一种重组腺病毒及其应用
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组腺病毒及其应用。
背景技术：
2.猪肠道冠状病毒(包括α冠状病毒属传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪流行性腹泻病毒(pedv)和2017年新出现的猪急性腹泻综合征冠状病毒(sads-cov)和猪德尔塔冠状病毒(pdcov))是引起仔猪腹泻的主要病原，这些猪肠道冠状病毒体内主要感染小肠，可引起新生仔猪急性腹泻，迅速脱水，表现相似的临床症状和病理变化。其中pedv导致的腹泻占60％以上的新生仔猪腹泻，危害最大，导致高达100％的发病率和死亡率，给现有的养猪业造成重大经济损失。但由于pedv主要感染肠道，肠道局部黏膜免疫在抗pedv感染中起着关键作用。尽管市场有针对pedv的商品化疫苗，但由于商品疫苗诱导黏膜免疫效果较差，且目前的疫苗主要是通过接种母猪由母乳提供仔猪被动保护，因此对仔猪的免疫保护效果并不理想，pedv引起的新生仔猪腹泻依然时常发生，给现有养猪业带来巨大损失。因此，迫切需要研发一种对pedv紧急的制剂。
3.pedv在体内主要感染猪肠道上皮细胞，肠道黏膜免疫对于机体抵抗pedv感染至关重要。il-10家族细胞因子ifn-l和il-22选择性作用于黏膜上皮细胞，如呼吸道、肠道等。其在黏膜上皮屏障抗感染过程中发挥着重要作用。
技术实现要素：
4.为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种重组腺病毒及其应用。
5.第一方面，本发明提供重组腺病毒，包括：猪干扰素λ3和猪白介素22的基因序列。
6.进一步地，所述猪干扰素λ3包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；所述猪白介素22包括如seq id no.2所示的氨基酸序列。
7.进一步地，所述猪干扰素λ3由如seq id no.3所示的核苷酸序列编码得到；所述猪白介素22由seq id no.4所示的核苷酸序列编码得到。
8.进一步地，所述重组腺病毒包括：
9.顺序排列的猪干扰素λ3、furin蛋白酶切割位点、f2a元件和猪白介素22。
10.优选地，在猪干扰素λ3和猪白介素22的n还包括信号前导序列。
11.进一步优选地，所述信号前导序列包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。
12.进一步地，所述重组腺病毒包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。
13.本发明进一步提供所述重组腺病毒的制备方法，包括：
14.构建含有猪干扰素λ3和猪白介素22的基因序列的重组腺病毒质粒；
15.使用所述重组腺病毒质粒转染hek293细胞，培养后获得重组腺病毒。
16.本发明进一步提供包括所述重组腺病毒和试剂盒。
17.本发明进一步提供所述重组腺病毒在抑制猪肠道冠状病毒中的应用。
18.本发明进一步提供所述重组腺病毒在制备抑制猪肠道冠状病毒的药物中的应用。
19.本发明进一步提供所述重组腺病毒在制备猪急性腹泻的药物中的应用。
20.本发明具备如下有益效果：
21.本发明通过在猪三型干扰素lambda 3(ifn-λ3)和猪白介素22(il-22)的n端分别插入一个信号前导序列，并在猪ifn-λ3和il-22之间插入furin蛋白酶切割位点和f2a元件，利用人5型缺陷性腺病毒进行分泌表达。结果发现这样的重组腺病毒能够同时分泌表达猪ifn-λ3和il-22，并具有极佳的体外和体内抑制pedv病毒效果。
22.令人惊讶的是，在临床生产实践中该重组腺病毒对于早期pedv感染的新生仔猪效果显著，能够显著降低新生仔猪的死亡率和改善仔猪的状态，促进康复。这对于临床应用具有不可估量的价值。
23.本发明所提供的重组腺病毒，具有良好的安全性以及体内和体外抗病毒效果，pedv感染效果显著优于目前市场上的药物或制剂，因而具有广阔的临床应用前景。
附图说明
24.图1为本发明实施例1提供的重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22质粒的构建示意图。
25.图2为本发明实施例1提供的重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22体外分泌表达的猪il-22的elisa结果。
26.图3为本发明实施例1提供的重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22体外抑制pedv感染的间接免疫荧光结果。
具体实施方式
27.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
28.实施例1
29.1、重组质粒pshuttle-ifn-λ3-il-22的构建
30.质粒构建示意图如图1所示，先直接合成5’端带有kpni酶切位点和3’端带有xhoi酶切位点的核苷酸序列(包括猪成熟ifn-λ3和il-22)，其中猪成熟ifn-λ3和il-22的核苷酸序列经过密码子优化，并在猪ifn-λ3和il-22之间插入furin蛋白酶切割位点和f2a元件。由北京六合华大基因科技有限公司制成穿刺菌种，涂板，提取质粒。利用kpn i/xho i双酶切该质粒获得的ifn-λ3-il-22基因片段(核苷酸序列如seq id no.6所示，编码得到的氨基酸序列如seq id no.7所示)克隆到pshuttle-cmv穿梭载体中，构建重组穿梭载体pshuttle ifn-λ3-il-22，通过kpn i和xho i双酶切和测序鉴定。
31.2、重组质粒pad-ifn-λ3-il-22的构建
32.其中，bj5183感受态细胞的制备方法可参见中国专利申请cn201810651914.2)。将1μg线性化的pshuttle-ifn-λ3-il-22重组穿梭质粒与0.1μg adeasytm质粒加入到bj5183感受态中进行电转化，经同源重组构建重组腺病毒质粒pad5-ifn-λ3-il-22，并通过pac i单酶切鉴定。
33.3、重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22的产生
34.待6孔板中的hek293细胞培养至80％-90％密度时进行下述的质粒转染：将4μg pad5-ifn-λ3-il-22用pac i酶切线性化后，分别与lip3000试剂混合后转染hek293细胞。转染8h后将培养液换成含有3％fbs的培养液。于37℃、5％co2培养10d～12d直至出现细胞病
变(cpe)后，反复冻融离心收获上清，获得重组pad5-ifn-λ3-il-22腺病毒。
35.用hek293悬浮细胞进行扩增病毒。并利用商品试剂盒如adeno-x
tm
rapid titer kit，按照说明书测定重组病毒pad5-ifn-λ3-il-22的滴度。
36.4、重组腺病毒体外分泌表达猪ifn-λ3和il-22的鉴定
37.将pad5-ifn-λ3-il-22以moi＝5感染hek293细胞，48h收获细胞培养上清。通过猪白介素-22elisa试剂盒检测细胞培养上清中分泌表达的il-22。其结果见图2.
