乳腺癌相关的LncRA组合标志物、试剂盒及其应用
乳腺癌相关的lncrna组合标志物、试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于疾病诊断用生物标志物技术领域，具体涉及乳腺癌相关的lncrna组合标志物、试剂盒及其应用。
背景技术：
2.乳腺癌(brca)是世界上女性中最常见的癌症之一，是女性死亡的主要原因，其发病率每年都在增加。尽管先进诊疗水平已大大降低了brca的死亡率，但由于brca的异质性高，手术和化疗仍是其主要的手段。最近，有研究报道brca患者的预后与免疫力有关。因此，有必要寻新颖的免疫预测因子来改善brca的诊断和。肿瘤微环境 (tme)，由免疫细胞，间质细胞，细胞因子和其他分子组成，brca患者的预后可以改变tme中参与肿瘤的发生、发育和预后各种关键遗传标记，同时tme的肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)也是肿瘤免疫的关键。最近的研究表明，til可以作为brca患者的临床病理学预测模型，而提高tils浓度可以预测brca所有分子亚型中新辅助化疗的反应。
3.brca是一种高度异质的恶性肿瘤，由于其基因组和遗传多样性。近几十年来，一些以mrna或mirna为重点的分子标记物证明有助于优化brca患者的决策。长非编码 rna(lncrna)是一种主要的非编码rna类型，其转录数超过200nt，在肿瘤的发生、发育和肿瘤免疫反应中表现出各种作用。改变了肿瘤lncrna参与调节多种生物功能，如自噬、代谢、炎症和免疫反应。特别是，异常表达的lncrna可能在细胞增殖、凋亡、侵袭、转移和上皮间质转化的过程中作用，导致预后不佳。例如，lncrna hottip通过增加 bcsc中的mir-148a-3p/wnt1表达量来调节csc样属性。此外，lncrna tcl6影响免疫细胞浸润，表明brca生存率恶化，lncrna snhg1的干扰表达可以通过调节 mir-448/ido来抑制特雷格treg细胞的分化，并影响brca的免疫浸润。
4.研究与乳腺癌相关的lncrna，对于改善传统的癌症评估方法，为乳腺癌的制定个体化方案，评估疗效，预测预后，以及精准医疗具有重要的意义。
技术实现要素：
5.为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供乳腺癌相关的lncrna组合标志物，c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1作为组合标志物，综合评估该五种lncrna的表达量变化，对乳腺癌患者预后进行相对准确的预测和评估。
6.本发明的目的之二在于提供一种试剂盒，用于检测lncrna表达量。
7.本发明的目的之三在于提供本发明试剂盒的应用，应用于乳腺癌预后预测评估、乳腺癌药物筛选等。
8.乳腺癌相关的lncrna组合标志物，所述组合标志物为c6orf99，linc00987， siah2-as1，linc01010和elovl2-as1。
9.本发明基于乳腺癌新的免疫相关数据集以及高通量测序数据，通过cox回归分析和 pearson相关分析确定出与brca免疫相关的lncrna，再通过多因素cox回归分析确认了5
个lncrna，包括c6orf99、linc00987、siah2-as1、linc01010和elovl2-as1，作为乳腺癌的预后组合标志物，形成乳腺癌预后模型。
10.本发明组合标志物形成的乳腺癌预后模型，计算风险评分＝exp1
×
lncrna1+ exp2
×
lncrna2+
…
+expi
×
lncrnai，依据计算的风险评分，将brca患者分为高、低风险组，高危组的风险分值更高，生存率也更低(p《0.001)，死亡率随着风险评分的提高而继续上升。此外，随着风险评分的上升，c6orf99的表达水平上升，而linc00987、siah2-as1、 linc01010和elovl2-as1的表达水平下降；
11.免疫细胞的类型和数量在不同的brca类型之间差别很大，本发明五个lncrna组合标志物的风险分数用于预测它们与浸润性免疫细胞的关系，五个与免疫相关的lncrna与浸润性免疫细胞(cd4+t细胞、cd8+t细胞、b细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞)呈负相关，表明五种与免疫相关的lncrna在brca的免疫浸润中起着关键作用；
12.同时，本发明验证筛选的五个免疫相关的lncrnas组合标志物的预后模型的auc值 (》0.73)，表明本发明组合标志物在评估预后上具有较高的可靠性。同时，将本发明五个 lncrna组合标志物的表达量与不同样本的临床特征和乳腺癌细胞的关联性进行验证。基底类亚型，与luminalabrca型相反，linc01010和c6orf99在基底状细胞亚型中表现出有意义的特性，其高表达更好地预测了乳腺癌的更具攻击性的形式，c6orf99在luminala和基底状细胞(mcf-7a和mda-mb-231)中表现出显著性，而siah1-as1和 elovl1-as1在所有细胞子类型中的表达比普通细胞低；根据tcga数据库中1039位乳腺癌患者的分期、t分期、n分期、m分期和年龄等临床特征，检测该模型在临床中的可行性，验证了模型中5个免疫相关lncrna与临床特征具有相关性。
