包含蛋白酶的高碱性纺织品洗涤剂的制作方法
包含蛋白酶的高碱性纺织品洗涤剂
1.本发明涉及洗涤剂领域，特别是包含至少一种酶的洗涤剂领域。本发明涉及一种纺织品洗涤剂，特别是液体纺织品洗涤剂，其包含至少一种蛋白酶和至少一种洗涤剂成分，其中所述蛋白酶的氨基酸序列已经被修饰，特别是为了应用于纺织品洗涤剂而修饰，所述纺织品洗涤剂具有约9至约12的ph值。本发明还包括相应的洗涤方法、本文描述的试剂的用途和蛋白酶在ph值为约9至约12的纺织品洗涤剂中的用途，以及蛋白酶在ph值为约9至约12的纺织品洗涤剂中用于去除纺织品上的蛋白酶敏感污渍的用途。
2.数十年来，在现有技术中已经确立了在洗涤剂中使用酶。它们用于根据它们的特殊活性扩展相关试剂的性能范围。这些特别包括水解酶如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶。前三种提及的酶水解蛋白质、淀粉和脂肪，从而直接有助于去除污垢。由于纤维素酶对织物的作用，因此特别使用纤维素酶。另一组洗涤剂酶是氧化性的酶，特别是氧化酶，其任选与其它组分一起优选用于漂白污渍或原位产生漂白剂。除这些经历不断优化的酶之外，还不断提供用于洗涤剂中的其它酶，例如果胶酶、β-葡聚糖酶、甘露聚糖酶或其它半纤维素酶(糖苷酶)，特别是为了能够最佳地处理特定的污渍，特别是水解特定的植物聚合物。
3.蛋白酶是几乎所有现代有效洗涤剂包含的历史最悠久的酶。这使它们成为技术上最重要的酶之一。这些之中，枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)型的蛋白酶(枯草杆菌酶(subtilases)、枯草杆菌肽酶(subtilopeptidases)、ec 3.4.21.62)又是特别重要的，其由于催化活性氨基酸而是丝氨酸蛋白酶。它们起非特异性内肽酶的作用，并水解位于肽或蛋白质内部的任何酰胺键。它们的最佳ph值通常在约ph9的碱性范围内。例如，r.siezen的文章"subtilases：subtilisin-like proteases"，"subtilisin enzymes"第75-95页，r.bott和c.betzel编辑，new york，1996中给出了该家族的综述。枯草杆菌酶是由微生物天然形成的。特别是，由芽孢杆菌(bacillus)物种形成和分泌的枯草杆菌蛋白酶是枯草杆菌酶中最重要的一类。
4.在洗涤剂中优选使用的枯草杆菌蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶bpn'和carlsberg、蛋白酶pb92、枯草杆菌蛋白酶147和309、来自迟缓芽孢杆菌(bacillus lentus)的蛋白酶、特别是来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483的蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶dy和热蛋白酶(thermitase)、蛋白酶k和蛋白酶tw3和tw7，这些可归类为枯草杆菌酶，但不再是狭义的枯草杆菌蛋白酶，以及其氨基酸序列相对于起始蛋白酶已修饰的所述蛋白酶的变体。
5.国际专利申请wo 95/23221 a1、wo 92/21760 a1和wo 2013/060621 a1公开了来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483的蛋白酶的变体，其适合用于洗涤剂或清洁剂中。此外，国际专利申请wo 2011/032988 a1和wo 2016/096714 a1以及欧洲专利申请ep 3044302 a1公开了含有来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483的蛋白酶变体的洗涤剂和清洁剂。除其他位置之外，这些文献中公开的蛋白酶变体可以在来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483的蛋白酶的编号中的位置3、4、99和/或199处被修饰，并且例如在所述位置处具有氨基酸3t、4i、99e或199i。然而，并没有在这些文献中发现如下文所述的其它修饰的组合。特别是，从这些文献中没有发现某些迟缓芽孢杆菌蛋白酶变体适合用于高碱性纺织品洗涤剂中。
6.通常，在任何情况下，只有选定的蛋白酶适合用于含表面活性剂的液体制剂中。许
多蛋白酶在这种制剂中不显示出足够的催化性能，或它们不是充分稳定的。因此，对于在纺织品洗涤剂中使用蛋白酶，在洗涤循环条件下具有高催化活性和稳定性是特别期望的。
7.固体纺织品洗涤剂通常具有约8至约10的ph值，而液体纺织品洗涤剂可具有约7至约9的ph值。碱性液体洗涤剂是比较常见的，并且在北美特别流行。然而，碱性ph值使得难以到适合的酶并将其配制在碱性液体洗涤剂中，因为高ph值不仅会对酶的性能产生不利影响，而且还会对它们的储存稳定性产生不利影响。此外，当洗涤剂具有高水含量时，酶在液体洗涤剂中通常不太稳定。
8.因此，现有技术的含蛋白酶和表面活性剂的液体配制剂具有以下缺点：所含的蛋白酶在标准洗涤条件下(例如，在20至40℃的温度范围内)，特别是在较高ph下，不具有令人满意的蛋白水解活性或不具有足够的储存稳定性，因此该配制剂对蛋白酶敏感的污渍不显示出最佳的清洁性能。
9.因此，开发洗涤剂配制剂的一个目标是使用现有技术中已知的方法有选择地或随机地修饰所含的酶，从而优化它们以用于洗涤剂。这些方法包括，例如，点诱变、缺失或插入诱变，或与其它蛋白质或蛋白质片段融合。
10.尽管现有技术中已知许多用于洗涤剂的蛋白酶，但仍需要用于高碱性纺织品洗涤剂，特别是ph值为约9至约12的液体纺织品洗涤剂中的蛋白酶。
11.因此，本发明的目的是进一步改进蛋白酶在高碱性纺织品洗涤剂中的稳定性，从而进一步改进纺织品洗涤剂的清洁性能。
12.令人惊讶地，现已发现，与常规蛋白酶相比和/或与野生型形式(seq id no:1)相比和/或与起始变体(wo 2013/060621 a1的seq id no:2)相比，本文所定义的蛋白酶或与之充分相似的蛋白酶(在序列同一性方面)在储存稳定性方面得到改进，因此特别适合用于ph值为约9至约12的纺织品洗涤剂中。
13.因此，在第一方面，本发明涉及一种纺织品洗涤剂，其包含：a)至少一种蛋白酶，所述蛋白酶具有蛋白水解活性并包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在每种情况下基于seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3t、4i、99e和199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，特别是选自74d、74e、74q、136q、143l、143w、143y、154d、154q、161t、163g、171l、200a、200l、200s、200t、203k、203v、203w、209w、212s、212t、256d，256e和256q，和b)具有至少一种洗涤剂成分，优选其量为0.01-99.9重量％，所述织物洗涤剂具有约9至约12的ph值，所述ph值在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量。根据本发明的洗涤剂优选是液体纺织品洗涤剂。更优选，根据本发明的纺织品洗涤剂在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中的ph为9至12、特别是9.5至11.5、更优选10至11、特别优选ph 10。
14.特别是，当所述纺织品洗涤剂含有至少一种相同或不同类型的其他酶，例如淀粉酶、纤维素酶、脂肪酶、甘露聚糖酶或果胶酶时(其它酶的列举并不完整)，根据本发明的纺织品洗涤剂还显示出超过其它纺织品洗涤剂的性能优势。因此，优选的是，根据本发明的纺织品洗涤剂含有至少一种相同类型的其他酶(即另一种蛋白酶)或不同类型的其他酶。所述洗涤剂优选包含至少一种淀粉酶，所述淀粉酶具有淀粉分解活性且选自：a)α-淀粉酶，其包
含在其整个长度上与seq id no:2中所给出的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且任选在根据seq id no:2的编号中的位置172、202、208、255和261的一个处具有至少一个氨基酸取代，优选选自由m202l、m202v、m202s、m202t、m202i、m202q、m202w、s255n、r172q和它们的组合的组成的组；和/或b)α-淀粉酶，其包含在其整个长度上与seq id no:3中所给出的氨基酸序列至少60％相同的氨基酸序列，和在根据seq id no:3的编号中，任选在位置9、26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、195、202、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、320、323、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、458、461、471、482和484的一个处的至少一个氨基酸取代，和/或在位置183和184之一处的缺失，优选在位置9、26、149、182、186、202、257、295、299、323、339和345的一个处的至少一个氨基酸取代，和/或特别优选选自由r118k、d183*、g184*、n195f、r320k、r458k和它们的组合组成的组的至少一个氨基酸取代或缺失；和/或c)α-淀粉酶，其包含在其整个长度上与seq id no:4中所给出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且任选在根据seq id no:4的编号中的位置93、116、118、129、133、134、140、142、146、147、149、151、152、169、174、183、184、186、189、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、235、243、244、260、262、284、303、304、320、338、347、359、418、431、434、439、447、458、469、476和477的一个处具有至少一个取代和/或缺失，优选在位置183和184处的氨基酸缺失。
15.本发明还涉及一种制备这种纺织品洗涤剂的方法以及一种清洁纺织品的方法，在所述方法中使用根据本发明的洗涤剂。
16.本发明还涉及这种纺织品洗涤剂用于清洁纺织品的用途。
17.本发明还涉及蛋白酶在纺织品洗涤剂中、优选液体纺织品洗涤剂中用于从纺织品去除蛋白酶敏感的污渍的用途，所述蛋白酶在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有：(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3t、4i、99e和199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，特别是选自74d、74e、74q、136q、143l、143w、143y、154d、154q、161t、163g、171l、200a、200l、200s、200t、203k、203v、203w、209w、212s、212t、256d、256e和256q，所述纺织品洗涤剂在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量的ph为约9至约12。
18.特别优选用于根据本发明的试剂、方法和用途的蛋白酶在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据seq id no:1的编号具有：(i)在对应于位置3、4、99或199的位置处的氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，其选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、256d、l256e和l256q组成的组。
19.通过研究以下详细描述和权利要求，本发明的这些和进一步的方面、特征和优点对于本领域技术人员将是清楚的。来自本发明的一个方面的任何特征可以用在本发明的任何其它方面中。此外，将容易理解的是，本文所包含的实施例旨在描述和说明本发明，但不
限制本发明，并且特别地，本发明不限于这些实施例。
20.除非另外表明，所有百分比均为重量百分比(重量％)。
21.以"x至y"格式给出的数值范围包括所述值。如果在该格式中给出多个优选的数值范围，容易理解的是，通过不同端点的组合产生的所有范围同样被包括在内。
22.本文使用的"至少一个"表示一个或多个，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多。
23.本文使用的术语"洗涤剂"与术语"纺织品洗涤剂"或"试剂"同义，表示如说明书中所解释的用于清洁纺织品的组合物。
24.本文关于数值使用的"大约"、"约"或"大致"是指相应的数值
±
10％，优选
±
5％。
25.本文使用的"液体"包括液体和凝胶，以及糊状组合物。优选液体组合物在室温下是可流动的和可倾倒的，但是它们也可以具有流动性极限。
26.本文使用的"高碱性"是指在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量的约9至约12的ph值。
27.本发明基于发明人令人惊讶的发现，即与常规蛋白酶相比和/或与野生型相比和/或与相比于野生型已经改进的起始变体相比，在本文所述位置处的氨基酸取代导致这些修饰的蛋白酶在高碱性洗涤剂中改进的储存稳定性。
28.这是特别令人惊讶的，因为迄今为止没有这种蛋白酶或这种氨基酸取代与相应蛋白酶在高碱性洗涤剂、特别是液体高碱性洗涤剂中的改进的储存稳定性相关联。
29.在优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶的根据本发明的修饰，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处，导致该修饰的蛋白酶在高碱性纺织品洗涤剂(ph 9至12)中改进的储存稳定性。
30.在根据本发明使用的蛋白酶的其它优选实施方式中，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，所述蛋白酶具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，其选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代，其选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
31.在优选实施方式中，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，根据本发明使用的蛋白酶具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，其选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代，其选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组，选自组(i)的至少两个氨基酸取代和选自组(ii)的至少一个氨基酸取代的组合导致该修饰的蛋白酶在高碱性纺织品洗涤剂(ph 9至12)中改进的储存稳定性。
