一种真菌DA模板高效制备方法与流程
一种真菌dna模板高效制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种真菌dna模板高效制备方法。
背景技术：
2.目前dna模板制备方法主要包括试剂盒提取法、经典的酚氯仿抽提法、蛋白酶k消化裂解法等，但这些方法在使用过程中都存在一定的缺点。试剂盒提取法需要购买商品化试剂盒，提取过程需要冰浴、消化、过柱、洗涤、离心等，操作要求高，程序复杂，耗时长，成本高，且不同试剂盒提取的模板质量不同，不适用于大量样本的提取；蛋白酶k消化裂解法属于酶解法的一种，适用于所有样本的消化处理，但所需的各类溶液配制相当繁琐，消化处理后杂质较多，需要配合有机试剂抽提或离心去除杂质提高纯度，同时蛋白酶k本身就是一种蛋白杂质，经过消化处理的样品还需高温灭活蛋白酶k，操作步骤多，耗时长，技术要求较高，有机试剂的使用对操作者危害较大。
3.cn109811034a公开了一种高纯度dna模板的制备方法，其技术方案是：将培养的菌株置于加入无菌去离子水的pcr管中形成混合菌液，将混合菌液置于pcr仪中高温裂解，后降温冷却；然后在离心机上经12000-15000rpm离心，吸取上清液，弃除沉淀物，即获得高纯度dna模板；依据需求将获得的高纯度dna模板直接或经稀释后加入pcr体系进行pcr扩增。该方法对于真菌dna模板的制备所得浓度较低，需要进一步纯化提高pcr产物的浓度。
4.cn111304289a公开了一种dna模板制备液，包括以下成分：单价阳离子盐、乙醇，溶剂为水；其中所述单价阳离子的终浓度为0.1-0.8m，所述乙醇的终浓度为0.5-30％；还公开了一种dna模板的制备方法，包括以下步骤：(1)将抗凝血液和dna模板制备液以体积比1:1-200混合；(2)将步骤(1)得到的混合液直接离心或静置5min后离心，上清液即为dna模板。该方法主要适用于血细胞dna的提取。
5.由以上论述可知，目前dna模板的制备方法仍需要进一步改进。
技术实现要素：
6.本发明主要目的在于提供一种真菌dna模板高效制备方法，本发明所述方法可以使菌体dna充分释放，无需dna的提取，采用所得上清液即可进行pcr；并且本发明所述方法操作简单，用时较短，适用于大批量操作。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明提供一种真菌dna模板高效制备方法，所述方法包括以下步骤：将样品进行平板培养、液体培养基富集；离心，弃上清液后加入te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸、冷冻；融化、震荡摇匀，进行超声处理，离心取上清即得。
9.进一步地，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入0.1-2ml液体培养基进行富集培养5-48h。
10.进一步地，弃上清液后加入50-500μl1 x te缓冲液。
11.进一步地，冷冻后取出在50-100℃条件下进行融化、震荡摇匀。
12.进一步地，在20-50hz频率条件下超声1-10min。
13.与现有技术相比，本发明具有以下优势：
14.本发明所述方法可以使菌体dna充分释放，制备全程无需进行对ep管进行开盖操作，避免了其它dna的污染。本发明方法操作简单，用时较短，适用于大批量操作。
15.本发明方法可高效、稳定地应用于真菌dna模板的制备。
附图说明
16.图1为本发明实施例1所述方法制备得到的基因组dna模板pcr结果图：m，dna分子量标准marker(100-2000)；n，阴性对照；1-2，5-8光滑念珠菌；3-4白念珠菌；
17.图2为本发明对比例1-5所述方法制备得到的基因组dna模板pcr结果图：m，dna分子量标准marker(100-2000)；n，阴性对照；1-3，对比例1制备得到的模板；4-6：对比例2制备得到的模板；7-9：对比例3制备得到的模板；10-13，对比例4制备得到的模板；14-15：对比例5制备得到的模板。
具体实施方式
18.应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
19.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”、“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作以及它们的组合。
20.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
21.本发明所述te缓冲液可采用市售产品，也可采用以下所述方法制备：
22.mtris-hcl(ph8.0)50ml的配制：称取tris碱606g，加超纯水40ml溶解，滴加浓hci约21ml调ph至8.0，定容至50ml。
23.0.5medta(ph8.0)50ml的配制：称取edta-na2·
2h2o 9306g，加超纯水35ml，剧烈搅拌，用约1qnaoh颗粒调ph至8.0定容至50ml。(edta二钠盐需加入naoh将ph调至接近8.0时，才会溶解。)
24.1.3、1xte(10mmtris-hcl，ph8.0；1mmedta ph8.0)的配制:
25.1mtris-hci(ph8.0)1ml
26.0.5medta(ph8.0)0.2ml
27.超纯水至100ml。
28.实施例1
29.一种真菌dna模板高效制备方法，所述方法包括以下步骤：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml液体培养基进行富集培养24h；12000r/min离心1min，弃上清液后加入300μl 1 x te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃条件下冷冻8min；在65℃条件下进行融化并震荡摇匀。40hz频率条件
下超声5min，12000r/min离心2min，取上清液作为dna模板。
30.实施例2
31.一种真菌dna模板高效制备方法，所述方法包括以下步骤：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入0.1ml液体培养基进行富集培养5h；15000r/min离心1min，弃上清液后加入50μl 1 x te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸，煮沸5min，立即于-20℃条件下冷冻10min；在50℃条件下进行融化并震荡摇匀。20hz频率条件下超声10min，15000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
