脱羧酶的cdna分子或基因组dna；
39.所述谷氨酸脱氢酶基因为d51-d53中的任一种dna分子：
40.d51、其编码序列是seq id no.13的cdna分子或基因组dna；
41.d52、在严格条件下与d51限定的dna分子杂交且编码所述谷氨酸脱氢酶的cdna分子或基因组dna；
42.d53、与d51或d52限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述谷氨酸脱氢酶的cdna分子或基因组dna；
43.所述天冬氨酸激酶突变体ii基因为d61-d63中的任一种dna分子：
44.d61、其编码序列是seq id no.15的cdna分子或基因组dna；
45.d62、在严格条件下与d61限定的dna分子杂交且编码所述天冬氨酸激酶突变体ii的cdna分子或基因组dna；
46.d63、与d61或d62限定的dna分子具有90％或90％以上同一性且编码所述天冬氨酸激酶突变体ii的cdna分子或基因组dna；
47.所述严格条件是在2
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次5min，又于0.5
×
ssc，0.1％sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2 次，每次15min；所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、 98％、99％或100％的同一性；
48.经过上述改造后得到的所述突变型大肠杆菌如下所示：
49.所述突变型大肠杆菌d1为对所述野生型大肠杆菌进行d1、d3和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高
丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra
*
基因)，并将二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa 基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykfδthra
*
δlysa::gdha”表示；
50.所述突变型大肠杆菌d2为对所述野生型大肠杆菌进行d2、d5和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因(metl
*
基因)，并将二氨基庚二酸脱羧酶基因 (lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykaδmetl
*
δlysa::gdha”表示；
51.所述突变型大肠杆菌d3为对所述野生型大肠杆菌进行d2、d3和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra
*
基因)，并将二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa 基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykaδthra
*
δlysa::gdha”表示；
52.所述突变型大肠杆菌d4为对所述野生型大肠杆菌进行d1、d5和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除， l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因(metl
*
基因)，并将二氨基庚二酸脱羧酶基因 (lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykfδmetl
*
δlysa::gdha”表示；
53.所述突变型大肠杆菌d5为对所述野生型大肠杆菌进行d1和d3改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因 (thra
*
基因)，该改造以“δpykfδthra
*”表示，具体可将突变型大肠杆菌d11中的l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l
‑ꢀ
天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra*基因)得到突变型大肠杆菌d5；
54.所述突变型大肠杆菌d6为对所述野生型大肠杆菌进行d2和d3改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，l
‑ꢀ
天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因(thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra
*
基因)该改造以“δpykaδthra
*”表示；具体可将突变型大肠杆菌d12中的l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因 (thra基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因(thra*基因)得到突变型大肠杆菌d6；
55.所述突变型大肠杆菌d7为对所述野生型大肠杆菌进行d1和d5改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因 (metl
*
基因)，该改造以“δpykfδmetl
*”表示，具体可将突变型大肠杆菌d11 中的l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留 l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因(metl