32.在特别优选的实施方式中，根据本发明的洗涤剂含有具有下述氨基酸取代变体之一的蛋白酶：
33.(i)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w；
34.(ii)s3t+v4i+r99e+v199i+n212s；
35.(iii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d；
36.(iv)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+l256e；
37.(v)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+s154d+l256e；
38.(vi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l+y203w；
39.(vii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+y203w+l256e；
40.(viii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+n212s；
41.(ix)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+y203w+l256e；
42.(x)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+y203w；
43.(xi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+l256e；
44.(xii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l；
45.(xiii)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+q200l+y203w；
46.(xiv)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+l256e；
47.(xv)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+r143w+y161t+q200l；
48.(xvi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+r143y+a209w+n212s+l256e；
49.(xvii)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+s154d+v171l+q200l，
50.所述编号在所有情况下基于根据seq id no:1的编号。
51.根据本发明使用的蛋白酶的一些实施方式具有改进的储存稳定性。与常规蛋白酶和/或野生型酶(seq id no:1)和/或蛋白酶的起始变体(wo 2013/060621 a1的seq idno:2)相比，它们在高碱性纺织品洗涤剂中具有提高的稳定性，特别是当储存3天或更多天、4天或更多天、7天或更多天、10天或更多天、12天或更多天、14天或更多天、21天或更多天或28天或更多天时，所述纺织品洗涤剂在20℃在去离子水中1重量％溶液中测量的ph为约9至约12。
52.根据本发明的蛋白酶的某些实施方式可以在高碱性纺织品洗涤剂中具有提高的催化活性，与提高的储存稳定性无关或除提高的储存稳定性之外。在许多实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶可以具有如下蛋白水解活性，所述蛋白水解活性基于野生型(seq id no:1)和/或已经性能改进的起始变体(wo 2013/060621 a1的seq id no:2)为至少101％、102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％或110％。这种性能改进的蛋白酶允许在不同的温度范围内，特别是在20℃至40℃的温度范围内，对蛋白酶敏感的污渍实现改进的洗涤结果。
53.此外，根据本发明使用的蛋白酶的优选实施方式在洗涤剂中具有特别的稳定性，例如相对于表面活性剂和/或漂白剂和/或螯合剂，和/或相对于温度影响，特别是相对于高温，例如50-65℃，特别是60℃，和/或相对于ph值变化和/或相对于变性剂或氧化剂和/或相对于蛋白水解降解和/或相对于氧化还原比的变化。因此，本发明特别优选的实施方式提供了性能改进的蛋白酶变体和/或温度稳定性提高的蛋白酶变体。因此，本发明的进一步特别优选的实施方式提供了性能改进的蛋白酶变体和/或温度稳定性提高的蛋白酶变体。因此，根据本发明的蛋白酶的这种有利的实施方式允许在宽的温度范围内对蛋白酶敏感的污渍实现改进的洗涤结果。
54.根据本发明使用的蛋白酶显示出酶活性，即它们能够水解肽和蛋白质，特别是在洗涤剂中。因此，根据本发明使用的蛋白酶是催化蛋白质/肽底物中的酰胺/肽键水解并因此能够裂解蛋白质或肽的酶。此外，根据本发明的蛋白酶优选是成熟蛋白酶，即没有信号肽和/或前肽的催化活性分子。除非另有说明，所述序列在每种情况下也涉及成熟的(加工的)酶。
55.在本发明的各种实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶是游离的酶。这表示蛋白酶可以与试剂的所有组分直接作用，并且如果试剂是液体试剂，则蛋白酶直接与试剂的溶剂(例如水)接触。在其它实施方式中，试剂可以包含与其它分子形成相互作用复合物或含有"包覆层"的蛋白酶。在这种情况下，单个蛋白酶分子或多个蛋白酶分子可以通过包围结构与试剂的其它组分隔开。这种分隔结构可以来自但不限于囊泡，例如胶束或脂质体。然而，包围结构也可以是病毒颗粒、细菌细胞或真核细胞。在各种实施方式中，试剂可以包括表达根据本发明的蛋白酶的短小芽胞杆菌(bacillus pumilus)或吉氏芽孢杆菌(bacillus gibsonii)或枯草芽胞杆菌(bacillus subtilis)的细胞，或此类细胞的细胞培养上清液。
56.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％和98.8％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
57.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％和98.5％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
58.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％和98％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代，所述至少一个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
59.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％和98.5％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
60.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％和98％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少两个处的至少三个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
61.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％和97.5％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
62.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％和98％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
63.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％和97.5％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
64.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％和97％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
65.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％和97.5％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，所述至少两个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的
组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少四个处的至少四个氨基酸取代，所述至少四个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
66.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％和97％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少三个处的至少三个氨基酸取代，所述至少三个氨基酸取代选自由s3t、v4i、r99e和v199i组成的组，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少四个处的至少四个氨基酸取代，所述至少四个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
67.在本发明的优选实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按照递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％和97％相同，和，在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少四个处的至少四个氨基酸取代，所述至少四个氨基酸取代选自由n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、l256d、l256e和l256q组成的组。
68.在特别优选的实施方式中，根据本发明使用的蛋白酶含有下述氨基酸取代变体之一：
69.(i)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w；
70.(ii)s3t+v4i+r99e+v199i+n212s；
71.(iii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d；
72.(iv)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+l256e；
73.(v)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+s154d+l256e；
74.(vi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l+y203w；
75.(vii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+y203w+l256e；
76.(viii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+n212s；
77.(ix)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+y203w+l256e；
78.(x)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+y203w；
79.(xi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+l256e；
80.(xii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l；
81.(xiii)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+q200l+y203w；
82.(xiv)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+l256e；
83.(xv)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+r143w+y161t+q200l；
84.(xvi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+r143y+a209w+n212s+l256e；
85.(xvii)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+s154d+v171l+q200l，
86.所述编号在所有情况下基于根据seq id no:1的编号。
87.在本发明的上下文中，蛋白酶具有至少一个给定的氨基酸取代的特征表示其在相关位置上含有一个或多个(给定的)氨基酸取代，即至少给定的位置没有另外突变或缺失，例如通过蛋白酶的片段化。
88.通过序列比较确定核酸或氨基酸序列的同一性。该序列比较基于在现有技术中建立和通常使用的blast算法(参见例如altschul等(1990)"basic local alignment search tool."j.mol.biol.215:403-410,和altschul等(1997):"gapped blast and psi-blast:anew generation of protein database search programs"；nucleic acids res.,25,pp.3389-3402)，并且原则上通过将核酸或氨基酸序列中的核苷酸或氨基酸的相似序列相互分配来进行。相关位置的表格分配称为比对。现有技术中可用的另一种算法是fasta算法。序列比较(比对)，特别是多序列比较，是使用计算机程序进行的。例如，经常使用clustal系列(参见例如chenna等(2003)"multiple sequence alignment with the clustal series of programs"，nucleic acid res.31:3497-3500)、t-coffee(参见例如notredame等(2000)"t-coffee:a novel method for multiple sequence alignments"，j.mol.biol.302:205-217)或基于这些程序或算法的程序。使用具有预定标准参数的计算机程序vectorsuite 10.3(invitrogen corporation，1600faraday avenue，carlsbad，california，usa)的序列比较(比对)，以及其用于序列比较的程序是基于clustalw的alignx模块，也是可以的。除非另有说明，本文给出的序列同一性是通过blast算法测定的。