13.总之，本发明筛选的五个免疫相关lncrna的组合标志物形成的预后模型有助于监测 brca的恶性发展，是可靠、可参考的风险评估预后模型，为免疫有关的研究和策略提供新的见解。
14.一种试剂盒，包括检测c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1 表达量的试剂。
15.进一步的，上述试剂盒中检测c6orf99表达量的试剂包括正向引物：5'-gatgttctttggtc-3'；反向引物：5'-acctctcctctcttc-3'。
16.更进一步的，上述试剂盒中检测linc00987表达量的试剂包括正向引物
17.5'-ccgcctcacacctcttctctctctc-3'；反向引物：5'-cagagtctgtctctcc-3'。
18.更进一步的，上述试剂盒中检测siah2-as1表达量的试剂包括正向引物
19.5'-gactcatctccaaccaaccacc-3'；反向引物5'-ctagagccttccc-3'。
20.更进一步的，上述试剂盒中检测linc01010表达量的试剂包括正向引物
21.5'-gcccagagtccagcag-3'；反向引物5'-agcacctcttcc-3'。
22.更进一步的，上述试剂盒中检测elovl2-as1表达量的试剂包括正向引物
23.5'-agagagctgccttgcccttcc-3'；反向引物 5'-agagtgggtgtctggtggtaagc-3'。
24.作为优选的，上述试剂盒中还包括内参试剂。所述内参试剂可为检测gapdh表达量的试剂，包括正向引物5'-gcatcctacactg-3'；反向引物5'-tggttgggaat-3'。
25.需要说明的是，上述试剂盒中提供的试剂可以实现通过qrt-pcr的方法实现对 c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1表达量的检测，具体的可以包括
rna提取试剂、rna反转录试剂、qrt-pcr试剂。
26.由于上述试剂盒能够检测本发明组合标志物c6orf99，linc00987，siah2-as1， linc01010和elovl2-as1的表达量，因此该试剂盒可应用于乳腺癌预后预测，也可应用于筛选乳腺癌的候选药物。
具体实施方式
27.下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。
28.实施例1组合标志物的筛选
29.1.材料和方法
30.1.1数据下载
31.从癌症基因组图谱(tcga)数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)获得了brca的转录组rna测序数据，包含113个非肿瘤组织和1039个brca组织。收集并提取了患者的临床数据(不包括总生存期≤30天的患者)。数据更新于2020年7月11日。
32.1.2鉴定免疫相关的lncrna
33.应用cox回归分析和pearson相关分析来鉴定免疫相关的lncrna。所有统计分析都是在r统计环境下使用不同的软件包进行的(r版本3.5.，奥地利)。p《0.05认为是有统计学意义。
34.从tcga收集1039例brca患者的rna-seq和113份正常样品。分离lncrna和 mrna的rna-seq数据，并通过edger将基因标准化。获得了1505个差异表达的lncrna。通过与immlnc数据库中brca的lncrnas基因集进行匹配，选出了316个免疫相关的 lncrna。
35.1.3五个lncrnas组合标志物的筛选确定
36.结合immlnc数据库(http://bio-bigdata.hrbmu.edu.cn/immlnc)，单变量cox回归分析获得了12个与免疫相关的lncrna的预后，例如c6orf99，mir4435-2hg，linc00536， ap001412.1，cbr3-as1，spaca6p-as，linc00987，siah2-as1，stk4-as1，linc01010， linc01235和elovl2-as1。
37.表1
38.lncrna风险比95％cipc6orf991.2571.088～1.4530.002mir4435-2hg1.3591.090～1.6950.006linc005361.121.033～1.2140.006ap001412.11.2671.077～1.4900.004cbr3-as11.2851.091～1.5140.003spaca6p-as1.2521.099～1.4270.001linc009870.8060.696～0.9340.004siah2-as10.8390.754～0.9330.001stk4-as11.3721.143～1.6460.001linc010100.8590.769～0.9600.007linc012351.1671.070～1.273《0.001
elovl2-as10.9160.859～0.9750.006
39.多因素cox回归筛选出5个与免疫相关的lncrna(c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1)，如表述表2所示，作为组合标志物，形成预后的免疫相关的lncrnas模型。