*
基因)得到突变型大肠杆菌d7；
56.所述突变型大肠杆菌d8为对所述野生型大肠杆菌进行d2和d5改造得到的野生型
大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，l
‑ꢀ
天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因(metl
*
基因)，该改造以“δpykaδmetl
*”表示，具体可将突变型大肠杆菌d12中的l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ⅱ基因(metl基因)截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ⅱ基因(metl
*
基因)得到突变型大肠杆菌d8；
57.所述突变型大肠杆菌d9为对所述野生型大肠杆菌进行d1和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，将二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykfδlysa::gdha
*”表示；具体可为将d11所述突变型大肠杆菌中的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)得到的突变型大肠杆菌d9；
58.所述突变型大肠杆菌d10为对所述野生型大肠杆菌进行d2和d4改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，将二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)，该改造以“δpykaδlysa::gdha
*”表示；具体可为将d12所述突变型大肠杆菌中的二氨基庚二酸脱羧酶基因(lysa基因)替换为谷氨酸脱氢酶基因(gdha基因)得到的突变型大肠杆菌d10；
59.所述突变型大肠杆菌d11为对所述野生型大肠杆菌进行d1改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶i基因(pykf基因)敲除，该改造以“δpykf”表示；
60.所述突变型大肠杆菌d12为对所述野生型大肠杆菌进行d1改造得到的野生型大肠杆菌突变体，将大肠杆菌的丙酮酸激酶ⅱ基因(pyka基因)敲除，该改造以“δpyka”表示；
61.上述基因敲除、基因替换和基因截短均可通过同源重组实现。
62.进一步的，所述重组载体含有二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因；所述重组载体中启动二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因转录的启动子是 ara启动子，终止二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶基因转录的终止子是rrnb终止子。
63.进一步的，所述重组载体是将核苷酸序列为seq id no.16的dna分子替换载体pbadhisb的xhoi和bglⅱ识别位点间的片段、核苷酸序列为seq idno.17的dna分子替换载体pbadhisb的psti和kpni识别位点间的片段以及核苷酸序列为seq id no.18的dna分子替换载体pbadhisb的ecori和hind
ꢀⅲ
识别位点间的片段进行重组，进而得到重组载体psse。
64.本发明的目的之一还在于提供高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法构建得到的重组菌。
65.本发明的目的之一还在于提供上述构建方法构建的重组菌在以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶中的应用。
66.相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
67.1、本发明构建了新型的能够根据四氢嘧啶的生物合成途径，平衡碳代谢流构建出的以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶的重组菌，在常规发酵条件下， 56小时发酵液中能够积累36-53g/l四氢嘧啶，单位细胞的产率达到 1.21-1.91g/gdcw，葡萄糖摩尔转化率达到0.31-0.38mol/mol，产量、产率和转化率均高于现有工艺。
68.2、本发明中利用构建的重组菌进行以葡萄糖为底物的直接发酵产四氢嘧啶，整个
发酵过程的控制与现有的发酵法和全细胞催化法生产四氢嘧啶盐工艺相比，原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，发酵周期短，操作简便，无需收集菌体提取酶液，且生产效率较高。
附图说明
[0069][0070]
图1为本发明实施例中重组菌epk01、epk02、epk03、epk04、epk05、 epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、epk13和大肠杆菌k12转化葡萄糖生成四氢嘧啶的产量示意图；
[0071]
图2为本发明实施例中重组菌epk09在10l发酵中培养合成四氢嘧啶的示意图。
具体实施方式
[0072]
下面结合附图和较佳实施例对本发明做进一步的说明，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0073]
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到；
[0074]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；
[0075]