89.这种比较还允许得出关于所比较序列的相似性的结论。它通常以同一性百分比给出，即在所述序列或相应位置的比对中相同的核苷酸或氨基酸官能团的比例。更广泛的同源性概念在氨基酸序列的情况下考虑了保守的氨基酸交换，即具有相似化学活性的氨基酸，因为它们通常在蛋白质中表现相似的化学活性。因此，所比较序列的相似性也可以用同源性百分比或相似性百分比来表示。可以提供关于整个多肽或基因或仅关于个别区域的同一性和/或同源性信息。因此，不同核酸或氨基酸序列的同源或相同区域由序列中的匹配来定义。这种区域通常具有相同的功能。它们可以很小并且仅包含几个核苷酸或氨基酸。通常，此类小区域对蛋白质的整体活性发挥着重要作用。因此，将序列匹配仅与单独的(任选小的)区域相关联可能是有利的。然而，除非另有说明，否则本技术中的同一性或同源性信息是指所指明的特定核酸或氨基酸序列的总长度。
90.在本发明的上下文中，氨基酸位置对应于seq id no:1中的数字标记的位置的表述因此是指在如上定义的比对中，相应的位置与seq id no:1中的数字标记的位置相关联。
91.为了描述正好涉及一个氨基酸位置的取代(氨基酸替换)，这里使用以下惯例：首先，天然存在的氨基酸以国际上使用的单字母代码的形式表示，然后是相关的序列位置，最后是插入的氨基酸。相同多肽链内的多个替换通过斜线分开。对于插入，在序列位置之后命
名额外的氨基酸。在缺失的情况下，缺失的氨基酸用符号如星号或破折号代替，或者在相应位置之前用δ表示。例如，a95g描述在位置95处的丙氨酸被甘氨酸取代，a95ag描述在位置95处的氨基酸丙氨酸之后插入甘氨酸，和a95*或
△
a59描述在位置95处的丙氨酸缺失。该命名法是酶技术领域的技术人员已知的。
92.本发明还涉及包含蛋白酶的洗涤剂，其特征在于，所述蛋白酶可由作为起始分子的根据本发明的蛋白酶通过一次或多次保守氨基酸取代获得。术语"保守氨基酸取代"是指一个氨基酸官能团与另一个氨基酸官能团的替换(取代)，这种替换不会导致替换的氨基酸位置的极性或电荷发生变化，例如一个非极性氨基酸官能团与另一个非极性氨基酸官能团的替换。本发明范围内的保守氨基酸取代包括，例如：g＝a＝s、i＝v＝l＝m、d＝e、n＝q、k＝r、y＝f、s＝t、g＝a＝i＝v＝l＝m＝y＝f＝w＝p＝s＝t。
93.本发明还涉及包含蛋白酶的洗涤剂，其特征在于，所述蛋白酶可由作为起始分子的根据本发明的蛋白酶通过片段化、缺失、插入或取代诱变获得，并且包含在至少190、200、210、220、230、240、250、260、261、262、263、264、265、266、267、268或269个连续氨基酸的长度上与起始分子匹配的氨基酸序列，所述蛋白酶(i)具有在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个氨基酸取代。
94.由此不损失或降低蛋白水解活性的缺失。此外，这种片段化、缺失诱变、插入诱变或替代诱变例如也可以降低相关酶的变应原性，从而提高它们的整体适用性。有利地，酶甚至在诱变后保持它们的蛋白水解活性，即它们的蛋白水解活性至少对应于起始酶的蛋白水解活性，即在一个优选的实施方式中，蛋白水解活性为起始酶活性的至少80％，优选至少90％。其它取代还可以显示出有益效果。单个和多个连续氨基酸都可以被其它氨基酸替换。
95.在这种情况下，氨基酸位置通过将根据本发明的蛋白酶的氨基酸序列与来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的氨基酸序列(如seq id no:1中给出的)比对来定义。此外，位置的分配取决于成熟的蛋白质。特别是，如果根据本发明的蛋白酶的氨基酸序列包含比根据seq id no:1的来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶更高或更低数量的氨基酸官能团，则也将使用这种分配。从来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的氨基酸序列中的所提及的位置开始，根据本发明的蛋白酶中的修饰位置是在比对中精确分配给这些位置的那些。
96.通过比较试验可以进一步确认待修饰的氨基酸的正确分配，即特别是它们的功能对应性，根据该比较试验，在两个比较的蛋白酶中以相同的方式修饰基于比对相互分配的两个位置，并且观察在两种情况下酶活性是否以相同的方式改变。如果例如根据seq id no:1的蛋白酶的特定位置的氨基酸替换伴随着酶参数的改变，例如km值的增加，并且在根据本发明的已通过相同的引入氨基酸实现氨基酸替换的蛋白酶变体中观察到酶参数的相应改变，例如km值的同样增加，则这可以被认为是对正确的分配的确认。
97.根据本发明的蛋白酶可以另外被稳定化，特别是通过一个或多个突变，例如取代，或通过与聚合物偶联。在储存期间和/或在使用期间(例如在洗涤过程中)稳定性的提高导致更长久的酶活性，因此改善清洁性能。原则上，可以考虑现有技术中描述的和/或适合的所有稳定化选项。优选通过酶本身的突变实现的那些稳定化，因为这种稳定化不需要在酶回收后的任何进一步的工作步骤。稳定化的其它可能性例如是：
[0098]-改变金属离子的结合，特别是钙结合位点，例如通过将涉及钙结合的一个或多个
氨基酸替换为一个或多个带负电荷的氨基酸和/或通过在两个氨基酸精氨酸和甘氨酸的序列的至少一个中引入序列改变；
[0099]-通过引起蛋白质表面处或其上的氨基酸序列改变的突变来防止变性剂如表面活性剂的影响；
[0100]-将n-末端附近的氨基酸替换为可能通过非共价相互作用与分子的其余部分接触的那些氨基酸，因而有助于维持球状结构。
[0101]
优选的实施方式是其中酶以几种方式稳定的那些，因为多种稳定突变相加或协同作用。
[0102]
本发明还涉及如上所述的蛋白酶，其特征在于，其具有至少一种化学修饰。具有这种修饰的蛋白酶被称为衍生物，即蛋白酶被衍生化。在本技术的上下文中，衍生物因此被理解为是指纯氨基酸链已被化学修饰的那些蛋白质。这种衍生化可以例如通过表达蛋白质的宿主细胞在体内实现。在这方面，低分子量化合物如脂质或寡糖的偶联特别值得注意。然而，衍生化也可以在体外进行，例如通过氨基酸侧链的化学转化或通过另一化合物与蛋白质共价结合。例如，可以将胺偶联到酶的羧基上以改变等电点。另一种此类化合物也可以是另一种蛋白质，其例如通过双功能化合物与根据本发明的蛋白质结合。衍生化同样可以理解为共价键合到大分子载体上，或者非共价包括到适合的大分子笼状结构中。例如，当偶联的物质是抑制剂时，衍生化可影响底物的特异性或与底物的结合强度，或导致酶活性的暂时阻断。这可能是有利的，例如，对于储存期限而言。这种修饰可以进一步影响稳定性或酶活性。它们还可以用于降低蛋白质的变应原性和/或免疫原性，从而例如提高其皮肤相容性。例如，与大分子化合物例如聚乙二醇的偶联可以改善蛋白质的稳定性和/或皮肤相容性。根据本发明的蛋白质的衍生物也可以在最广义上理解为是指这些蛋白质的制剂。取决于回收、加工或制备，蛋白质可以与各种其他物质组合，例如来自生产微生物的培养物。蛋白质也可以被有意添加到其他物质中，例如，以增加其储存稳定性。因此，根据本发明的蛋白质的所有制剂也是根据本发明的。这也与它是否在特定制剂中实际表现出这种酶活性无关。这是因为可能希望它在储存期间没有活性或只有低活性，并且仅在使用时表现出其酶功能。例如，这可以通过适合的伴随物质来控制。特别是，在这方面，蛋白酶与特定抑制剂的联合制剂是可能的。
[0103]
在所有上述的蛋白酶或蛋白酶变体和/或衍生物中，在本发明的上下文中，特别优选的是与起始变体相比其储存稳定性和/或清洁性能改进的那些，其中清洁性能在洗涤系统中如下所述测定。
[0104]
许多蛋白酶和特别是枯草杆菌蛋白酶形成为所谓的前蛋白，即与前肽和信号肽一起形成，其中信号肽的功能通常在于确保蛋白酶从产生它们的细胞中释放到周质或细胞周围的介质中，并且前肽通常对于蛋白酶的正确折叠是必需的。信号肽和前肽通常是前蛋白的n-末端部分。信号肽在自然条件下通过信号肽酶从蛋白酶的其余部分裂解。随后，在前肽的支持下，发生蛋白酶的正确的最终折叠。然后，蛋白酶以其活性形式存在，并裂解前肽本身。在裂解前肽之后，然后成熟的蛋白酶(特别是枯草杆菌蛋白酶)在没有最初存在的n-末端氨基酸的情况下发挥其催化活性。对于一般的工业应用，特别是在本发明的上下文中，成熟的蛋白酶，即在其产生后加工的酶，相对于前蛋白是优选的。蛋白酶也可以在多肽链产生后被产生蛋白酶的细胞修饰，例如通过连接糖分子、甲酰化或胺化等。此类修饰是翻译后修
饰，并且可以但不是必须对蛋白酶的功能产生影响。
[0105]
本文使用的"变体"是指天然蛋白酶的天然或人工产生的变体，其具有从参考形式修饰的氨基酸序列。除上面讨论的氨基酸改变之外，根据本发明的蛋白酶可以具有其他氨基酸改变，特别是氨基酸取代、插入或缺失。例如，此类蛋白酶通过靶向遗传修饰即通过诱变方法开发，并针对特定应用或对于特定性质(例如对于它们的催化活性或稳定性等)进行优化。此外，可以将根据本发明的核酸引入重组方法中，因此可以用于产生全新类型的蛋白酶或其他多肽。目的是将靶向突变如取代、插入或缺失引入已知分子中，以便例如改善酶的清洁性能。为此，特别是可以改变分子的表面电荷和/或等电点，从而改变它们与底物的相互作用。例如，可以改变酶的净电荷以影响底物结合，特别是用于洗涤剂和清洁剂。或者或另外，一个或多个相应的突变可以增加酶的稳定性或催化活性，从而提高其清洁性能。单个突变例如单个取代的有利性质可以互相补充。因此，可以在本发明的范围内进一步开发在某些性质方面已经优化的蛋白酶，例如在其对表面活性剂和/或漂白剂和/或其它组分的稳定性方面。
[0106]
根据本发明的洗涤剂以增加优选的顺序含有1
×
10-8
至5重量％、0.0001至1重量％、0.0005至0.5重量％、0.001至0.1重量％的量的蛋白酶，在所有情况下基于活性蛋白质和基于洗涤剂的总重量。
[0107]
在本发明的另一个实施方式中，所述蛋白酶的特征在于，与常规蛋白酶和/或野生型酶(seq id no:1)和/或相应的已经性能改进的起始变体(来自wo 2013/060621 a1的seq id no:2)相比，其清洁性能(在储存之后，例如超过2周)没有显著降低，即具有参考洗涤性能的至少80％，优选至少100％，更优选至少110％或更多。
[0108]
在本发明的上下文中，清洁性能应理解为表示试剂部分或完全去除存在的污渍的能力，特别是对纺织品上的一种或多种污渍的减轻性能。这种污渍的实例是棉花上的血液或棉花上的巧克力牛奶/烟灰、棉花上的可可粉或棉花上的粥。在本发明的上下文中，包含所述蛋白酶的洗涤剂、或由该试剂形成的洗涤液以及蛋白酶本身都具有清洁性能。因此，蛋白酶的清洁性能有助于试剂或由试剂形成的洗涤液的清洁性能。清洁性能优选如下所述测定。
[0109]
洗涤液应理解为表示含有洗涤剂的使用溶液，该溶液作用于纺织品或织物，从而与存在于纺织品或织物上的污渍接触。洗涤液通常在洗涤过程开始和洗涤剂用水稀释时形成，例如在洗衣机中或在另一合适的容器中。
[0110]
清洁性能可以在含有剂量为2.0至8.0克/升洗涤液的洗涤剂和蛋白酶的洗涤系统中测定。待比较的蛋白酶以相同浓度(基于活性蛋白质)使用。使用活性相当的相应蛋白酶，确保了即使在活性物质与总蛋白质的比例(比活性的值)存在差异，也可以比较相应的酶性质，例如对某些污渍的清洁性能。通常，低比活性可以通过添加较大量的蛋白质来补偿。此外，如果待检测的酶在活性试验中对试验底物具有不同的亲和性，则待检测的酶也可以以相同的物质量或重量使用。在本文中，术语"相同的物质量"是指待检测的酶的摩尔用量。术语"相同重量"是指使用相同重量的待检测的酶。
[0111]
用于该洗涤系统的洗涤剂中的蛋白酶的浓度为0.0001-0.1重量％，优选0.001-0.1重量％，更优选0.01-0.06重量％，特别优选0.001-0.02重量％，基于活性蛋白质。
[0112]
用于这种洗涤系统的优选液体洗涤剂组成如下(所有数据以重量百分比计)：《1％
消泡剂、1-4％柠檬酸、0.5-3％甘油、0.3-2％ naoh、4-8％1,2-丙二醇、2-5％ faeos(脂肪醇醚硫酸盐)、5-9％非离子表面活性剂(faeo)、7-12％阴离子表面活性剂(las)、0.5-1.5％蛋白酶稳定剂、1-3％棕榈仁油脂肪酸、0.5-2％ hedp(1-羟基乙烷-(1,1-二膦酸))、2-6％单乙醇胺(mea)、0.2-1％去污聚合物(soil release polymer)、余量为软化水。液体洗涤剂的剂量优选为2.0-8.0克/升洗涤液，例如2.5克/升、3.2克/升、3.5克/升、4.0克/升、4.7克/升、4.9克/升、5.5克/升或5.9克/升洗涤液或约55克/工作。洗涤优选在约9至约12、优选约10至11的ph范围、特别优选ph为10下进行。
[0113]
作为清洁性能的量度的白度，即污渍的减轻程度，通过光学测量方法，优选光度测定来测定。适合用于该目的的装置例如是minolta cm508d分光计。通常，用于测量的装置预先用白标准品、优选提供的白标准品校准。
[0114]
用于测定蛋白酶活性的方法对于酶技术领域的技术人员来说是众所周知的，并且经常使用。例如，此类方法公开在tenside["surfactants"]，第7卷(1970)，第125-132页中。或者，可以通过从底物suc-l-ala-l-ala-l-pro-l-phe-对硝基苯胺(aapf)释放发团对硝基苯胺(pna)来测定蛋白酶活性。蛋白酶切割底物并释放pna。pna的释放引起410nm处吸光度增加，其时间进程是酶活性的量度(参见del mar等人，1979)。测量在25℃温度、8.6的ph和410nm的波长下进行。测量时间为5min，测量间隔为20s至60s。蛋白酶活性通常以蛋白酶单位(pe)表示。例如，适合的蛋白酶活性总计2.25、5或10pe/ml洗涤液。然而，蛋白酶活性不等于零。
[0115]
用于确定根据本发明的蛋白酶的蛋白水解活性的替代测试是光学测量方法，优选光度测量方法。适合的测试包括底物蛋白酪蛋白的蛋白酶依赖性裂解。其通过蛋白酶裂解成许多较小的部分产物。与未裂解的酪蛋白相比，这些部分产物的总体在290nm处具有增加的吸收，可以使用光度计测定这种增加的吸收，从而得出关于蛋白酶的酶活性的结论。
[0116]
蛋白质浓度可以使用已知的方法测定，例如bca方法(二喹啉甲酸；2,2'-双喹啉基-4,4'-二羧酸)或缩二脲方法(gornall等(1948)，j.biol.chem.，177:751-766)。在这方面，可以通过使用合适的不可逆抑制剂滴定活性中心并测定剩余活性来测定活性蛋白浓度(bender等人(1966)，j.am.chem.soc.88(24):5890-5913)。
[0117]
根据本发明的蛋白酶的优选实施方式即使在低温下，特别是在10-60℃，优选15-50℃，特别优选20-40℃的温度范围内也能实现这种有利的清洁性能。
[0118]
根据本发明，洗涤剂应理解为所有可能类型的洗涤剂，包括浓缩物和未稀释的试剂，用于商业规模、用于洗衣机或用于手洗或清洁。这些包括例如用于纺织品、地毯或天然纤维的洗涤剂，对其使用术语洗涤剂。在本发明上下文中，洗涤剂还包括在手动或使用机器洗涤纺织品时添加到实际洗涤剂中以实现另外的效果的辅助洗涤剂。此外，本发明上下文中的洗涤剂还包括纺织品预处理剂和后处理剂，即在实际洗涤循环之前与洗涤物接触的试剂，例如用于疏松顽固的污渍的试剂，以及在实际纺织品洗涤之后的步骤中赋予洗涤物进一步期望的特性，如舒适感、防皱性或低的静电荷的试剂。最后提到的试剂尤其包括织物柔软剂。
[0119]
除根据本发明的蛋白酶之外，根据本发明的洗涤剂，其可以作为粉末状或颗粒状固体、以压缩或再压缩的颗粒形式、作为均匀的溶液或悬浮液存在，可以含有在这种洗涤剂中常用的所有已知成分，其中洗涤剂优选以0.01至99.9重量％的量含有这种其它成分。根