40.表2
[0041][0042][0043]
1.4五个lncrnas组合标志物作为乳腺癌预后预测模型的性能评价
[0044]
1.4.1计算每个患者的风险评分，公式如下：风险评分＝exp1
×
lncrna1+ exp2
×
lncrna2+
…
+expi
×
lncrnai，其中expi是样本中每种免疫相关lncrna的表达值， lncrnai是多元分析模型的回归系数。
[0045]
其中lncrna表达量的检测方法为：定量实时聚合酶链反应(qrt-pcr)
[0046]
trizol试剂(invitrogen,carlsbad,ca,usa)用于从培养细胞中提取总rna，以确定 rna的浓度和纯度，这些rna被反向转录成互补的脱氧核酸(cdnas；primescript rtreagent；takara,中国大连)。使用预混前taq
tm
套件(takara，中国大连)和sstepone plus实时pcr系统运行qrt-pcr(应用生物系统，福斯特市，加利福尼亚州，美国)。
[0047]
其中扩增各目标lncrna采用的引物均由生工合成，具体序列结构分别为：c6orf99： 5'-gatgttctttggtc-3'(正向引物)和5'-acctctcctctcttc-3'(反向引物)；linc00987： 5'-ccgcctcacacctcttctctctctc-3'(正向引物)和5'-cagagtctgtctctcc-3' (反向引物)；siah2-as1：5'-gactcatctccaaccaaccacc-3'(正向引物)和 5'-ctagagccttccc-3'(反反向引物)；linc01010：5'-gcccagagtccagcag-3'(正向引物)和5'-agcacctcttcc-3'(反向引物)；elovl2-as1： 5'-agagagctgccttgcccttcc-3'(正向引物)和5'
‑ꢀ
agagtgggtgtctggtggtaagc-3'(反应引物)；gapdh：5'-gcatcctacactg-3' (正向引物)和5'-tggttgggaat-3'(反向引物)。以gapdh mrna为内参，计算 c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1的表达量。
[0048]
1.4.2评价五个lncrna作为组合标志物形成乳腺癌预后预测模型的可行性
[0049]
根据计算的风险评分将brca样本分为高风险组和低风险组；死亡率随着风险评分的提高而继续上升。随着风险评分的上升，c6orf99的表达水平上升，而linc00987、 siah2-as1、linc01010和elovl2-as1的表达水平下降。kaplan-meier生存曲线表明高风险组的生存时间明显短于低风险组的生存时间(p《0.001)。低风险和高风险组的5年生存率分别为91.0％(95％ci：87.3％～95.0％)和73.1％(95％ci：67.5％～79.2％)。免疫相关风险评分的auc值为0.733，roc曲线表示筛选的五个lncrna作为组合标志物对乳腺癌预后预测的准确性。
[0050]
brca细胞系hbl-100、htb-20、mcf-7、mda-mb-231和mda-mb-468是从中国科学院细
胞库购买的。细胞在rpmi-1640培养基(hyclone)中培养，并在37℃和5％co2 下辅以10％的胎儿牛血清(bi)。检测五个lncrna在不同样本细胞中表达量，高危人的生存时间明显短于低危人。c6orf99在luminal a和基底状细胞子类型(mcf-7a和 mda-mb-231)中表现出显著性，而siah1-as1和elovl1-as1在所有细胞子类型中的表达比普通细胞低。更值得注意的是，linc01010在luminala细胞中具有有意义的较低表达，但在基底状细胞子类型(mda-mb-231和m da-mb-468)中表达过度。
[0051]
分析五个lncrna与brca临床病理特征的相关性，如年龄和不同阶段。c6orf99的表达被观察到增强，而linc01010和siah2-as1在更高级阶段是相反的。elovl2-as1 的表达在更高级的m级和n级中下降，而linc00987的表达在年龄超过50岁时显著减少。在独立风险分析中，年龄、阶段、t级、n级、m级和免疫相关风险评分在单变量分析中与操作系统显著相关(p《0.05)；在多变量分析中，只有年龄和免疫相关风险评分与操作系统显著相关，如下述表3所示。roc曲线显示了模型的准确性。同时，免疫相关风险评分、年龄、阶段、t级、n级和m级auc值分别是0.733、0.775、0.719、0.709、0.591 和0.641。
[0052]
表3
[0053][0054]
为了验证brca进展中筛选出的五个免疫相关lncrna的潜在分子机制，在高风险和低风险体之间进行gsea。结果表明，高危组五个与免疫相关的lncrna激活了糖酵解、氧化磷酸化和myc靶点。此外，五个免疫相关的lncrna还调节免疫特征，如cd4 t细胞，刺激cd4 th1细胞，向下调节的cd8 t细胞和向上调节的treg细胞。。因此，五个与免疫相关的lncrna可能参与免疫调节。