本发明中野生型大肠杆菌为大肠杆菌k12；下述实施例中的大肠杆菌 k12(tomoya baba，takeshi ara，miki hasegawa，yuki takai，yoshiko okumura， miki baba，kirilla datsenko，masaru tomita，barry l wanner and hirotada mori1. construction of escherichia coli k-12in-frame，single-gene knockout mutants：the keio collection.molecular systems biology.(2006):1-11)，公众可从福建师范大学获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；
[0076]
下述实施例中载体pbad/hisb为invitrogen公司产品，产品目录号为 v430-01；
[0077]
下述实施例中的t4连接酶为thermo公司产品，产品目录号为el0011；
[0078]
下述实施例中的限制性内切酶xhoi、bglⅱ、psti、kpni、ecori、hindⅲ和 dpni均为neb公司产品，产品目录号分别为r0146、r0144、r0140、r3142、 r3101、r3104和r0176；
[0079]
下述实施例中的dh5α感受态细胞为takara公司产品，产品目录号为 d9057a；
[0080]
下述实施例中的pcas质粒购自addgene，产品编号为plasmid#62225(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015， 81:2506-2514)；
[0081]
下述实施例中的ptargetf质粒购自addgene，产品编号为plasmid #62226(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015，81:2506-2514)；
[0082]
下述实施例中应用到的crispr技术参见现有技术(jiang y，chen b，duan c，sun b，yang j，yang s:multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr-cas9 system.appl environ microbiol 2015，81:2506-2514)；
[0083]
实施例1高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建
[0084]
一、构建表达二氨基丁酸氨基转移酶(ectb)、二氨基丁酸乙酰基转移酶 (ecta)和四氢嘧啶合成酶(ectc)编码基因的重组载体
[0085]
将pbadhisb载体的xhoi和bglⅱ识别位点间的dna序列替换为seq idno.16所示的用于编码二氨基丁酸氨基转移酶的dna序列；将psti和kpni识别位点间dna序列替换为seq id no.17所示的用于编码二氨基丁酸乙酰基转移酶的dna序列；将ecori和hindⅲ识别位点间的dna序列替换为seq idno.18所示的用于编码四氢嘧啶合成酶的dna序列，其它dna序列保持不变，得到重组载体psse；从酶切鉴定证明ectb、ecta和ectc基因成功插入到 pbadhisb载体的xhoi和hindⅲ识别位点间；重组载体psse可表达seq idno.1所示的二氨基丁酸氨基转移酶，seq id no.2所示的二氨基丁酸乙酰基转移酶，seq id no.3所示的四氢嘧啶合成酶。
[0086]
二、构建弱化乙酰辅酶a(accoa)合成的突变型大肠杆菌d11菌株 k12δpykf和突变型大肠杆菌d12菌株k12δpyka
[0087]
(1)制备电转感受态细胞：将pcas质粒利用化学转化法转化大肠杆菌 k12，在含卡那霉素的lb平板(卡那霉素浓度为50μg/ml)上30℃培养筛选阳性克隆，阳性克隆接种在含2g/l阿拉伯糖的lb液体培养基中30℃培养至od
600
约为0.6后，制备电转感受态细胞；
[0088]
(2)构建ptarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org选取敲除pykf和pyka基因的n20，设计引物构建ptarget质粒，以ptargetf为模板，分别用引物对ptarget-pykf-f和ptarget-pyka-r、ptarget-pykf-f’和 ptarget-pyka-r’进行pcr扩增，获得大小约为2100bp的片段，用dpni甲基化酶消化约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌dh5感受态，在含链霉素的lb平板(链霉素浓度为50μg/ml)上筛选阳性克隆，并用引物ptarget-cexu-f 测序验证，测序正确后命名为ptarget-pykf和ptarget-pyka；
[0089]
所用引物序列如下(下划线所示为n20的序列)：
[0090]
ptarget-pykf-f：5
’‑
gacggcatcatggttgcgcggttttagagctagaaatagc-3’；
[0091]
ptarget-pykf-r：5
’‑
cgcgcaaccatgatgccgtcactagtattatacctaggac-3’；
[0092]
ptarget-pykf-f’：5
’‑
tgcgcgtcagctaaaccgaggttttagagctagaaatagc-3’； ptarget-pyka-r’：5
’‑
ctcggtttagctgacgcgcaactagtattatacctaggac-3’；
[0093]