据本发明的洗涤剂特别是可以含有表面活性剂、助洗剂、聚合物、玻璃腐蚀抑制剂、腐蚀抑制剂、漂白剂如过氧化合物、漂白活化剂或漂白催化剂。它们还可以含有水混溶性有机溶剂、其它酶、酶稳定剂、螯合剂、电解质、ph调节剂和/或其它助剂如光学增亮剂、泛灰抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫调节剂、染料和香料以及它们的组合。
[0120]
特别是，阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和它们的混合物是适合的。根据本发明的试剂可以含有一种或多种表面活性剂，其中阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂和它们的混合物是特别适合的，但也可以含有阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和/或两性表面活性剂。所述试剂优选含有5-70重量％的表面活性剂，优选5-55重量％和更优选5-35重量％的表面活性剂。根据本发明的洗涤剂特别优选含有不超过30重量％的表面活性剂，非常特别优选不超过20重量％的表面活性剂。
[0121]
适合的阴离子表面活性剂特别是皂类和含有硫酸根或磺酸根基团的那些，优选具有碱金属离子作为阳离子。可使用的皂类优选是饱和或不饱和的c
12-18
脂肪酸的碱金属盐。该类脂肪酸也可以以未完全中和的形式使用。适合的硫酸盐型表面活性剂包括c
12-18
脂肪醇的硫酸半酯的盐和所提及的具有低乙氧基化程度的非离子表面活性剂的硫酸盐化产物。可使用的磺酸盐型的表面活性剂包括，例如，c
9-14
烷基苯磺酸盐，由c
12-18
烷烃获得的烷基磺酸盐(例如通过氯磺化或磺化氧化并随后水解或中和)，由相应的单烯烃与三氧化硫的反应形成的c
12-18
烯烃磺酸盐，烯烃和羟基烷烃磺酸盐的混合物，二磺酸盐如从具有末端或内部双键的c
12-18
单烯烃通过用气态三氧化硫磺化和随后的磺化产物的碱性或酸性水解获得的那些，和由脂肪酸甲酯或乙酯磺化形成的α-磺基脂肪酸酯(酯磺酸盐)，例如氢化椰子油脂肪酸、氢化棕榈仁油脂肪酸或氢化牛脂脂肪酸的α-磺化甲酯。
[0122]
所述试剂优选具有2-55重量％、更优选3-35重量％的阴离子表面活性剂；非常优选所述试剂含有3-15重量％的烷基苯磺酸盐。另外，所述试剂可以优选还含有其它阴离子表面活性剂，特别是烷基醚硫酸盐，和非离子表面活性剂，特别是脂肪醇烷氧基化物。因此，这些可以构成表面活性剂的剩余部分。
[0123]
适合的烷基苯磺酸盐优选选自下式的线性或支化烷基苯磺酸盐
[0124][0125]
其中r'和r"独立地为h或烷基，并且一起含有6至19、优选7至15、特别是9至13个c原子。非常特别优选的代表是十二烷基苯磺酸钠。
[0126]
作为烷基(烯基)硫酸盐，优选如下化合物的硫酸半酯的碱金属盐，特别是钠盐：c
12-18
脂肪醇(例如椰子油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇)或c
10-20
羰基醇以及具有这些链长的仲醇。含有基于石化制备的合成的直链烷基官能团并且具有与基于脂肪化学原料的合适化合物类似的降解行为的具有所提及的链长的烷基(烯基)硫酸盐，也是优选的。从洗涤的角度来看，优选c
12-16
烷基硫酸盐和c
12-15
烷基硫酸盐以及c
14-15
烷基硫酸盐。
[0127]
脂肪醇醚硫酸盐，如用1-6mol环氧乙烷乙氧基化的直链或支化c
7-21
醇(如具有平均3.5摩尔环氧乙烷(eo)的2-甲基-支化的c
9-11
醇或具有1-4个eo的c
12-18
脂肪醇)的硫酸单酯，也是适合的。
[0128]
适合的烷基醚硫酸盐的实例是式r
1-o-(ao)
n-so
3-x
+
的化合物。在该式中，r1表示直链或支化、取代或未取代的烷基官能团，优选直链、未取代的烷基官能团，特别优选脂肪醇官能团。优选的官能团r1选自癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基官能团和它们的混合物，其中优选具有偶数个c原子的代表。特别优选的官能团r1衍生自c
12-c
18
脂肪醇，例如衍生自椰子油脂肪醇、牛油脂肪醇、月桂醇、肉豆蔻醇、鲸蜡醇或硬脂醇或衍生自c
10-c
20
羰基醇。ao表示环氧乙烷(eo)基团或环氧丙烷(po)基团，优选环氧乙烷基团。指数n表示1至50、优选1至20、特别是2至10的整数。非常特别优选n表示数字2、3、4、5、6、7或8。x
+
表示一价阳离子或n价阳离子的第n部分，优选碱金属离子，包括na
+
或k
+
，在这种情况下，na
+
是最优选的。其他阳离子x
+
可以选自nh
4+
、1/2zn
2+
、1/2mg
2+
、1/2ca
2+
、1/2mn
2+
和它们的混合物。
[0129]
在各种实施方式中，烷基醚硫酸盐可以选自下式的脂肪醇醚硫酸盐：
[0130][0131]
其中k＝11至19，和n＝2、3、4、5、6、7或8。非常特别优选的代表是具有2个eo的c
12-14
脂肪醇醚硫酸钠(k＝11-13，n＝2)。所述乙氧基化程度为统计平均值，其对于特定产物可以是整数或分数。所述烷氧基化程度为统计平均值，其对于特定产物可以是整数或分数。优选的烷氧基化物/乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范围乙氧基化物，nre)。
[0132]
已经证明如果洗涤剂另外含有皂(一种或多种)作为阴离子表面活性剂，对于冷洗涤性能，是优异的。因此，优选的洗涤剂的特征在于它们含有皂(一种或多种)。适合的是饱和脂肪酸皂，例如如下化合物的盐：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、氢化芥酸和山萮酸，以及特别是衍生自天然脂肪酸，例如椰子油脂肪酸、棕榈仁油脂肪酸或牛脂脂肪酸的皂混合物。
[0133]
适合的非离子表面活性剂特别是烷基糖苷以及烷基糖苷或直链或支链醇的乙氧基化和/或丙氧基化产物，各自在烷基部分中具有8-约18个c原子和具有3-20、优选4-10个烷基醚基团。n-烷基胺、连位二醇、脂肪酸酯和脂肪酸酰胺(其就烷基部分而言，对应于所提及的长链醇衍生物)以及在烷基官能团中具有5-12个c原子的烷基酚的相应乙氧基化和/或丙氧基化产物，也是适合的。
[0134]
优选使用的非离子表面活性剂是优选具有8-18个c原子和平均每摩尔醇1-12摩尔环氧乙烷(eo)的烷氧基化的、有利的是乙氧基化的、特别是伯醇，其中醇官能团可以是直链的或优选在2位甲基支化的，或可以以混合物形式含有直链和甲基支化的官能团，如通常存在于羰基醇官能团中的那些。然而，特别优选具有12-18个c原子的天然来源的醇(例如椰油醇、棕榈醇、牛脂醇或油醇)和每摩尔醇平均2-8个eo的具有直链官能团的醇乙氧基化物。优选的乙氧基化醇包括，例如，具有3个eo或4个eo的c
12-14
醇，具有7个eo的c
9-11
醇，具有3个eo、5个eo、7个eo或8个eo的c
13-15
醇，具有3个eo、5个eo或7个eo的c
12-18
醇，和它们的混合物，如具有3个eo的c
12-14
醇和具有5个eo的c
12-18
醇的混合物。所述乙氧基化程度为统计平均值，其对于特定产物可以是整数或分数。优选的醇乙氧基化物具有窄的同系物分布(窄范围乙氧基化物，nre)。除这些非离子表面活性剂之外，还可以使用具有超过12个eo的脂肪醇。这些的实例是具有14个eo、25个eo、30个eo或40个eo的牛油脂肪醇。
[0135]
优选使用的另一类非离子表面活性剂是烷氧基化的，优选乙氧基化的或乙氧基化
和丙氧基化的脂肪酸烷基酯，其优选在烷基链中具有1-4个碳原子，特别是脂肪酸甲酯，其或者作为唯一的非离子表面活性剂或者与其它非离子表面活性剂组合使用。
[0136]
可以有利地使用的另一类非离子表面活性剂是烷基多糖苷(apg)。可使用的烷基多糖苷具有通式ro(g)z，其中r表示直链或支化的，特别是在2位甲基支化的，饱和或不饱和的，具有8-22个、优选12-18个c原子的脂族官能团，g是代表具有5或6个c原子的单糖单元、优选葡萄糖的符号。糖苷化程度z为1.0-4.0，优选1.0-2.0，特别是1.1-1.4。优选使用直链烷基多糖苷，即其中聚二醇官能团是葡萄糖官能团并且烷基官能团是正烷基官能团的烷基多糖苷。
[0137]
氧化胺类型(例如n-椰油烷基-n,n-二甲基氧化胺和n-牛脂烷基-n,n-二羟乙基氧化胺)的非离子表面活性剂，以及脂肪酸烷醇酰胺的非离子表面活性剂，也可以是适合的。这些非离子表面活性剂的量优选不超过乙氧基化脂肪醇的量，特别是不超过其一半。
[0138]
可优选用于根据本发明的洗涤剂中的非离子表面活性剂具有式r1–
ch(oh)ch2o-(ao)
w-(a'o)
x-(a”o)
y-(a”'o)
z-r2，其中r1表示直链或支化、饱和或单不饱和或多不饱和的c
6-24
烷基或烯基官能团；r2表示具有2至26个碳原子的直链或支化烃官能团；a、a'、a"'和a""彼此独立地为选自-ch2ch2、-ch2ch
2-ch2、-ch
2-ch(ch3)、-ch
2-ch
2-ch
2-ch2、-ch
2-ch(ch3)-ch
2-、-ch
2-ch(ch
2-ch3)的组的官能团，和w、x、y和z表示0.5-120之间的值，其中x、y和/或z也可以是0。通过添加上述的式r1–
ch(oh)ch2o-(ao)
w-(a'o)x-(a”o)
y-(a”'o)
z-r2的非离子表面活性剂(下文也称为"羟基混合醚")，不仅与不含表面活性剂的体系相比，而且与含有替代的非离子表面活性剂(例如选自聚烷氧基化脂肪醇的组)的体系相比，根据本发明的含酶制剂的清洁性能可以得到显著改善。
[0139]
通过使用在一个或两个末端烷基上具有一个或多个游离羟基的这些非离子表面活性剂，可以显著改善包含在根据本发明的洗涤剂制剂中的酶的稳定性。
[0140]
特别优选的是，末端封端的聚(氧烷基化)非离子表面活性剂，其根据式r1o[ch2ch2o]
x
ch2ch(oh)r2，除表示具有2-30个碳原子，优选具有4-22个碳原子的直链或支化、饱和或不饱和、脂族或芳族烃官能团的官能团r1之外，还包含具有1-30个碳原子的直链或支化、饱和或不饱和、脂族或芳族烃官能团r2，其中x表示1-90之间的值，优选30-80之间的值，特别是30-60之间的值。
[0141]
式r1o[ch2ch(ch3)o]
x
[ch2ch2o]ych2ch(oh)r2的表面活性剂是特别优选的，其中r1表示4至18个碳原子的直链或支化脂族烃官能团或它们的混合物，r2表示具有2至26个碳原子的直链或支化烃官能团或它们的混合物，x表示0.5-1.5之间的值，和y表示至少15的值。这些非离子表面活性剂的组包括，例如c
2-26
脂肪醇-(po)
1-(eo)
15-40-2-羟烷基醚，特别是包括c
8-10
脂肪醇-(po)
1-(eo)
22-2-羟基癸基醚。
[0142]
特别优选的是，式r1o[ch2ch2o]
x
[ch2ch(r3)o]ych2ch(oh)r2的末端封端的聚(氧烷基化)非离子表面活性剂，其中r1和r2彼此独立地表示具有2至26个碳原子的直链或支化、饱和或单不饱和或多不饱和的烃官能团，r3彼此独立地选自-ch3、-ch2ch
3-、-ch2ch
2-ch3、-ch(ch3)2，但优选表示-ch3，x和y彼此独立地表示1-32之间的值，其中非常特别优选的是，r3＝-ch3且x为15-32的值、y为0.5-15的值的非离子表面活性剂。
[0143]
可优选使用的其他非离子表面活性剂是式r1o[ch2ch(r3)o]
x
[ch2]kch(oh)[ch2]jor2的末端封端的聚(氧烷基化)非离子表面活性剂，其中r1和r2表示具有1至30个碳原子的
直链或支化、饱和或不饱和的、脂族或芳族烃官能团，r3表示h或甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基或2-甲基-2-丁基官能团，x表示1-30之间的值，k和j表示1-12之间的值，优选1-5之间的值。如果x值≥2，则上式r1o[ch2ch(r3)o]
x
[ch2]kch(oh)[ch2]jor2中的每个r3可以是不同的。r1和r2优选是具有6至22个碳原子的直链或支化、饱和或不饱和的、脂族或芳族烃官能团，其中具有8至18个碳原子的官能团是特别优选的。对于官能团r3，特别优选h、-ch3或-ch2ch3。x的特别优选的值在1至20的范围内，特别是6至15。如上所述，如果x≥2，则上式中的每个r3可以是不同的。以这种方式，可以改变方括号中的氧化烯单元。例如，如果x表示3，可以选择官能团r3以形成环氧乙烷(r3＝h)或环氧丙烷(r3＝ch3)单元，其可以任何顺序连接到一起，例如(eo)(po)(eo)、(eo)(eo)(po)、(eo)(eo)(eo)、(po)(eo)(po)、(po)(po)(eo)和(po)(po)(po)。在此，例如选择x的值3，并且完全可以更大，其中变化范围随着x值的增加而增加，并且包括大量的(eo)基团与少量的(po)基团的组合，或者反之亦然。特别优选的上式的末端封端的聚(氧烷基化)醇具有k＝1和j＝1的值，因此将上式简化为r1o[ch2ch(r3)o]
x
ch2ch(oh)ch2or2。在最后提及的式中，r1、r2和r3如上所定义的，x表示1至30、优选1至20、特别是6至18的数。其中官能团r1和r2具有9至14个c原子，r3表示h，和x取6至15的值的表面活性剂是特别优选的。
[0144]
最后，通式r1–
ch(oh)ch2o-(ao)
w-r2的非离子表面活性剂已证明是特别有效的，其中r1表示直链或支化、饱和或单不饱和或多不饱和的c
6-24
烷基或烯基官能团；r2表示具有2至26个碳原子的直链或支化烃官能团；a表示选自-ch2ch2、-ch2ch
2-ch2、-ch
2-ch(ch3)的官能团，和w表示1至120、优选10至80、特别是20至40的值。这些非离子表面活性剂的组包括例如c
4-22
脂肪醇-(eo)
10-80-2-羟烷基醚，特别是c
8-12
脂肪醇-(eo)
22-2-羟基癸基醚和c
4-22
脂肪醇-(eo)
40-80-2-羟烷基醚。
[0145]
优选的洗涤剂的特征在于，所述洗涤剂含有至少一种非离子表面活性剂，优选选自羟基混合醚的组的非离子表面活性剂，所述非离子表面活性剂相对于洗涤剂的总重量的重量比为0.2-20重量％、优选1-18重量％、更优选2-15重量％和特别优选5-10重量％。
[0146]
适合的两性表面活性剂是，例如式(r
iii
)(r
iv
)(rv)n
+
ch2coo-的甜菜碱类，其中r
iii
表示具有8至25个、优选10至21个碳原子的烷基，其任选被杂原子或杂原子基团中断，且r
iv
和rv表示具有1至3个碳原子的相同或不同的烷基，特别是c
10-18
烷基二甲基羧甲基甜菜碱和c
11-17
烷基酰氨基丙基二甲基羧甲基甜菜碱。
[0147]
适合的阳离子表面活性剂尤其是式(r
vi
)(r
vi
')(r
viii
)(r
ix
)n
+
x-的季铵化合物，其中r
vi
至r
ix
是四种相同或不同的、特别是两种长链和两种短链烷基，和x-是阴离子，特别是卤素离子，例如二癸基二甲基氯化铵、烷基苄基二癸基氯化铵和它们的混合物。其它适合的阳离子表面活性剂是四价表面活性化合物，特别是具有锍、鏻、碘鎓或砷鎓基团的四价表面活性化合物，其也已知是抗菌的活性成分。通过使用具有抗菌作用的四价表面活性化合物，可以为试剂提供抗菌作用，或者可以改善由于其他成分可能已经存在的抗菌作用。
[0148]