32.实施例3
33.一种真菌dna模板高效制备方法，所述方法包括以下步骤：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入2ml液体培养基进行富集培养48h；12000r/min离心5min，弃上清液后加入500μl 1 x te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸，煮沸5min，立即于-80℃条件下冷冻7min；在100℃条件下进行融化并震荡摇匀。50hz频率条件下超声1min，12000r/min离心1min，取上清液作为dna模板。
34.对比例1
35.一种dna模板制备方法：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml液体培养基进行富集培养24h；12000r/min离心1min，弃上清后加入20μl 1 x te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃条件下冷冻8min；12000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
36.对比例2
37.一种dna模板制备方法：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml液体培养基进行富集培养24h；12000r/min离心1min，弃上清后加入20μl 1 x te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸，煮沸3min，立即于-20℃条件下冷冻8min；再重复一次以上煮沸、冷冻步骤；12000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
38.对比例3
39.一种dna模板制备方法：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml液体培养基进行富集培养24h；12000r/min离心1min，弃上清后加20μl 1 x te缓冲液，加入高压灭菌的石英砂，煮沸5min，然后立即于-20℃条件下冷冻8min；再重复一次以上煮沸、冷冻步骤；涡旋5min，12000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
40.对比例4
41.一种dna模板制备方法：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml对应的液体培养基，富集培养24h后，加入适量ripe裂解液，12000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
42.对比例5
43.一种dna模板制备方法：将样品进行平板培养，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入1ml液体培养基进行富集培养24h；12000r/min离心1min，弃上清液后用500ul裂解液重悬，超声处理30s；12000r/min离心5min后弃上清，用500ul裂解液重悬，超声处理30s；12000r/min离心5min，取上清液作为dna模板。
44.所用裂解液为：0.5mol/ledta，1mol/l tris-hcl，0.3％sds；ph8.0。
45.以光滑念珠菌、白念珠菌为例，采用实施例1、对比例1-5所述方法进行基因组dna模板制备。
46.采用its的通用引物(its1/its4：5
’‑
tccgtaggtgaacctgcgg-3
’5’‑
tcctccgcttattgatatgc-3’)，根据不同菌种目的片段大小在500-750bp之间，部分真菌在1000bp左右。
47.各组取3μldna至20μl体系进行pcr扩增，扩增程序：
48.①
98℃预变性2min；
49.②
94℃变性10sec；
50.③
55℃退火15sec；
51.④
72℃延伸45sec；
52.⑤
重复步骤
②‑④
30次；
⑥
72℃延伸1min。
53.所得结果如图1、图2所示。
54.由图1、图2可知：与图2相比，图1中条带更为明亮，无杂带和引物二聚体，表明本发明实施例1所述方法针对真菌dna模板制备效果更好，能够使真菌dna充分释放。对光滑念珠菌、白念珠菌两株真菌进行dna模板的制备，图1中所有模板均有条带，而图2中有的相应孔道几乎为空白，由此可见本发明方法效果稳定，重复度高。
55.由以上可知，本发明方法效果稳定可靠、简单方便、大大简化了dna模板制备过程，可应用于人体常见真菌。不借助于其他试剂以及复杂仪器，无需进行开盖加试剂操作，可确保生物安全。
56.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
技术特征：
1.一种真菌dna模板高效制备方法，其特征在于，将样品进行平板培养、液体培养基富集；离心，弃上清液后加入te缓冲液，震荡均匀后进行煮沸、冷冻；融化、震荡摇匀，进行超声处理，离心取上清即得。2.根据权利要求1所述真菌dna模板高效制备方法，其特征在于，平板培养至长出肉眼可见菌落时，挑取菌落至ep管内，加入0.1-2ml液体培养基进行富集培养5-48h。3.根据权利要求1所述真菌dna模板高效制备方法，其特征在于，加入50-500μl 1xte缓冲液。4.根据权利要求1所述真菌dna模板高效制备方法，其特征在于，冷冻后取出在50-100℃条件下进行融化、震荡摇匀。5.根据权利要求1所述真菌dna模板高效制备方法，其特征在于，在20-50hz频率条件下超声1-10min。
技术总结
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种真菌DA模板高效制备方法。所述方法包括以下步骤：将样品进行平板培养、液体培养基富集；离心，弃上清液后加入TE缓冲液，震荡均匀后进行煮沸、冷冻；融化、震荡摇匀，进行超声处理，离心取上清即得。本发明所述方法可以使菌体DA充分释放，无需DA的提取，采用所得上清液即可进行PCR；并且本发明所述方法操作简单，用时较短，适用于大批量操作。适用于大批量操作。适用于大批量操作。