(3)扩增打靶片段：分别用引物对pykf-up-f和pykf-up-r，pykf-down-f 和pykf-down-r，或pyka-up-f和pyka-up-r，pyka-down-f和pyka-down-r进行pcr扩增，分别得到大小约为500bp的片段；分别以上述两个片段的混合物为模板，用引物对pykf-up-f和pykf-down-r，或pyka-up-f和pyka-down-r进行pcr扩增，分别得到大小约为1000bp的pykf或pyka打靶片段，回收打靶片段，打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，只剩21bp的pykf 或pyka突变基因和500bp下游同源臂：
[0094]
所用引物序列如下：
[0095]
pykf-up-f：5
’‑
agcacaactttaccgacaactct-3’；
[0096]
pykf-up-r：5
’‑
gacgtgaacagatgccatgacagtcttagtctttaagttgagaagga-3’；
[0097]
pykf-down-f：5
’‑
taagactgtcatggcatctgttcacgtcctgtaatattg-3’；
[0098]
pykf-down-r：5
’‑
catctttagcagcctgaacgt-3’；
[0099]
pyka-up-f：5
’‑
tccggtggtgtactccgatg-3’；
[0100]
pyka-up-r：5
’‑
tactctaccgttaaaatacgcatgtaatactccgttgactgaaacaac-3’；
[0101]
pykf-down-f：5
’‑
gagtattacatgcgtattttaacggtagagtaagtacgttgc-3’；
[0102]
pykf-down-r：5
’‑
acggtattaaaccattcatccagtcg-3’；
[0103]
(4)电转化：将200ng的ptarget-pykf或ptarget-pyka质粒，400ng的pykf 或pyka打靶片段与100μl步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm 的电转杯中，2.5kv电击，加入1ml lb液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的lb平板上(卡那霉素浓度为50μg/ml，链霉素浓度为50μg/ml)， 30℃培养，筛选阳性克隆，用引物对pykf-up-f和pykf-down-r，或pyka-up-f 和pykf-down-r进行pcr扩增，将扩增片段测序验证；
[0104]
(5)消除ptarget质粒：将测序验证正确的含有pcas质粒的突变型大肠杆菌菌株k12δpykf和k12δpyka接种在lb液体培养基中，37℃培养过夜以消除 pcas质粒；将过夜培养后的菌株在lb固体平板上划线，37℃过夜培养，得到突变型大肠杆菌d11菌株k12δpykf和突变型大肠杆菌d12菌株k12δpyka。
[0105]
三、构建弱化赖氨酸合成代谢途径的突变型大肠杆菌d9菌株 k12δpykfδlysa::gdha和突变型大肠杆菌d10菌株k12δpykfδlysa::gdha
[0106]
(1)将经过上述步骤(5)获得的含有pcas质粒的突变型大肠杆菌d11菌株k12δpykf和突变型大肠杆菌d12菌株k12δpyka接种在含2g/l阿拉伯糖的 lb液体培养基中30℃培养至od
600
约为0.6后，制备电转感受态细胞；
[0107]
(2)构建ptarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org 选取敲除lysa基因的n20，设计引物构建ptarget质粒；以ptargetf为模板，分别用引物对ptarget-lysa-f和ptarget-lysa-r进行pcr扩增，获得大小约为 2100bp的片段，用dpni甲基化酶消化约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌dh5感受态，在含链霉素的lb平板(链霉素浓度为50μg/ml)上筛选阳性克隆，并用引物ptarget-cexu-f测序验证，测序正确后命名为ptarget-lysa：
[0108]
所用引物序列如下(下划线所示为n20的序列)：
[0109]
ptarget-lysa-f：5
’‑
gtgtggtgctatggtgcgtcgttttagagctagaaatagc-3’；
[0110]
ptarget-lysa-r：5
’‑
gacgcaccatagcaccacacactagtattatacctaggac-3’；
[0111]
ptarget-cexu-f：5
’‑
ctttcctgcgttatcccctg-3’；
[0112]
(3)扩增打靶片段：分别用引物对lysa-up-f和lysa-up-r，gdha-f和 gdha-r，lysa-down-f和lysa-down-r进行pcr扩增，分别得到大小约为 500bp，1300bp和500bp的片段，以三个片段的混合物为模板，用引物对 lysa-up-f和lysa-down-r进行pcr扩增，得到大小约为2300bp的lysa::gdha 打靶片段，回收打靶片段，打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，gdha基因和500bp下游同源臂：
[0113]
所用引物序列如下：
[0114]
lysa-up-f：5
’‑
tcttcaagtagcggtgattcctgg-3’；
[0115]
lysa-up-r：5
’‑
gaatatgtctgatccataacaaactccagataagtgcttttttatgattacg-3’；
[0116]
gdha-f：5
’‑
gcacttatctggagtttgttatggatcagacatattctctggagtca-3’；
[0117]
gdha-r：5
’‑
ccagcgactaaccgcagttaaatcacaccctgcgccag-3’；
[0118]