络合剂是根据本发明的洗涤剂的另一个优选组分。特别优选的络合剂是膦酸酯，条件是它们的使用是法规允许的。除1-羟基乙烷-1,1-二膦酸之外，络合的膦酸酯包括许多不同的化合物如二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)。羟基烷烃或氨基烷烃膦酸酯在本技术中是特别优选的。在羟基烷烃膦酸酯之中，1-羟基乙烷-1,1-二膦酸酯(hedp)作为共助洗剂特别重要。其优选以钠盐的形式使用，其中二钠盐以中性方式反应，而四钠盐以碱性
(ph9)方式反应。可能优选的氨基烷烃膦酸酯包括乙二胺四亚甲基膦酸酯(edtmp)、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸酯(dtpmp)和它们的高级同系物。它们优选以中性反应的钠盐的形式使用，例如edtmp的六钠盐或dtpmp的七钠盐和八钠盐。在膦酸酯类中，优选使用hedp作为助洗剂。此外，氨基烷烃膦酸酯具有显著的重金属结合能力。因此，特别是如果试剂还含有漂白剂时，可以优选使用氨基烷烃膦酸酯，特别是dtpmp，或使用所提及的膦酸酯的混合物。在本技术的上下文中优选的洗涤剂含有一种或多种膦酸酯，所述膦酸酯选自氨基三亚甲基膦酸(atmp)和/或其盐；乙二胺四(亚甲基膦酸)(edtmp)和/或其盐；二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)和/或其盐；1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(hedp)和/或其盐；2-膦酸丁烷-1,2,4-三羧酸(pbtc)和/或其盐；六亚甲基二胺四(亚甲基膦酸)(hdtmp)和/或其盐；次氮基三(亚甲基膦酸)(ntmp)和/或其盐。含有1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(hedp)或二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)作为膦酸酯的洗涤剂是特别优选的。当然，根据本发明的洗涤剂可以含有两种或更多种不同的膦酸酯。根据本发明优选的洗涤剂的特征在于，所述洗涤剂含有至少一种选自膦酸酯的组的络合剂，优选1-羟基乙烷-1,1-二膦酸酯，所述膦酸酯相对于洗涤剂的总重量的重量比优选为0.1-8.0重量％、更优选0.2-5.0重量％、甚至更优选0.3-3.0重量％、特别优选0.5-2.0重量％。
[0149]
根据本发明的洗涤剂也优选含有助洗剂，优选至少一种水溶性的和/或水不溶性的有机和/或无机助洗剂。所述助洗剂特别包括硅酸盐、碳酸盐和有机共助洗剂。
[0150]
多羧酸酯/多羧酸、聚合的聚羧酸酯、天冬氨酸、聚缩醛、糊精、其它有机共助洗剂和膦酸酯作为有机共助洗剂特别值得注意。这些物质类别描述如下。如果需要，可以含有至多40重量％，特别是至多25重量％，优选1-8重量％的量的这种有机共助洗剂物质。
[0151]
适合的有机助洗剂物质是，例如，可以游离酸和/或其钠盐形式使用的多羧酸，其中多羧酸应理解为带有多于一个酸官能团的羧酸。例如，这些是柠檬酸、己二酸、琥珀酸、戊二酸、苹果酸、酒石酸、马来酸、富马酸、糖酸、羧基甲基菊粉(carboxylmethylinulin)、单体的和聚合的氨基多羧酸，特别是甘氨酸二乙酸(glycinediacetic acid)、甲基甘氨酸二乙酸、谷氨酰胺二乙酸、次氮基三乙酸(nta)、亚氨基二琥珀酸酯如乙二胺-n,n'-二琥珀酸和羟基亚氨基二琥珀酸酯、乙二胺四乙酸和聚天冬氨酸、多膦酸，特别是氨基三(亚甲基膦酸)、乙二胺四(亚甲基膦酸)、赖氨酸四(亚甲基膦酸)和1-羟基乙烷-1,1-二膦酸、聚合的羟基化合物如糊精和聚合的(聚)羧酸、可特别通过氧化多糖或糊精获得的多羧酸酯，和/或聚合的丙烯酸、甲基丙烯酸、马来酸和其混合聚合物，其还可以含有聚合在其中的小比例的没有羧酸官能团的可聚合物质。如果需要，可以含有至多50重量％，特别是至多25重量％，优选10-20重量％和特别优选1-5重量％的量的这种有机助洗剂物质。
[0152]
除了它们的助洗剂作用之外，游离酸通常还具有酸化组分的特性，因此还用于给出较低和较温和ph值的洗涤剂。在此特别提及柠檬酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、葡糖酸和它们的任意混合物。柠檬酸或柠檬酸的盐特别优选用作助洗剂物质。其他特别优选的助洗剂物质选自甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸二乙酸酯(glda)、天冬氨酸二乙酸酯(asda)、羟乙基亚氨基二乙酸酯(heida)、亚氨基二琥珀酸酯(ids)、乙二胺二琥珀酸酯(edds)、羧甲基菊粉(carboxymethyl inulin)和聚天冬氨酸酯。
[0153]
在优选的实施方式中，柠檬酸和/或柠檬酸盐用作水溶性的有机助洗剂。特别优选使用0.5-25重量％、优选0.75-12.5重量％、更优选1-4重量％的柠檬酸和/或0.5-25重
na2si2o5)，是特别适合的。在根据本发明的试剂的一个实施方式中，使用由结晶性层状硅酸盐和柠檬酸盐、结晶性层状硅酸盐和上述(共)聚合的多羧酸或碱金属硅酸盐和碱金属碳酸盐制成的粒状化合物，例如可以名称15商购获得。根据本发明的试剂优选以1至20重量％、特别是5至15重量％的量含有这类水溶性的无机助洗剂材料。作为水溶性的无机助洗剂物质同样重要的是碳酸盐(和碳酸氢盐)，特别是碳酸钠，和膦酸/膦酸盐。膦酸也被理解为表示任选取代的烷基膦酸，其也可以具有多个膦酸基团(所谓的多膦酸)。它们优选选自羟基和/或氨基烷基膦酸和/或它们的碱金属盐，例如二甲基氨基甲烷二膦酸、3-氨基丙烷-1-羟基-1,1-二膦酸、1-氨基-1-苯基甲烷二膦酸、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(hedp)、氨基三(亚甲基膦酸)、n,n,n',n'-乙二胺四(亚甲基膦酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(dtpmp)和亚磷酸的酰化衍生物，它们也可以任何混合物形式使用。
[0156]
在各种实施方式中，所述助洗剂体系优选包含下述组分，在所有情况下基于所述试剂的总质量：
[0157]
a)0至10重量％、优选1至4重量％的柠檬酸；和/或
[0158]
b)0至10重量％、优选1至4重量％的柠檬酸盐，优选碱金属柠檬酸盐；和/或
[0159]
c)0至40重量％、优选0至15重量％、特别优选1至3重量％的碱金属碳酸盐，其也可以至少部分地被碱金属碳酸氢盐替代，特别是碳酸钠；和/或
[0160]
d)0至20重量％、优选3至10重量％的碱金属硅酸盐；
[0161]
e)0至10重量％、优选0.02至2重量％、特别优选0.5至2重量％的膦酸和/或碱金属膦酸盐，特别是hedp和/或dtpmp；和/或
[0162]
f)0至10重量％、优选0.5至3重量％的聚合的多羧酸酯，特别是聚丙烯酸酯。
[0163]
对于组分f)，例如，聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸的碱金属盐是适合的，例如相对分子量为500-70,000g/mol的那些。上面已经详细描述了该物质类别。(共)聚合的多羧酸酯可以作为粉末或作为水溶液使用。
[0164]
根据本发明的试剂优选不含磷酸盐助洗剂，即它们含有小于1重量％，优选没有有意添加的磷酸盐助洗剂。
[0165]
所述试剂还可以含有水不溶性的助洗剂物质。作为水不溶性的无机助洗剂材料，特别是使用结晶性或无定形的水可分散的碱金属铝硅酸盐，其量至多50重量％，优选不超过40重量％，特别是3至20重量％，特别优选1至15重量％。这些之中，洗涤剂质量的结晶性铝硅酸钠，特别是沸石a、沸石p、沸石map和任选的沸石x，单独或以混合物的形式，例如以沸石a和x的共结晶物的形式(ax，来自condea augusta s.p.a.的商业产品)是优选的。优选在固体颗粒试剂中使用接近所述上限的量。适合的铝硅酸盐尤其没有粒径大于30μm的颗粒，优选包含至少80重量％的粒径小于10μm的颗粒。可以根据de 2412837 a1测定的所述铝硅酸盐的钙结合能力通常在100-200mg cao/克的范围内。
[0166]
除前面描述的助洗剂之外，洗涤剂中还可以含有具有清洁作用的聚合物。相对于根据本发明的洗涤剂的总重量，聚合物的重量比优选为0.1至20重量％，更优选1.0至15重量％，甚至更优选2.0至12重量％。含有磺酸基的聚合物，特别是来自共聚的聚磺酸盐的组，优选用作具有清洁作用的聚合物。除含有含磺酸基的单体之外，这些共聚的聚磺酸盐还含有至少一种选自不饱和羧酸的组的单体。作为不饱和羧酸，特别优选使用式r1(r2)c＝c(r3)cooh的不饱和羧酸，其中r1至r3彼此独立地表示-h、-ch3、具有2至12个碳原子的直链或支化
饱和烷基官能团、具有2至12个碳原子的直链或支化、单不饱和或多不饱和的烯基官能团、-nh
2-、-oh-、或-cooh-取代的如上定义的烷基或烯基官能团，或表示-cooh或-coor4，其中r4是具有1至12个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支化烃官能团。特别优选的不饱和羧酸是丙烯酸、甲基丙烯酸、乙基丙烯酸、α-氯代丙烯酸、α-氰基丙烯酸、巴豆酸、α-苯基丙烯酸、马来酸、马来酸酐、富马酸、衣康酸、柠康酸、亚甲基丙二酸、山梨酸、肉桂酸或它们的混合物。当然也可以使用不饱和二羧酸。对于含有磺酸基的单体，优选式r5(r6)c＝c(r7)-x-so3h的那些，其中r5至r7彼此独立地表示-h、-ch3、具有2至12个碳原子的直链或支化饱和烷基官能团、具有2至12个碳原子的直链或支化、单不饱和或多不饱和的烯基官能团，-nh
2-、oh-、或-cooh-取代的烷基或烯基官能团，或表示-cooh或-coor4，其中r4是具有1至12个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支化烃官能团，和x表示任选存在的间隔基团，其选自-(ch2)
n-，其中n＝0至4，-coo-(ch2)
k-，其中k＝1至6，-c(o)-nh-c(ch3)
2-、-c(o)-nh-c(ch3)
2-ch
2-和-c(o)-nh-ch(ch2ch3)-ch
2-。在这些单体中，优选式h2c＝ch-x-so3h、h2c＝c(ch3)-x-so3h和ho3s-x-(r6)c＝c(r7)-x-so3h的那些，其中r6和r7彼此独立地选自-h、-ch3、-ch2ch3、-ch2ch2ch3和-ch(ch3)2，并且x表示任选存在的间隔基团，其选自-(ch2)
n-，其中n＝0至4，-coo-(ch2)
k-，其中k＝1至6，-c(o)-nh-c(ch3)
2-，-c(o)-nh-c(ch3)
2-ch
2-和-c(o)-nh-ch(ch2ch3)-。特别优选的含磺酸基的单体是1-丙烯酰胺基-1-丙磺酸、2-丙烯酰胺基-2-丙磺酸、2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、2-甲基丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸、3-甲基丙烯酰胺基-2-羟基-丙磺酸、烯丙基磺酸、甲基烯丙基磺酸、烯丙氧基苯磺酸、甲基烯丙氧基苯磺酸、2-羟基-3-(2-丙烯氧基)丙磺酸、2-甲基-2-丙烯-1-磺酸、苯乙烯磺酸、乙烯基磺酸、丙烯酸3-磺基丙酯、甲基丙烯酸3-磺基丙酯、磺基甲基丙烯酰胺、磺基甲基甲基丙烯酰胺，以及上述酸或其水溶性盐的混合物。在所述聚合物中，磺酸基可以全部或部分中和形式存在。根据本发明，优选使用部分或完全中和的磺酸基的含有磺酸基的共聚物。根据本发明优选使用的磺基共聚物的摩尔质量可以变化，以使聚合物的性质适应所需的预期用途。作为非离子单体，优选使用式r1(r2)c＝c(r3)-x-r4的单体，其中r1至r3彼此独立地表示-h、-ch3或-c2h5，x表示任选存在的选自-ch
2-、-c(o)o-和-c(o)-nh-的间隔基团，并且r4表示具有2至22个碳原子的直链或支化饱和烷基官能团或具有6至22个碳原子的不饱和、优选芳族官能团。特别优选的非离子单体是丁烯、异丁烯、戊烯、3-甲基丁烯、2-甲基丁烯、环戊烯、己烯、1-己烯、2-甲基戊烯-1、3-甲基戊烯-1、环己烯、甲基环戊烯、环庚烯、甲基环己烯、2,4,4-三甲基戊烯-1、2,4,4-三甲基戊烯-2、2,3-二甲基己烯-1、2,4-二甲基己烯-1、2,5-二甲基己烯-1、3,5-二甲基己烯-1、4,4-二甲基己烷-1、乙基环己烯、1-辛烯、具有10个以上碳原子的α-烯烃如1-癸烯、1-十二碳烯、1-十六碳烯、1-十八碳烯和c
22
α-烯烃、2-苯乙烯、α-甲基苯乙烯、3-甲基苯乙烯、4-丙基苯乙烯、4-环己基苯乙烯、4-十二烷基苯乙烯、2-乙基-4-苄基苯乙烯、1-乙烯基萘、2-乙烯基萘、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸戊酯、丙烯酸己酯、甲基丙烯酸甲酯、n-(甲基)丙烯酰胺、丙烯酸-2-乙基己酯、甲基丙烯酸-2-乙基己酯、n-(2-乙基己基)丙烯酰胺、丙烯酸辛酯、甲基丙烯酸辛酯、n-(辛基)丙烯酰胺、丙烯酸月桂酸酯、甲基丙烯酸月桂酯、n-(月桂基)丙烯酰胺、丙烯酸硬脂基酯、甲基丙烯酸硬脂基酯、n-(硬脂基)丙烯酰胺、丙烯酸山萮基酯、甲基丙烯酸山萮基酯和n-(山萮基)丙烯酰胺，或它们的混合物。相对于根据本发明的洗涤剂的总重量，含有磺酸基的共聚物的重量比优选为0.1至15重量％，更优选1.0至12重量％，甚至更优选2.0至10重量％。
[0167]
在一个实施方式中，洗涤剂包含：
[0168]-5-70重量％、特别是5-30重量％的表面活性剂，和/或
[0169]-0-10重量％、特别是1-3重量％的水溶性的或水可分散的无机助洗剂材料，和/或
[0170]-0-10重量％、特别是1-4重量％的水溶性的有机助洗剂物质，和/或
[0171]-0.01-5重量％的络合剂，和/或
[0172]-0.01-5重量％的泛灰抑制剂，和/或
[0173]-0.01-5重量％的泡沫抑制剂，和/或
[0174]-0.01-5重量％的光学增亮剂。
[0175]
在一个优选的实施方式中，液体洗涤剂包含：
[0176]-5-20重量％、特别是9-17重量％的阴离子表面活性剂，和/或
[0177]-1-20重量％、特别是5-9重量％的非离子表面活性剂，和/或
[0178]-0.5-10重量％、特别是1-4重量％的水溶性的有机助洗剂物质，特别是柠檬酸或柠檬酸盐，和/或
[0179]-0.01-5重量％、特别是0.5-2重量％的络合剂，特别是hedp，和/或
[0180]-0.01-5重量％、特别是0.2-1重量％的泛灰抑制剂，和/或
[0181]-0.01-5重量％的泡沫抑制剂。
[0182]
在一个进一步优选的实施方式中，液体洗涤剂包含：
[0183]-0-10重量％、特别是1-3重量％的阴离子表面活性剂，和/或
[0184]-5-20重量％、特别是10-18重量％的非离子表面活性剂，和/或
[0185]-1-10重量％、特别是1.5-3重量％的水溶性的或水可分散的无机助洗剂材料，和/或
[0186]-0-1重量％、特别是0.01-0.5重量％的香料和/或0.01-5重量％、特别是0.05-0.5重量％的光学增亮剂。
[0187]
适合的泛灰抑制剂或去污活性成分(去污聚合物)是纤维素醚如羧甲基纤维素、甲基纤维素、羟烷基纤维素和混合纤维素醚，如甲基羟乙基纤维素、甲基羟丙基纤维素和甲基羧甲基纤维素。优选使用羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和它们的混合物，以及任选的它们与甲基纤维素的混合物。通常使用的去污活性成分包括含有二羧酸单元、亚烷基二醇单元和聚亚烷基二醇单元的共聚酯。根据本发明的试剂中的泛灰抑制剂和/或去污活性成分的比例通常不大于2重量％，优选0.5-1.5重量％，特别优选0.5-2重量％。