38.5、重组腺病毒体外分泌表达猪ifn-λ3和il-22的对pedv抑制活性的检测
39.重组pad5-ifn-λ3-il-22转染hek293细胞48小时后的培养上清分别做5，25，125，和625倍的稀释，取100μl稀释上清预处理vero细胞24小时后，然后用100μl pedv cv777株(4000tcid
50
/ml，含3μl/ml 0.25％胰酶，1％sp)感染，37℃孵育1h后加入到96孔板中生长良好的vero细胞中，37℃孵育2h后，加入3％fbs的dmem继续培养。36h后，分别收取细胞，通过间接免疫荧光检测pedv感染。结果如图3所示：重组pad5-ifn-λ3-il-22转染hek293细胞48小时后的培养上清显著抑制pedv感染，并剂量依赖性反应。证明重组pad5-ifn-λ3-il-22能够表达ifn-λ3并具有抗病毒功能。
40.6、pad5-ifn-λ3-il-22临床保护实验
41.选用初产母猪所产的新生3-11日龄仔猪出现pedv腹泻14圈，共163头仔猪，分为2组，未处理组1圈仔猪8头，其余13圈共155头仔猪为干扰素组。在仔猪出现临床症状时分别肌肉注射生理盐水或pad5-ifn-λ3-il-22制品，注射剂量均按每头仔猪体重1
×
10
10
ifu，各组同条件下饲养，观察仔猪临床症状，记录死亡的仔猪数量，计算成活率。并在仔猪断奶后测量存活仔猪的断奶末重。结果如表1所示。
42.表1重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22生产实践中的pedv腹泻的结果
[0043][0044]
猪流行腹泻病毒(pedv)感染新生仔猪后，往往造成高达100％的发病率和死亡率。如表1中所示，未经过pad5-ifn-λ3-il-22处理的对照仔猪发生流行性腹泻，导致近90％的死亡。而且即使存活的仔猪由于pedv感染导致肠道损伤，成为僵猪，表现为仔猪断奶末重低。当仔猪出现腹泻症状，一次性肌肉注重组腺病毒pad5-ifn-λ3-il-22 1
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ifu后，新生仔猪成活率达到89.03％，比对照组提高了7倍，而且仔猪断奶末重达到5公斤以上，和正常猪没有显著差异。这些结果证明该制剂在临床生产中能够对pedv引起的新生仔猪病毒性腹泻具有较好的效果。
[0045]
此外，除了pedv，ifn-λ对其它常见病毒性腹泻病原包括猪传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪德尔塔病毒(pdcov)和轮状病毒都具有抑制作用，因此该制剂具有对常见仔猪病毒性腹泻都具有作用。
[0046]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
技术特征：
1.一种重组腺病毒，其特征在于，包括：猪干扰素λ3和猪白介素22的基因序列。2.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述猪干扰素λ3包括如seq id no.1所示的氨基酸序列；和/或，所述猪白介素22包括如seq id no.2所示的氨基酸序列。3.根据权利要求2所述的重组腺病毒，其特征在于，所述猪干扰素λ3由如seq id no.3所示的核苷酸序列编码得到；和/或，所述猪白介素22由seq id no.4所示的核苷酸序列编码得到。4.根据权利要求1-3任一项所述的重组腺病毒，其特征在于，包括：顺序排列的猪干扰素λ3、furin蛋白酶切割位点、f2a元件和猪白介素22；优选地，在猪干扰素λ3和猪白介素22的n还包括信号前导序列；进一步优选地，所述信号前导序列包括如seq id no.5所示的核苷酸序列。5.根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于，所述重组腺病毒包括如seq id no.6所示的核苷酸序列。6.权利要求1-5任一项所述重组腺病毒的制备方法，其特征在于，包括：构建含有猪干扰素λ3和猪白介素22的基因序列的重组腺病毒质粒；使用所述重组腺病毒质粒转染hek293细胞，培养后获得重组腺病毒。7.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5任一项所述重组腺病毒。8.权利要求1-5任一项所述重组腺病毒在抑制猪肠道冠状病毒中的应用。9.权利要求1-5任一项所述重组腺病毒在制备抑制猪流行性腹泻病毒的药物中的应用。10.权利要求1-5任一项所述重组腺病毒在制备猪急性腹泻的药物中的应用。
技术总结
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种重组腺病毒及其应用。本发明将猪干扰素λ3和猪白介素重组至腺病毒的基因序列中并进行分泌表达，得到一种能够在猪体内和肠道组织中高效短暂表达IF-λ3和IL-22的重组腺病毒。本发明提供的重组腺病毒具有良好的安全性以及体内和体外抗猪流行性腹泻病毒的效果，对感染PED仔猪的治愈率达到89％以上，在抗猪肠道冠状病毒感染的领域有重要意义。状病毒感染的领域有重要意义。状病毒感染的领域有重要意义。