lysa-down-f：5
’‑
ctggcgcagggtgtgatttaactgcggttagtcgctgg-3’；
[0119]
lysa-down-r：5
’‑
ccgcattggttatctgtgctctaac-3’；
[0120]
(4)电转化：将200ng的ptarget-lysa质粒，400ng的lysa::gdha打靶片段与100μl步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中， 2.5kv电击，加入1ml lb液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的 lb平板上(卡那霉素浓度为50μg/ml，链
霉素浓度为50μg/ml)，30℃培养，筛选阳性克隆，用引物对lysa-up-f和lysa-down-r进行pcr扩增，将扩增片段测序验证；
[0121]
(5)消除ptarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mm iptg和卡那霉素的lb液体培养基中30℃培养过夜以消除ptarget-lysa质粒；过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的lb固体平板上划线，30℃培养过夜，得到含有pcas质粒的突变型大肠杆菌d9菌株k12δpykfδlysa::gdha或突变型大肠杆菌d10菌株k12δpykaδlysa::gdha；
[0122]
(6)消除pcas质粒：将测序验证正确的含有pcas质粒的大肠杆菌突变体 k12δpykfδlysa::gdha或k12δpykaδlysa::gdha接种在lb液体培养基中，37℃培养过夜以消除pcas质粒，将过夜培养后的菌株在lb固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到突变型大肠杆菌d9菌株k12δpykfδlysa::gdha或突变型大肠杆菌d10菌株k12δpykaδlysa::gdha。
[0123]
四、构建弱化高丝氨酸合成代谢途径的突变型大肠杆菌d5菌株 k12δpykfδthra
*
、突变型大肠杆菌d6菌株k12δpykaδthra
*
、突变型大肠杆菌 d7菌株k12δpykfδmetl
*
和突变型大肠杆菌d8菌株k12δpykaδmetl
*
[0124]
(1)构建ptarget质粒：利用网站https://crispy.secondarymetabolites.org 选取截断thra和metl基因的n20，设计引物构建ptarget质粒；以ptargetf 为模板，分别用引物对ptarget-thra-f和ptarget-thra-r，ptarget-metl-f和 ptarget-metl-r进行pcr扩增，获得大小约为2100bp的片段；用dpni甲基化酶消化约3h后，直接利用化学转化法转化大肠杆菌dh5α感受态，在含链霉素的lb平板(链霉素浓度为50μg/ml)上筛选阳性克隆，并用引物 ptarget-cexu-f测序验证，测序正确后命名为ptarget-thra和ptarget-metl；
[0125]
所用引物序列如下(下划线所示为n20的序列)：
[0126]
ptarget-thra-f：5
’‑
cgaaggcatgagtttctccggttttagagctagaaatagc-3’；
[0127]
ptarget-thra-r：5
’‑
cggagaaactcatgccttcgactagtattatacctaggac-3’；
[0128]
ptarget-metl-f：5
’‑
tggctgttcctgcaattcgagttttagagctagaaatagc-3’； ptarget-metl-r：5
’‑
tcgaattgcaggaacagccaactagtattatacctaggac-3’；
[0129]
(2)扩增打靶片段：分别用引物对thra-up-f和thra-up-r，thra-down-f 和thra-down-r，或metl-up-f和metl-up-r，metl-down-f和metl-down-r 进行pcr扩增，分别得到大小约为500bp的片段；分别以上述两个片段的混合物为模板，分别用引物对thra-up-f和thra-down-r，或metl-up-f和 metl-down-r进行pcr扩增，分别得到大小约为1000bp的thra或metl打靶片段，回收打靶片段；打靶片段从上游到下游依次包含500bp上游同源臂，只剩1413bp的thra或1392bp的metl突变基因和500bp下游同源臂；
[0130]
所用引物序列如下：
[0131]
thra-up-f：5
’‑
tcctacttcggcgctaaagttct-3’；
[0132]
thra-up-r：5
’‑
cggggcataaactttaaccatgtcacacaaacacttcgataacctgatcgg-3’；
[0133]
thra-down-f：5
’‑
ccgatcaggttatcgaagtgtttgtgtgacatggttaaagtttatgccccg-3’；
[0134]
thra-down-r：5
’‑
aatagcaggcgtgaatgaagcc-3’；
[0135]
metl-up-f：5
’‑
aggttccacgcgcattgaac-3’；
[0136]
metl-up-r：5
’‑
taaatttctgaaattacaataccaggccgatgcgt-3’；
[0137]
metl-down-f：5
’‑
gtattgtaatttcagaaatttaataatgcccggtactcatgt-3’；
[0138]
metl-down-r：5
’‑
gcaagtaagatgcggtgccg-3’；
[0139]