[0055]
分析5个lncrna风险评分与免疫细胞浸润的相关性，cd4+t细胞的关联值， cd8+t细胞、b细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞分别与-0.181、-0.22、-0.061、
ꢀ‑
0.223、-0.171和-0.220呈明显负相关。综合起来，这些结果表明，五个免疫相关的lncrna 与brca中这些免疫细胞亚型的浸润有关。
[0056]
1.5结果讨论：
[0057]
上述实施例详细阐述了本发明结合tcga的大量临床数据，鉴定了5种新的lncrnas，包括c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1作为乳腺癌的预后风险预测组合标志物。根据模型中位风险值，将brca患者分为高、低风险组，高危组的风险分值更高，生存率也更低(p《0.001)，上述实施例验证本发明筛选确定的五个免疫相关 lncrnas作为组合标志物形成的预后模型的auc值(》0.73)，说明其在评估预后上具有较高的可靠性。根据tcga数据库中1039位乳腺癌患者的分期、t分期、n分期、m分期和年龄等临床特征，验证了本发明筛选的5个免疫相关lncrna与临床特征具有相关性，尤其是c6orf99，它在乳腺癌晚期的表达明显增加，与乳腺癌的恶性发展有关，表明本发明筛选确定的五个免疫相关lncrnas作为组合标志物形成的预后模型在临床中的可行性；同时五个lncrna的表
达也在brca细胞中得到验证，表明五个lncrna作为组合标志物能够对brca亚型具有一定的预测免疫能力。
[0058]
在临床应用过程中，本发明筛选的五个lncrna作为组合标志物，对预后预测的综合判断标准为：c6orf99的表达水平上升，而linc00987、siah2-as1、linc01010和 elovl2-as1的表达水平下降，表明不良预后。
[0059]
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
技术特征：
1.乳腺癌相关的lncrna组合标志物，其特征在于，所述组合标志物为c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1。2.一种试剂盒，其特征在于，包括检测c6orf99，linc00987，siah2-as1，linc01010和elovl2-as1表达量的试剂。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，检测c6orf99表达量的试剂包括正向引物：5'-gatgttctttggtc-3'；反向引物：5'-acctctcctctcttc-3'。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，检测linc00987表达量的试剂包括正向引物5'-ccgcctcacacctcttctctctctc-3'；反向引物：5'-cagagtctgtctctcc-3'。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，检测siah2-as1表达量的试剂包括正向引物5'-gactcatctccaaccaaccacc-3'；反向引物5'-ctagagccttccc-3'。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，检测linc01010表达量的试剂包括正向引物5'-gcccagagtccagcag-3'；反向引物5'-agcacctcttcc-3'。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，检测elovl2-as1表达量的试剂包括正向引物5'-agagagctgccttgcccttcc-3'；反向引物5'-agagtgggtgtctggtggtaagc-3'。8.如权利要求3～7任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括检测gapdh表达量的内参试剂，包括正向引物5'-gcatcctacactg-3'；反向引物5'-tggttgggaat-3'。9.一种如权利要求3～8任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，在制备乳腺癌预后预测产品方面的应用。10.一种如权利要求3～8任一项所述的试剂盒的应用，其特征在于，在制备筛选乳腺癌的候选药物的产品方面的应用。
技术总结
本发明属于疾病诊断用生物标志物技术领域，具体涉及乳腺癌相关的LncRA组合标志物、试剂盒及其应用。本发明筛选出C6orf99、LIC00987、SIAH2-AS1、LIC01010和ELOVL2-AS1作为组合标志物形成的乳腺癌预后模型，根据模型中位风险值，将BRCA患者分为高、低风险组，高危组的风险分值更高，生存率低；5个免疫相关LncRA与临床特征具有相关性，尤其是C6orf99，它在乳腺癌晚期的表达明显增加，LIC00987、SIAH2-AS1、LIC01010和ELOVL2-AS1的表达水平下降，与乳腺癌的恶性发展有关。与乳腺癌的恶性发展有关。