[0188]
例如，可以含有二氨基茋二磺酸的衍生物或其碱金属盐作为光学增亮剂，特别是用于由纤维素纤维(例如棉)制成的纺织品。例如，4,4'-双(2-苯胺基-4-吗啉基-1,3,5-三嗪-6-基氨基)茋-2,2'-二磺酸的盐，或带有二乙醇氨基、甲基氨基或2-甲氧基乙基氨基代替吗啉基的类似结构的化合物是适合的。此外，可以存在取代的4,4'-二苯乙烯基联苯型的增亮剂，例如4,4'-双(4-氯-3-磺基苯乙烯基)联苯。还可以使用增亮剂的混合物。1,3-二芳基-2-吡唑啉型增亮剂，例如1-(对磺酰苯基)-3-(对氯苯基)-2-吡唑啉，以及具有类似结构的化合物特别适合于聚酰胺纤维。所述试剂中的光学增亮剂或增白剂混合物的含量通常不大于1重量％，优选0.05-0.5重量％。在本发明的一个优选的实施方式中，所述试剂不含这种活性成分。
[0189]
可用于根据本发明的试剂中的常规泡沫调节剂包括例如聚硅氧烷-硅酸混合物，
其中所含的细碎硅酸优选被硅烷化或以其他方式疏水化。聚硅氧烷可以由直链化合物和交联聚硅氧烷树脂及其混合物组成。其它消泡剂是石蜡烃，特别是熔点高于40℃的微石蜡和石蜡，特别是具有20-22个碳原子的饱和脂肪酸或皂，例如山萮酸钠，和磷酸单烷基酯和/或磷酸二烷基酯的碱金属盐，其中烷基链各自具有12-22个碳原子。这些之中，优选使用具有c
16-18
烷基的单烷基磷酸钠和/或二烷基磷酸钠。泡沫调节剂的比例可以优选为0.2-2重量％，特别优选不超过1重量％。
[0190]
为了调节所期望的ph值，根据本发明的试剂可以含有与体系和环境相容的酸，特别是柠檬酸、乙酸、酒石酸、苹果酸、乳酸、乙醇酸、琥珀酸、戊二酸和/或己二酸，以及无机酸，特别是硫酸或碱金属硫酸氢盐，或碱，特别是铵或碱金属氢氧化物，优选氢氧化钠。根据本发明的试剂含有总计优选不大于10重量％、特别是0.5-6重量％、特别优选0.3-2重量％的这些类型的ph调节剂。
[0191]
可以适合用于根据本发明的试剂中的过氧化合物包括，特别是有机过酸或有机酸的过酸盐，例如苯二甲酰亚胺过己酸、过苯甲酸或二过十二烷二酸的盐、过氧化氢和在洗涤条件下释放过氧化氢的无机盐，所述盐包括过硼酸盐、过碳酸盐、过硅酸盐和/或过硫酸盐如caroate，以及过氧化氢包合物，例如h2o
2-脲加合物。过氧化氢也可以通过酶体系，即氧化酶及其底物来产生。如果打算使用固体过氧化合物，它们可以以粉末或颗粒的形式使用，它们也可以以原则上已知的方式涂覆。过氧化合物可以本身或以含有过氧化合物的试剂的形式添加到洗涤液中，其原则上可以含有所有常规的洗涤成分、清洁成分或消毒组分。特别优选使用碱金属过碳酸盐或碱金属过硼酸盐一水合物。如果根据本发明的试剂含有过氧化合物，则它们的存在量优选为至多50重量％，特别是5-30重量％，更优选0.1-20重量％。
[0192]
在过水解条件下产生优选具有1-10个碳原子、特别是2-4个碳原子的脂族过氧羧酸和/或任选取代的过苯甲酸的化合物，可以在所述试剂中用作漂白活化剂。带有所述碳原子数的o-酰基和/或n-酰基和/或任选取代的苯甲酰基的物质是适合的。优选多酰化的亚烷基二胺，特别是四乙酰基乙二胺(taed)，酰化的三嗪衍生物，特别是1,5-二乙酰基-2,4-二氧六氢-1,3,5-三嗪(dadht)，酰化的甘脲，特别是四乙酰基甘脲(tagu)，n-酰基酰亚胺，特别是n-壬酰基琥珀酰亚胺(nosi)，酰化的苯酚磺酸盐或羧酸盐或它们的磺酸或羧酸，特别是壬酰氧基苯磺酸盐或异壬酰氧基苯磺酸盐或月桂酰氧基苯磺酸盐(nobs或异nobs或lobs)，4-(2-癸酰氧基乙氧基羰基氧基)-苯磺酸盐(decobs)或癸酰基氧基苯甲酸盐(doba)，羧酸酐，特别是邻苯二甲酸酐，酰化多元醇，特别是三醋精，乙二醇二乙酸酯，2,5-二乙酰氧基-2,5-二氢呋喃和烯醇酯，以及乙酰化山梨糖醇和甘露醇或它们的所述混合物(sorman)，酰化糖衍生物，特别是五乙酰葡萄糖(pag)、五乙酰果糖、四乙酰木糖和八乙酰乳糖，乙酰化的、任选n-烷基化的葡糖胺和葡糖酸内酯，n-酰化的内酰胺，例如n-苯甲酰基己内酰胺，由其形成过酰亚胺酸的腈，特别是具有季氮原子的氨基乙腈衍生物，和/或氧转移磺酰亚胺和/或酰腙。同样优选使用亲水取代的酰基缩醛和酰基内酰胺。还可以使用常规漂白活化剂的组合。这种漂白活化剂，特别是在上述产生过氧化氢的漂白剂的存在下，可以以常规量范围存在，优选以0.5-10重量％，特别是1-8重量％的量存在，基于整个试剂，但是当使用过羧酸作为唯一的漂白剂时，优选完全不存在。
[0193]
除常规漂白活化剂外或代替常规漂白活化剂，固体试剂还可含有磺酰亚胺和/或漂白增强过渡金属盐或过渡金属配合物作为所谓的漂白催化剂。
[0194]
根据本发明的洗涤剂可以含有有机溶剂作为其他组分。有机溶剂的加入对酶稳定性和这些试剂的清洗性能具有有利的影响。优选的有机溶剂衍生自一元醇或多元醇、烷醇胺或二醇醚的组。所述溶剂优选选自乙醇、正丙醇或异丙醇、丁醇、乙二醇、丙二醇、丁二醇、甘油、二甘醇、亚丙基二甘醇、丁基二甘醇、己二醇、乙二醇甲基醚、乙二醇乙基醚、乙二醇丙基醚、乙二醇单正丁基醚、二乙二醇甲基醚、二乙二醇乙基醚、丙二醇甲基醚、丙二醇乙基醚、丙二醇丙基醚、二丙二醇甲基醚、二丙二醇乙基醚、甲氧基三甘醇、乙氧基三甘醇、丁氧基三甘醇、1-丁氧基乙氧基-2-丙醇、3-甲基-3-甲氧基丁醇、丙二醇叔丁基醚以及这些溶剂的混合物。相对于根据本发明的洗涤剂的总重量，这些有机溶剂的重量比优选为0.1至10重量％，更优选0.2至8.0重量％，甚至更优选0.5至5.0重量％。在稳定洗涤剂方面特别有效的特别优选的有机溶剂是甘油和1,2-丙二醇。液体洗涤剂优选包含至少一种多元醇，优选选自甘油和1,2-丙二醇的组，基于洗涤剂的总重量，多元醇的量优选为0.1至10重量％，优选0.2至8.0重量％，更优选0.5至5.0重量％。其他优选的有机溶剂是有机胺和烷醇胺。在所有情况下基于根据本发明的洗涤剂的总重量，根据本发明的洗涤剂优选含有总计0.1至10重量％、更优选0.2至8.0重量％、甚至更优选0.5至5.0重量％的这些胺。乙醇胺是特别优选的烷醇胺。
[0195]
根据本发明的洗涤剂的另一优选组分是糖醇(醛醇)。醛醇类包括式hoch2[ch(oh)]nch2oh的非环状多元醇。所述醛醇包括，例如，甘露醇、异麦芽糖醇、乳糖醇、山梨糖醇和木糖醇、苏糖醇、赤藓醇和阿糖醇。山梨糖醇已经被认为对酶稳定性是特别有利的。相对于洗涤剂的总重量，糖醇的重量比优选为0.1至10重量％，更优选2.0至8.0重量％，甚至更优选3.0至6.0重量％。
[0196]
根据本发明的洗涤剂可以仅含有本文所定义的蛋白酶。或者，它们也可以以对试剂的有效性有利的浓度含有其它酶。因此，本发明的另一实施方式是进一步包含一种或多种其它酶的试剂。优选使用的其他酶是能够在根据本发明的试剂中显示出催化活性的所有酶，特别是脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、单宁酶、木聚糖酶、黄原胶酶(xanthanases)、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过水解酶、氧化酶、氧化还原酶或与根据本发明的蛋白酶不同的其他蛋白酶，以及它们的混合物。基于活性蛋白质，其他酶有利地以1
×
10-8
至5重量％的量存在于试剂中。按照越来越优选的顺序，基于活性蛋白质，每种其他酶以1
×
10-7
至3重量％、0.00001至1重量％、0.00005至0.5重量％、0.0001至0.1重量％和特别优选0.0001至0.05重量％的量存在于根据本发明的试剂中。特别优选地，酶对某些污渍或污点显示出协同清洁性能，即试剂组合物中所含的酶在其清洁性能方面相互支持。非常特别优选地，这种协同作用存在于根据本发明含有的蛋白酶和根据本发明的试剂的其他酶之间，包括特别是所述蛋白酶和淀粉酶和/或脂肪酶和/或甘露聚糖酶和/或纤维素酶和/或果胶酶之间。协同效应不仅可以发生在不同的酶之间，而且可以发生在根据本发明的试剂的一种或多种酶与其它成分之间。根据本发明优选的纺织品洗涤剂具有至少一种蛋白酶和至少一种淀粉酶。在本发明的另一个优选实施方式中，纺织品洗涤剂具有至少一种蛋白酶和至少一种纤维素酶。在进一步优选的实施方式中，纺织品洗涤剂具有至少一种蛋白酶和至少一种脂肪酶。具有3至10种不同酶的纺织品洗涤剂是特别优选的，在对非常广泛的污渍的清洁性能方面，具有3至10种不同类型酶的纺织品洗涤剂可能是特别优选的。
[0197]
蛋白酶的实例是来自解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的枯草杆菌蛋白酶bpn'和来自地衣芽孢杆菌(bacillus licheniformis)的carlsberg，蛋白酶pb92，枯草杆菌蛋白酶147和309，来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶，枯草杆菌蛋白酶dy和酶类热蛋白酶，蛋白酶k和蛋白酶tw3和tw7，它们属于枯草杆菌酶，但不再属于狭义的枯草杆菌蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶carlsberg可根据商品名以开发的形式从novozymes获得。枯草杆菌蛋白酶147和309由novozymes分别以商品名和销售。蛋白酶变体衍生自来自迟缓芽孢杆菌dsm 5483的蛋白酶。适合的其他蛋白酶是，例如，可根据商品名5483的蛋白酶。适合的其他蛋白酶是，例如，可根据商品名progress uno和从novozymes获得的酶，可根据商品名oxp、prime、和preferenz和preferenz从danisco/dupont获得的酶，可根据商品名lavergy pro 104从basf获得的酶，可根据商品名从advanced biochemicals ltd.获得的酶，可根据商品名从wuxi snyder bioproducts ltd.获得的酶，可根据商品名和protease从amano pharmaceuticals ltd.获得的酶，和可根据名称proteinase k-16从kao corp获得的酶。特别优选使用公开在国际专利申请wo 2008/086916 a1和wo 2007/131656 a1中的来自吉氏芽孢杆菌和短小芽胞杆菌的蛋白酶。可有利地使用的其他蛋白酶公开在专利申请wo 91/02792 a1、wo 2008/007319 a2、wo 93/18140 a1、wo 01/44452 a1、gb 1243784 a、wo 96/34946 a1、wo 02/029024 a1和wo 03/057246 a1中。可使用的其他蛋白酶是在微生物嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)，特别是嗜麦芽寡养单胞菌k279a、中间型芽孢杆菌(bacillus intermedius)和球形芽孢杆菌(bacillus sphaericus)中天然存在的那些。
[0198]
淀粉酶的实例是来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶，以及特别是已经改进用于洗涤剂或清洁剂的它们的开发型。来自地衣芽孢杆菌的酶可从novozymes以名称和从danisco/dupont以名称st获得。这些α-淀粉酶的开发产品可根据商品名和ultra(均来自novozymes)、oxam(danisco/dupont)和(daiwa seiko inc.)获得。来自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶由novozymes以商品名销售，并且来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶的衍生变体同样由novozymes以商品名和销售。此外，为该目的，应强调来自芽孢杆菌属物种(bacillus sp.)a7-7(dsm 12368)的α-淀粉酶和来自bacillus agaradherens(dsm9948)的环糊精葡聚糖转移酶(cgtase)。此外，可使用国际专利申请wo 95/26397a1、wo 96/23873a1、wo 99/23211a1、wo 00/60060a2、wo 03/002711a2、wo 03/054177a2、wo 2006/002643a2、wo 2007/079938a2、wo 2011/100410a2和wo 2013/003659a1中公开的分解淀粉酶。还可以使用所有提及的分子的融合产物。此外，可从novozymes以商品名获得的来自黑曲霉(aspergillus niger)和米曲霉(a.oryzae)的α-淀粉酶的开发物是适合的。可有利使用的其他市售产品例如是，和或ultra或plus以及amplify
tm 12l或amplify prime
tm 100l，后者同样来自novozymes，以及来自danisco/
dupont的preferenz系列，包括例如preferencepreference或preference根据本发明，也可以使用可以通过点突变获得的这些酶的变体。
[0199]
优选的淀粉酶包含a)α-淀粉酶，所述α-淀粉酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:2中所给出的氨基酸序列至少80％、并且按照递增优选的顺序至少81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，并且在根据seq id no:2的编号中的位置172、202、208、255和261的一个位置处具有至少一个氨基酸取代，优选选自由m202l、m202v、m202s、m202t、m202i、m202q、m202w、s255n、r172q和它们的组合组成的组。更优选所述淀粉酶包含氨基酸取代m202l或m202t。
[0200]
进一步优选的淀粉酶包含b)α-淀粉酶，所述α-淀粉酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:3中所给出的氨基酸序列至少60％、并且按照递增优选的顺序至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，并且在根据seq id no:3的编号中的位置9、26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、195、202、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、320、323、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、458、461、471、482和484的一个位置处具有至少一个氨基酸取代，和/或在位置183和184的一个位置处具有缺失。特别优选的淀粉酶在位置9、26、149、182、186、202、257、295、299、323、339和345的一个位置处具有至少一个氨基酸取代，和/或特别优选至少一个选自由r118k、d183*、g184*、n195f、r320k、r458k和它们的组合组成的组的氨基酸取代或缺失。非常特别优选的淀粉酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:3中所给出的氨基酸序列至少60％、按照递增优选的顺序至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％相同，并且具有下述氨基酸取代或缺失组合之一：