(3)电转化：将200ng的ptarget-thra或ptarget-metl质粒，400ng的 thra或metl打靶片段与100μl步骤(1)制备的电转化感受态细胞混合，置于2mm的电转杯中，2.5kv电击，加入1ml lb液体培养基30℃复苏后涂布在含卡那霉素和链霉素的lb平板上(卡那霉素浓度为50μg/ml，链霉素浓度为50μg/ml)，30℃培养，筛选阳性克隆；用引物对thra-up-f和thra-down-r，或metl-up-f和metl-down-r进行pcr扩增，将扩增片段测序验证；
[0140]
(4)消除ptarget质粒：将测序验证正确的阳性克隆接种在含有0.1mm iptg和卡那霉素的lb液体培养基中30℃培养过夜以消除ptarget-thra或 ptarget-metl质粒；过夜培养后的菌株在含有卡那霉素的lb固体平板上划线， 30℃培养过夜，得到含有pcas质粒的突变型大肠杆菌d5菌株、突变型大肠杆菌d6菌株、突变型大肠杆菌d7菌株和突变型大肠杆菌d8菌株；
[0141]
(6)消除pcas质粒：将测序验证正确的含有pcas质粒的突变型大肠杆菌 d5菌株、d6菌株、d7菌株和d8菌株接种在lb液体培养基中，37℃培养过夜以消除pcas质粒；将过夜培养后的菌株在lb固体平板上划线，37℃培养过夜培养，得到突变型大肠杆菌d5菌株k12δpykfδthra
*
、突变型大肠杆菌d6菌株k12δpykaδthra
*
、突变型大肠杆菌d7菌株k12δpykfδmetl
*
和突变型大肠杆菌d8菌株k12δpykaδmetl
*
。
[0142]
五、构建积累asa的突变型大肠杆菌d1菌株k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d2菌株k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d3菌株k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d4菌株
[0143]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha
[0144]
(1)消除ptarget质粒：从构建弱化高丝氨酸合成代谢途径的突变型大肠杆菌菌株的步骤中步骤(4)的平板上挑取单克隆的突变体k12δpykfδthra
*
、 k12δpykaδmetl
*
、k12δpykaδthra
*
和k12δpykaδthra*，制备电转感受态细胞，按照构建弱化赖氨酸合成代谢途径的突变型大肠杆菌菌株的步骤中步骤(2)和(3)获得的ptarget-lysa质粒和lysa::gdha打靶片段混合，并重复构建弱化赖氨酸合成代谢途径的突变型大肠杆菌菌株的步骤中步骤(4)和(5)，得到含有pcas质粒的突变型大肠杆菌d1菌株、d2菌株、d3菌株和d4菌株；
[0145]
(2)消除pcas质粒：将测序验证正确的含有pcas质粒的突变型大肠杆菌 d1菌株、d2菌株、d3菌株和d4菌株接种在lb液体培养基中，37℃培养过夜以消除pcas质粒，将过夜培养后的菌株在lb固体平板上划线，37℃培养过夜，最终得到d1菌株k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d2菌株 k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d3菌株
[0146]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha、突变型大肠杆菌d4菌株
[0147]
k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha。
[0148]
六、构建转化葡萄糖生产四氢嘧啶的重组菌
[0149]
采用氯化钙法将获得的重组载体psse导入构建的突变型大肠杆菌d11菌株、突变型大肠杆菌d12菌株、突变型大肠杆菌d9菌株、突变型大肠杆菌d10 菌株、突变型大肠杆菌d5菌株、突变型大肠杆菌d7菌株、突变型大肠杆菌d6 菌株、突变型大肠杆菌d8菌株、突变型
大肠杆菌d1菌株、突变型大肠杆菌d4 菌株、突变型大肠杆菌d3菌株、突变型大肠杆菌d2菌株和野生型大肠杆菌k12 中，在含有氨卞青霉素的平板上筛选阳性克隆子，将得到的阳性克隆子分别命名为psse/k12δpykf(菌株编号为epk01)、psse/k12δpyka(菌株编号为 epk02)、psse/k12δpykfδlysa::gdha(菌株编号为epk03)、 psse/k12δpykaδlysa::gdha(菌株编号为epk04)、psse/k12δpykfδthra
*
(菌株编号为epk05)、psse/k12δpykfδmetl
*
(菌株编号为epk06)、 psse/k12δpykaδthra
*
(菌株编号为epk07)、psse/k12δpykaδmetl
*
(菌株编号为epk08)、psse/k12δpykfδthra
*
δlysa::gdha(菌株编号为epk09)、 psse/k12δpykfδmetl
*
δlysa::gdha(菌株编号为epk10)、 psse/k12δpykaδthra
*
δlysa::gdha(菌株编号为epk11)、 psse/k12δpykaδmetl
*
δlysa::gdha(菌株编号为epk12)和psse/k12(菌株编号为epk13)。
[0150]
实施例2
[0151]
一、转化葡萄糖生产四氢嘧啶的重组菌的诱导培养分别将经过实施例1获得的高产四氢嘧啶的重组菌epk01、epk02、epk03、 epk04、epk05、epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、 epk13和大肠杆菌k12划线到含有质量浓度为1.5％的琼脂和质量浓度为 100μg/ml的氨卞青霉素的lb平板上，37℃培养12h；挑取平板上的单菌落，接种到含有质量浓度为100μg/ml的液体lb培养基中，37℃过夜振荡培养，转速为220rpm；将过夜培养物以1％(体积百分比)的接种量接种至自诱导培养基zym中，在转速为200rpm，30℃条件下振荡16h，分别获得诱导后的epk01菌株、epk02菌株、epk03菌株、epk04菌株、epk05菌株、epk06 菌株、epk07菌株、epk08菌株、epk09菌株、epk10菌株、epk11菌株、 epk12菌株、epk13菌株和k12菌株，其中，k12菌株培养过程中没有添加抗生素