[0201]
(i)m9l+m323t；
[0202]
(ii)m9l+m202l/t/v/i+m323t；
[0203]
(iii)m9l+n195f+m202l/t/v/i+m323t；
[0204]
(iv)m9l+r118k+d183*+g184*+r320k+m323t+r458k；
[0205]
(v)m9l+r118k+d183*+g184*+m202l/t/v/i+r320k+m323t+r458k；
[0206]
(vi)m9l+g149a+g182t+g186a+m202l+t257i+y295f+n299y+m323t+a339s+e345r；
[0207]
(vii)m9l+g149a+g182t+g186a+m202i+t257i+y295f+n299y+m323t+a339s+e345r；
[0208]
(viii)m9l+r118k+g149a+g182t+d183*+g184*+g186a+m202l+t257i+y295f+n299y+r320k+m323t+a339s+e345r+r458k；
[0209]
(ix)m9l+r118k+g149a+g182t+d183*+g184*+g186a+m202i+t257i+y295f+n299y+r320k+m323t+a339s+e345r+r458k；
[0210]
(x)m9l+r118k+d183*+d184*+n195f+m202l+r320k+m323t+r458k；
[0211]
(xi)m9l+r118k+d183*+d184*+n195f+m202t+r320k+m323t+r458k；
[0212]
(xii)m9l+r118k+d183*+d184*+n195f+m202i+r320k+m323t+r458k；
[0213]
(xiii)m9l+r118k+d183*+d184*+n195f+m202v+r320k+m323t+r458k；
[0214]
(xiv)m9l+r118k+n150h+d183*+d184*+n195f+m202l+v214t+r320k+m323t+r458k；
[0215]
(xv)m9l+r118k+d183*+d184*+n195f+m202l+v214t+r320k+m323t+e345n+r458k。
[0216]
进一步优选的淀粉酶包含c)α-淀粉酶，所述α-淀粉酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:4中所给出的氨基酸序列至少90％相同，并且任选在根据seq id no:4的编号中的位置93、116、118、129、133、134、140、142、146、147、149、151、152、169、174、183、184、186、189、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、235、243、244、260、262、284、303、304、320、338、347、359、418、431、434、439、447、458、469、476和477的一个位置处具有至少一个取代和/或缺失，优选在位置183和184处的氨基酸缺失。优选的氨基酸取代包含e260a/d/c/q/l/m/f/p/s/w/v/g/h/i/k/n/r/t/y、g304r/k/e/q、w140y/f、w189e/g/t、d134e、f262g/p、w284d/h/f/y/r、w347h/f/y、w439r/g、g476e/q/r/k、g477e/q/k/m/r、n195f/y、n197f/l、y198n、y200f、y203f、i206h/l/n/f/y、h210y、e212v/g、v213a、m116t、q129l、g133e、e134y、k142r、p146s、g147e、g149r、n151r、y152h、q169e、n174r、a186r、y243f、s244q、g303v、r320n、r359i、n418d和a447v。
[0217]
纤维素酶(内切葡聚糖酶，eg)的实例包括富含内切葡聚糖酶(eg)的真菌纤维素酶制剂和其开发型，这些由novozymes以商品名提供。同样可从novozymes获得的产品和是分别基于来自humicola insolens dsm 1800的50kd-eg和43kd-eg。可使用的来自该公司的其它商业产品是和还可以使用纤维素酶，例如，可从ab enzymes以商品名和获得的，其至少部分基于来自melanocarpus的20kd-eg。来自ab enzymes的其它纤维素酶是和其它适合的纤维素酶来自芽孢杆菌属cbs670.93和cbs 669.93，其中来自芽孢杆菌属cbs 670.93的纤维素酶可从danisco/dupont以商品名获得。可使用的来自danisco/dupont的其它商业产品是"genencor detergent cellulase l"和neutra。
[0218]
可使用的其它酶是，例如脂肪酶或角质酶，特别是由于它们的甘油三酯切割活性，以及用于由适合的前体原位产生过氧酸。这些包括，例如，最初可以从疏棉状腐质霉(humicola lanuginosa)(疏棉状嗜热丝孢菌(thermomyces lanuginosus))获得或已经由其开发的脂肪酶，特别是由所述脂肪酶开始，在位置d96l、t213r和/或n233r处、特别优选t213r和n233r处具有一个或多个下述氨基酸交换的那些。脂肪酶例如由novozymes公司以商品名ultra、和销售。可有利地使用的另一脂肪酶可从novozymes以商品名获得。此外，例如，还可以使用最初从fusarium solani pisi和特异腐质霉(humicola insolen)中分离的角质酶。同样适合的脂肪酶可从amano以名称lipaselipaselipase或lipaselipase芽孢杆菌属lipaselipase和lipase获得。例如，可使用来自danisco/dupont公司的脂肪酶或角质酶，其起始酶最初从门多萨假单胞菌(pseudomonas mendocina)和茄病镰刀菌(fusarium solanii)中分离。作为其它重要的商业产品，应提及由danisco/genencor销售的制剂m1和由meito sangyo kk以名称lipase和lipase销售的酶，和来自danisco/dupont的产品
[0219]
为了提高漂白效果，根据本发明可以使用氧化还原酶如氧化酶，加氧酶，过氧化氢酶，过氧化物酶如卤代、氯代、溴代、木质素、葡萄糖或锰过氧化物酶，双加氧酶或漆酶(酚氧化酶、多酚氧化酶)。有利地，另外添加与酶相互作用的有机化合物，特别优选芳族化合物，以增强相关氧化还原酶(增强剂)的活性，或者在氧化还原电势显著不同的情况下，确保氧化酶和污渍(介体)之间的电子流动。
[0220]
在本发明范围内使用的酶可以例如最初来源于微生物，例如芽孢杆菌属、链霉菌属(streptomyces)、腐质霉属(humicola)或假单胞菌属(pseudomonas)，和/或可以通过适合的微生物使用本身已知的生物技术方法生产，例如通过转基因表达宿主，例如埃希氏菌属(escherichia)或芽孢杆菌属，或通过丝状真菌。需要强调的是，特别是还可以涉及相关酶的工业酶制剂，即可以存在伴随物质。因此，酶可以与伴随物质例如来自发酵的物质或与其他稳定剂一起包装和使用。
[0221]
根据本发明的试剂有利地以每克所述试剂2μg至20mg、优选5μg至17.5mg、特别优选20μg至15mg和最特别优选50μg至10mg的量含有所述蛋白酶。在各种实施方式中，基于试剂的总重量，本文描述的蛋白酶(活性酶)在试剂中的浓度为》0至1重量％，优选0.001至0.1重量％。
[0222]
此外，试剂中所含的蛋白酶和/或试剂的其它成分可以用在室温下或在没有水的情况下酶不可渗透的物质涂覆，该物质在试剂的使用条件下变得可渗透酶。因此，本发明的这种实施方式的特征在于，所述蛋白酶被在室温下或在不存在水的情况下对所述蛋白酶不可渗透的物质涂覆。此外，洗涤剂本身可以包装在容器中，优选透气容器中，洗涤剂在使用前不久或在洗涤过程中从该容器中释放出来。
[0223]
洗涤剂中所含的相同或不同类型的蛋白酶和/或任选的存在另外的酶可以吸附在载体材料上和/或包埋在涂覆物质中以防止它们过早失活。然后酶释放到洗涤液中，即在应用条件下，并可以发挥其催化作用。优选的包装形式具有0.05至15重量％，特别是至多10重量％的所述蛋白酶的活性蛋白质。
[0224]
根据本发明的洗涤剂以递增优选的顺序含有1
×
10-8
至5重量％、0.0001至1重量％、0.0005至0.5重量％、0.001至0.1重量％的量的所述蛋白酶，在所有情况下基于活性蛋白质。
[0225]
在本文描述的试剂中，待使用的酶还可以与例如来自发酵的伴随物质一起配制。在液体配制剂中，酶优选作为酶液体配制剂形式使用。酶通常不是以纯蛋白质的形式提供，而是以稳定的、可储存和运输的制剂的形式提供。这些预先包装的制剂包括例如通过造粒、挤出或冻干获得的固体制剂，或特别是在液体或凝胶试剂的情况下，酶的溶液，其有利地尽可能浓缩、具有低水含量和/或补充有稳定剂或其它助剂。或者，对于固体和液体施用形式，还可以将酶包封，例如通过将酶溶液与优选天然聚合物一起喷雾干燥或挤出，或者以胶囊的形式包封，例如其中酶被包封在固化凝胶中的那些，或者其中含酶的核被水、空气和/或化合物不可渗透的保护层涂覆的核-壳型的那些。在覆盖层中，可以另外施加其它活性成分，例如稳定剂、乳化剂、颜料、漂白剂或染料。这种胶囊通过本身已知的方法施加，例如通过摇动或辊式造粒或在流化床工艺中施加。有利地，这种颗粒例如由于施加聚合物成膜剂而具有低粉尘，并且由于涂覆而具有储存稳定性。此外，可以将两种或多种酶配制在一起，
使得单个颗粒显示出多种酶活性。
[0226]
还可以将酶并入水溶性膜中，例如在配制单位剂量形式的洗涤剂中使用的那些。这种膜允许酶在与水接触后释放。如本文所用的"水溶性"是指优选完全水溶性的膜结构。优选地，这种膜由(完全或部分水解的)聚乙烯醇(pva)组成。
[0227]
本发明的实施方式包括根据本发明的试剂的所有固体、粉末、颗粒、片剂形式、液体、凝胶或糊状施用形式，其任选也可以由多相组成，并且可以以压缩或非压缩形式存在。所述试剂可以作为自由流动的粉末存在，特别是具有300至1,200g/l，特别是500至900g/l或600至850g/l的堆密度。所述试剂的固体剂型还包括含有固体试剂的挤出物、颗粒、片剂或小袋，其可以以大包装和分份包装的形式存在。或者，所述试剂也可以是液态的、凝胶状的或糊状的，例如以非水性的液体洗涤剂或非水性的糊剂的形式或以水性的液体洗涤剂或含水的糊剂的形式。此外，所述试剂可以作为单组分体系存在。这种试剂由单个相组成。或者，试剂也可以由多个相组成(多组分体系)。这种试剂因此被分成若干组分，例如两种液体、两种固体或一种液体和一种固相。基于水和/或有机溶剂的液体呈现形式可以以凝胶形式、以增稠形式存在。
[0228]
根据本发明的定义，如果物质例如组合物或试剂在25℃和1013毫巴下是固体聚集态，则其为固体。
[0229]
根据本发明的定义，如果物质例如组合物或试剂在25℃和1013毫巴下是液体聚集态，则其为液体。液体还包括凝胶形式。
[0230]
如果根据本发明的洗涤剂是液体形式，则它们优选含有大于40重量％、优选50至90重量％和特别优选60至80重量％的水，基于它们的总重量。
[0231]
本发明还涉及一种用于清洁纺织品的方法，在该方法中，在至少一个方法步骤中使用根据本发明的纺织品洗涤剂，尤其是液体纺织品洗涤剂。这包括手动和机器方法，优选机器方法，因为它们可以更精确地控制，例如在使用的数量和接触时间方面。用于清洁纺织品的方法的特征通常在于如下事实，在一个或多个方法步骤中，将不同的清洁活性物质施加到待清洁的材料上，并在曝露时间之后将其洗掉，或者用洗涤剂或该试剂的溶液或稀释液以其它方式处理待清洁的材料。
[0232]
在各种实施方式中，所述方法的特征在于，所述蛋白酶在0至100℃、优选10至70℃、更优选30至50℃和最优选20至40℃的温度下使用。特别是，在10至60℃、优选15至50℃、更优选20至40℃的温度下进行的方法中，与包含通常使用的蛋白酶的纺织品洗涤剂相比，消费者可以看得见使用根据本发明的纺织品洗涤剂的优点。
[0233]
对于根据本发明的纺织品洗涤剂描述的所有要素、主题和实施方式也可适用于本发明的该主题。因此，当指出该公开内容也适用于根据本发明的上述方法时，在这一点上明确地参考相应位置的公开内容。
[0234]
本发明的本主题的替代实施方式还包括用于处理纺织品原料或用于纺织品护理的方法，其中根据本发明的蛋白酶在至少一个方法步骤中变得具有活性。这些之中，优选用于包含天然成分的纺织品原料、纤维或纺织品的方法，非常特别优选用于包含羊毛或丝绸的这种材料、纤维或纺织品。
[0235]
根据本发明的洗涤剂中使用的蛋白酶可以有利地根据上述陈述用于纺织品洗涤剂和洗涤纺织品的方法中。因此，它们可以有利地用于在相应的试剂和方法中提供蛋白水
解活性。
[0236]
最后，本发明还包括本文描述的蛋白酶在洗涤剂中的用途，例如如上所述，用于蛋白酶敏感的污渍的(改进的)去除，例如从纺织品去除。在该用途的优选实施方式中，在洗涤之前，所述蛋白酶在洗涤剂中储存3天或更多天、4天或更多天、7天或更多天、10天或更多天、12天或更多天、14天或更多天、21天或更多天或28天或更多天。
[0237]
因此，本发明进一步涉及
[0238]-根据本发明的试剂用于清洁纺织品的用途，和/或
[0239]-包含如下氨基酸序列的蛋白酶在纺织品洗涤剂、优选液体纺织品洗涤剂中用于去除纺织品上的蛋白酶敏感的污渍的用途，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq idno:1中所给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有：(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3t、4i、99e和199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，其特别是选自n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、256d、l256e和l256q，所述纺织品洗涤剂具有约9至约12的ph值，所述ph值在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量，
[0240]
特别是使得所述蛋白酶在每种情况下以每克所述试剂2μg至20mg、优选5μg至17.5mg、特别优选20μg至15mg和最特别优选50μg至10mg的量使用。
[0241]
特别优选的实施方式是例如手洗、从纺织品上手动去除污渍或与机械方法结合使用。
[0242]
对于根据本发明的蛋白酶和含有它们的试剂所描述的所有要素、主题和实施方式也可适用于本发明的该主题。因此，当指出该公开内容也适用于根据本发明的上述用途时，在此明确参考相应位置的公开内容。
实施例
[0243]
在液体洗涤剂中的储存稳定性的测定
[0244]
使用的洗涤剂基质
[0245]
使用如表1中所示的可商购获得的液体洗涤剂。
[0246]
表1a：配方a
[0247]
成分配方a(以重量％计)柠檬酸1-4％消泡剂《1％faeos(阴离子表面活性剂)2-5％faeo(非离子表面活性剂)5-9％las(阴离子表面活性剂)7-12％棕榈仁油脂肪酸1-3％单乙醇胺2-6％naoh 50％0.3-2％
甘油0.5-3％1,2-丙二醇4-8％hedp0.5-2％去污聚合物0.2-1％硼酸0.5-1.5％软化水加至100％
[0248]
没有香料、酶和光学增亮剂；剂量3.17g/l
[0249]
配方a在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量的ph为ph10。
[0250]
表1b：配方b
[0251][0252]
配方b在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量的ph为ph 11。
[0253]
使用下述蛋白酶：
[0254]
c1：来自wo 2013/060621a1的根据seq id no:2的蛋白酶
[0255]
c2：来自迟缓芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶309
[0256]
e1：seq id no:1+s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w；
[0257]
e2：seq id nq:1+s3t+v4l+r99e+v199l+q200l+y203w+s154d+l256e；
[0258]
储存
[0259]
所述蛋白酶存在于生物反应器中产生的上清液中的地衣芽孢杆菌中。将所述蛋白酶稀释至相同的活性水平。将90％洗涤剂基质(配方a或配方b)与10％适当稀释的地衣芽孢杆菌上清液混合，并充分混合。在密封容器在30℃或40℃下储存两周、四周或十周之前，测定每批中的酶活性(起始值)。通过在室温下搅拌20min，将取出的样品量溶解在0.1m tris/hcl(ph 8.6)中。然后，如下所述进行aapf试验。
[0260]
蛋白酶活性试验(aapf试验)
[0261]
蛋白酶的活性通过从底物琥珀酰丙氨酸-丙氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸-对硝基苯胺(aapfpna；bachem l-1400)中释放对硝基苯胺生团来测定。pna的释放引起410nm处吸光度的增加，其随时间的变化是酶活性的量度。
[0262]
测量在25℃温度、8.6的ph和410nm的波长下进行。测量时间为5分钟，测量间隔为20-60秒。
[0263]
测量方法：
[0264]
10μl aapf溶液(70mg/ml)
[0265]
1000μl tris/hcl(0.1m，ph 8.6，具有0.1％ brij 35)
[0266]
10μl稀释的蛋白酶溶液
[0267]
在25℃(410nm)下在5分钟内产生的动力学
[0268]
结果
[0269]
在上述洗涤剂基质中储存后以％表示的剩余活性显示如下。以％表示的剩余活性基于储存前的相关酶活性(起始值)。
[0270]
表2：在配方a(ph 10)中在30℃或40℃下储存两周
[0271][0272]
表3：在配方b(ph 10；通过添加柠檬酸调节)中在30℃或40℃下储存两周
[0273][0274]
表4：在配方b(ph 11)中在30℃下储存2、4或10周
[0275][0276]
当在30℃和40℃下储存2至10周时，与比较的蛋白酶c1和c2相比，根据本发明的蛋白酶e1和e2在各种高碱性洗涤剂制剂中显示出显著更高的储存稳定性。
技术特征：
1.一种纺织品洗涤剂，特别是液体纺织品洗涤剂，其包含a)至少一种蛋白酶，其中所述蛋白酶具有蛋白水解活性并包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在每种情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3t、4i、99e和199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，其特别是选自n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、256d、l256e和l256q，和b)至少一种洗涤剂成分，优选含量为0.01-99.9重量％，其中所述纺织品洗涤剂在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量的ph为约9至约12。2.根据权利要求1所述的洗涤剂，其中所述蛋白酶包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列至少70％、并且按递增优选的顺序至少71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、90.5％、91％、91.5％、92％、92.5％、93％、93.5％、94％、94.5％、95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％和98％相同，并且，在每种情况下基于根据seq id no:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置处的氨基酸取代s3t、v4i、r99e和v199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的至少一个位置处的至少一个另外的氨基酸取代，其中所述至少一个氨基酸取代选自n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、256d、l256e和l256q。3.根据权利要求1或2所述的洗涤剂，其中在每种情况下基于根据seq id no:1的编号，所述蛋白酶具有下述氨基酸取代变体之一：(i)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w；(ii)s3t+v4i+r99e+v199i+n212s；(iii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d；(iv)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+l256e；(v)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+s154d+l256e；(vi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l+y203w；(vii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+y203w+l256e；(viii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+n212s；(ix)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+y203w+l256e；(x)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+y203w；(xi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+s154d+q200l+l256e；(xii)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+q200l；(xiii)s3t+v4i+r99e+v199i+s154d+q200l+y203w；(xiv)s3t+v4i+r99e+v199i+q200l+y203w+l256e；
(xv)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+r143w+y161t+q200l；(xvi)s3t+v4i+r99e+v199i+n74d+r143y+a209w+n212s+l256e；(xvii)s3t+v4i+r99e+v199i+a136q+s154d+v171l+q200l。4.根据权利要求1至3任一项所述的洗涤剂，其中基于洗涤剂的总重量，所述洗涤剂含有1
×
10-8
至5重量％的量，并且以递增优选的顺序含有0.0001-1重量％、0.0005-0.5重量％、0.001-0.1重量％的量的所述蛋白酶。5.根据权利要求1至4任一项所述的洗涤剂，其中所述试剂包含至少一种其它酶，所述其它酶选自淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶、甘露聚糖酶、单宁酶、木聚糖酶、黄原胶酶、木葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶、卡拉胶酶、过水解酶、氧化酶、氧化还原酶、脂肪酶和它们的组合，优选至少一种淀粉酶。6.根据权利要求5所述的洗涤剂，其中所述至少一种其它酶是淀粉酶和其中所述淀粉酶选自：a)α-淀粉酶，其包含在其整个长度上与seq id no:2中所给出的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列，并且任选在根据seq id no:2的编号中的位置172、202、208、255和261的一个处具有至少一个氨基酸取代，优选选自m202l、m202v、m202s、m202t、m202i、m202q、m202w、s255n、r172q和它们的组合；和/或b)α-淀粉酶，其包含在其整个长度上与seq id no:3中所给出的氨基酸序列具有至少60％同一性的氨基酸序列，和在根据seq id no:3的编号中，任选具有在位置9、26、30、33、82、37、106、118、128、133、149、150、160、178、182、186、193、195、202、203、214、231、256、257、258、269、270、272、283、295、296、298、299、303、304、305、311、314、315、318、319、320、323、339、345、361、378、383、419、421、437、441、444、445、446、447、450、458、461、471、482和484的一个处的至少一个氨基酸取代，和/或在位置183和184之一处的缺失，优选在位置9、26、149、182、186、202、257、295、299、323、339和345的一个处的至少一个氨基酸取代，和/或特别优选选自r118k、d183*、g184*、n195f、r320k、r458k和它们的组合的至少一个氨基酸取代或缺失；和/或c)α-淀粉酶，其包含在其整个长度上与seq id no:4中所给出的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列，并且任选在根据seq id no:4的编号中的位置93、116、118、129、133、134、140、142、146、147、149、151、152、169、174、183、184、186、189、193、195、197、198、200、203、206、210、212、213、235、243、244、260、262、284、303、304、320、338、347、359、418、431、434、439、447、458、469、476和477的一个处具有至少一个取代和/或缺失，优选在位置183和184处的氨基酸缺失。7.根据权利要求1至6任一项所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂成分选自：表面活性剂、助洗剂、络合剂、聚合物、玻璃腐蚀抑制剂、腐蚀抑制剂、漂白剂如过氧化合物、漂白活化剂或漂白催化剂、水混溶性有机溶剂、酶稳定剂、螯合剂、电解质、ph调节剂和/或其它助剂如光学增亮剂、泛灰抑制剂、染料转移抑制剂、泡沫调节剂、染料和香料以及它们的组合。8.根据权利要求1至7任一项所述的洗涤剂，其包含a)5-20重量％、特别是9-17重量％的阴离子表面活性剂，和/或b)1-20重量％、特别是5-9重量％的非离子表面活性剂，和/或c)0.5-10重量％、特别是1-4重量％的水溶性的有机助洗剂物质，特别是柠檬酸和/或
柠檬酸盐，和/或d)0.01-5重量％、特别是0.5-2重量％的络合剂，特别是hedp，和/或e)0.01-5重量％、特别是0.2-1重量％的泛灰抑制剂，和/或f)0.01-5重量％的泡沫抑制剂。9.根据权利要求1至7任一项所述的洗涤剂，其包含a)0-10重量％、特别是1-3重量％的阴离子表面活性剂，和/或b)5-20重量％、特别是10-18重量％的非离子表面活性剂，和/或c)1-10重量％、特别是1.5-3重量％的水溶性的或水可分散的无机助洗剂材料，和/或d)0-1重量％、特别是0.01-0.5重量％的香料，和/或e)0.01-5重量％、特别是0.05-0.5重量％的光学增亮剂。10.根据权利要求1至9任一项所述的洗涤剂，其中其在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中的ph为约9至约12、特别是约9.5至约11.5、更优选约10至约11、特别优选约ph 10。11.一种清洁纺织品的方法，其特征在于在至少一个方法步骤中，使用根据权利要求1至10任一项的试剂。12.根据权利要求1至10任一项的洗涤剂的用途，其用于从纺织品去除蛋白酶敏感的污渍。13.包含如下氨基酸序列的蛋白酶在纺织品洗涤剂、优选液体纺织品洗涤剂中的用途，用于去除纺织品上的蛋白酶敏感的污渍，所述氨基酸序列在其整个长度上与seq id no:1中所给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于根据seq id no:1的编号，具有：(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3t、4i、99e和199i，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，其特别是选自n74d、n74e、n74q、a136q、r143l、r143w、r143y、s154d、s154q、y161t、a163g、v171l、q200a、q200l、q200s、q200t、y203k、y203v、y203w、a209w、n212s、n212t、256d、l256e和l256q，其中所述纺织品洗涤剂具有约9至约12的ph值，所述ph值在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量。
技术总结
本发明涉及纺织品洗涤剂，特别是液体纺织品洗涤剂，其包含a)至少一种蛋白酶，所述蛋白酶具有蛋白水解活性并包含如下氨基酸序列，所述氨基酸序列在其整个长度上与SEQ ID O:1中给出的氨基酸序列具有至少70％的序列同一性，并且在所有情况下基于SEQ ID O:1的编号，具有(i)在对应于位置3、4、99或199的位置的至少两个处的至少两个氨基酸取代，特别是氨基酸取代3T、4I、99E和199I，和(ii)在对应于位置74、136、143、154、161、163、171、200、203、209、212或256的位置的至少一个处的至少一个另外的氨基酸取代，其特别是选自74D、74E、74Q、A136Q、R143L、R143W、R143Y、S154D、S154Q、Y161T、A163G、V171L、Q200A、Q200L、Q200S、Q200T、Y203K、Y203V、Y203W、A209W、212S、212T、256D、L256E和L256Q，和b)具有至少一种洗涤剂成分，优选其量为0.01至99.9重量％，其中所述织物洗涤剂具有约9至约12的pH值，所述pH值在20℃下在去离子水中的1重量％溶液中测量。本发明还涉及清洁纺织品的相应方法，在该方法中，使用根据本发明的试剂，并涉及根据本发明的试剂用于从纺织品去除蛋白酶敏感的污渍的用途。于从纺织品去除蛋白酶敏感的污渍的用途。