[0152]
二、重组菌转化葡萄糖产四氢嘧啶
[0153]
分别将经过实施例1获得的高产四氢嘧啶的重组菌epk01、epk02、 epk03、epk04、epk05、epk06、epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、 epk12、epk13和大肠杆菌k12于4℃，8000g条件下离心10min，收集菌体；再用浓度为10mm的氯化钠水溶液洗涤菌体1次后以相同的离心条件再次收集菌体，分别获得洗涤后的epk01、epk02、epk03、epk04、epk05、epk06、 epk07、epk08、epk09、epk10、epk11、epk12、epk13和大肠杆菌；分别将洗涤后的上述菌株重悬于含有浓度为100mm葡萄糖的pbs缓冲液中(ph为 7.0)，获得上述菌株的转化液，转化液中菌体含量以湿重计为15g/l；最后将转化液在30℃，转速为100rpm的条件下进行葡萄糖到四氢嘧啶的转化，转化时间为9h；
[0154]
不同菌株的四氢嘧啶产量参见图1，从图中可以看出，阳性对照株epk13 转化9h，四氢嘧啶产量仅为3.69mm；大肠杆菌k12转化9h，仍然检测不到四氢嘧啶的产生；菌株epk01和epk02转化9h，四氢嘧啶产量分别为4.79mm 和4.14mm，分别比比epk13提高了29.81％和12.20％；菌株epk03和epk04 转化9h，四氢嘧啶产量分别为9.87mm和8.29mm，分别比epk01和epk02 菌株提高了106.05％和100.24％；菌株epk05和epk06转化9h，四氢嘧啶产量分别为11.46mm和8.13mm，分别比epk01提高了139.25％和69.73％；菌株 epk07和epk08转化9h，四氢嘧啶产量分别为10.26mm和7.62mm，分别比 epk02提高了147.83％和84.06％；菌株epk09、epk10、epk11和epk12转化 9h，四氢嘧啶产量分别为19.74mm、13.73mm、17.94mm和12.82mm，分别比epk05、epk06、epk07和epk08菌株提高了72.25％、68.88％、74.85％和 68.24％；其中，菌株epk09的产量最高，提高了葡萄糖的摩尔转化率。
[0155]
实施例3高密度培养重组菌株epk09产四氢嘧啶
[0156]
从-80℃冰箱的保种管中吸取1.2ml的epk09菌液接种到120ml含有质量浓度为100μg/ml氨卞青霉素的液体lb培养基中，37℃振荡培养8h，转速 220rpm；将培养物以2％(体积百分比)的接种量接种至装有6l基础培养基的 10l发酵罐中，培养温度为37℃，通过流加氨水将ph维持在7.0左右，通气比为0.8-1vvm，转速与溶氧关联，维持溶氧不低于20％；发酵12h后开始流加补料培养基，维持发酵液中葡萄糖浓度在0.5-1g/l；培养od
600
到50时降温至30℃，加入阿拉伯糖至质量终浓度为20％进行诱导，间隔取样测量生物量和罐中四氢嘧啶产量，发酵周期56h；
[0157]
10l发酵罐的发酵过程曲线参见图2，发酵12h菌体od
600
值达到18.6，残糖浓度降到0.1g/l以下开始补糖，随着葡萄糖的流加，发酵液的菌浓稳步增长， 18h菌体od
600
值达到51.7，加入阿拉伯糖开始诱导，菌体开始大量合成四氢嘧啶，发酵56h共消耗葡萄糖201.67g/l，四氢嘧啶产量达到53.22g/l，葡萄糖摩尔转化率为0.36mol/mol；菌体密度od
600
达到99.8，细胞干重约为29.74g/l，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.79g/g dcw；而对照菌株epk13采用同样的培养条件发酵56h四氢嘧啶的产量仅为7.24g/l。
[0158]
实施例4高密度培养重组菌株epk10、epk11和epk12产四氢嘧啶
[0159]
按照实施例3所述的培养方法在10l发酵罐中培养重组菌株epk10、epk11 和epk12；重组菌株epk10发酵56h共消耗葡萄糖168.32g/l，四氢嘧啶产量达到41.27g/l，葡萄糖摩尔转化率为0.31mol/mol，菌体密度od
600
达到113.2，细胞干重约为33.64g/l，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.23g/g dcw，其中，对照菌株epk13采用同样的培养条件发酵56h四氢嘧啶的产量仅为6.93g/l；重组菌株epk11发酵56h共消耗葡萄糖156.18g/l，四氢嘧啶产量达到46.83g/l，葡萄糖摩尔转化率为0.38mol/mol，菌体密度od
600
达到85.6，细胞干重约为24.48 g/l，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.91g/g dcw，其中，对照菌株epk13采用同样的培养条件发酵56h四氢嘧啶的产量仅为7.07g/l；重组菌株epk12发酵 56h共消耗葡萄糖145.34g/l，四氢嘧啶产量达到36.45g/l，葡萄糖摩尔转化率为0.32mol/mol；菌体密度od
600
达到100.7，细胞干重约为30.21g/l，单位菌体的四氢嘧啶产量达到1.21g/g dcw，其中，对照菌株epk13采用同样的培养条件发酵56h四氢嘧啶的产量仅为7.16g/l。
[0160]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
技术特征：
1.高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：将二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因通过重组载体导入受体菌得到用于产四氢嘧啶的重组菌；所述受体菌为突变型大肠杆菌或野生型大肠杆菌；所述二氨基丁酸氨基转移酶基因编码氨基酸序列为seq id no.1的蛋白质或者由seq id no.1所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸氨基转移酶活性的衍生蛋白；所述二氨基丁酸乙酰基转移酶基因编码氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质或者由seq id no.2所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有二氨基丁酸乙酰基转移酶活性的衍生蛋白；所述四氢嘧啶合成酶基因编码氨基酸序列为seq id no.3的蛋白质或者由seq id no.3所示的氨基酸序列中经过取代和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有四氢嘧啶合成酶活性的衍生蛋白。2.如权利要求1所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌为对野生型大肠杆菌进行下述d1和d2中任一种基因改造得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：d1、将丙酮酸激酶i基因pykf敲除；d2、将丙酮酸激酶ii基因pyka敲除。3.如权利要求2所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述突变型大肠杆菌还为对野生型大肠杆菌进行下述d3、d4和d5中任一种基因改造或任意两种基因改造集合得到的所述野生型大肠杆菌的突变体：d3、将l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶i基因截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因；d4、将二氨基庚二酸脱羧酶基因替换为谷氨酸脱氢酶基因；d5、将l-天冬氨酸激酶/高丝氨酸脱氢酶双功能酶ii基因截短得到保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ii基因。4.如权利要求2所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述丙酮酸激酶i基因编码氨基酸序列seq id no.4所示的蛋白质；所述丙酮酸激酶ii基因编码氨基酸序列seq id no.5所示的蛋白质。5.如权利要求3所述的一种高产四氢嘧啶的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于：保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体i基因编码氨基酸序列seq id no.6所示的蛋白质；保留l-天冬氨酸激酶活性的突变体ii基因编码氨基酸序列seq id no.7所示的蛋白质；所述二氨基庚二酸脱羧酶基因编码氨基酸序列为seq id no.8的蛋白质；所述谷氨酸脱氢酶基因编码氨基酸序列为seq id no.9的蛋白质。6.如权利要求1所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述重组载体含有二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因；所述重组载体中启动二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶的编码基因转录的启动子是ara启动子，终止二氨基丁酸氨基转移酶、二氨基丁酸乙酰基转移酶和四氢嘧啶合成酶基因转录的终止子是rrnb终止子。
7.如权利要求6所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法，其特征在于：所述重组载体是将核苷酸序列为seq id no.16的dna分子替换载体pbadhisb的xhoi和bglⅱ识别位点间的片段、核苷酸序列为seq id no.17的dna分子替换载体pbadhisb的psti和kpni识别位点间的片段以及核苷酸序列为seq id no.18的dna分子替换载体pbadhisb的ecori和hindⅲ识别位点间的片段进行重组，进而得到重组载体psse。8.一种按照权利要求1至7任一所述的高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法构建得到的重组菌。9.如权利要求8所述的重组菌在以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶中的应用。
技术总结
本发明公开高效转化葡萄糖生产四氢嘧啶重组菌的构建方法及应用，重组菌是根据四氢嘧啶的生物合成途径，平衡磷酸烯醇式丙酮酸到草酰乙酸和丙酮酸的碳代谢流分配构建出的以葡萄糖为底物直接发酵生产四氢嘧啶的重组菌株，在常规发酵条件下，56小时发酵液中能够积累36-53g/L四氢嘧啶，单位细胞的产率达到1.21-1.91g/g DCW，葡萄糖摩尔转化率达到0.31-0.38mol/mol，产量、产率和转化率均高于现有工艺；本发明提供的重组菌用于发酵产四氢嘧啶的过程控制与现有的发酵法和全细胞催化法生产四氢嘧啶盐工艺相比，原料成本较低，培养条件简单，设备损耗小，发酵周期短，操作简便，无需收集菌体提取酶液，四氢嘧啶生产效率较高。四氢嘧啶生产效率较高。四氢嘧啶生产效率较高。
