一种温敏杂化水凝胶的制备方法及其应用
1.本发明涉及一种温敏杂化水凝胶的制备方法及其应用，属于生物医用材料技术领域。
背景技术：
2.由创伤、肿瘤、先天缺陷等相关疾病引起的组织缺损，对患者的生活质量造成了严重影响。近年来，组织工程支架在缺损组织的修复和再生中起到了关键作用。支架材料可以提供三维空间结构，供细胞附着生长，同时还可负载多种生物活性因子，促进组织的修复。在众多的工程支架中，可注射性的温敏水凝胶支架受到学者们更多的关注。在临床的实际应用中，组织缺损的形状个体差异性较大，成品的水凝胶多需要额外修剪才能符合缺损区的形状要求。而具有温敏性的可注射性水凝胶能够在植入体内后原位成胶，无需额外操作即能修复各种形状的缺损，扩大了水凝胶在临床的应用范围。
3.壳聚糖(chitosan，cs)是一种氨基多糖，具有良好的生物相容性和生物降解性。在生理ph值和温度下，通过添加β-甘油磷酸酯(β-glycerophosphate，β-gp)即可诱导壳聚糖溶液的溶胶-凝胶转变。此外，壳聚糖高分子链上存在丰富的氨基基团，氨基中氮原子表面的双自由电子，能够通过形成配位键螯合具有生物活性的金属阳离子。铜离子、锌离子等因其简单的加工过程、广泛的抗菌光谱和良好的血管形成能力常被用做壳聚糖的螯合金属配位体。因此，利用壳聚糖螯合金属离子有望制备出一种具有高生物活性的温敏水凝胶，用于组织缺损的修复。
4.但是，单纯的温敏水凝胶的机械性能较差，其强度往往难以支撑硬组织缺损的修复。为增强其机械强度，水凝胶中常需添加无机填料形成复合水凝胶。但由于凝胶基质和无机填料化学性质的不同，有机相基质和无机相填料之间的界面相容性不佳，导致复合水凝胶材料结构均一性较差，影响其性能和使用。
技术实现要素：
5.本发明的目的是：针对现有技术的缺陷，提出一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法首先利用壳聚糖的螯合作用，合成具有多种生物活性的壳聚糖/金属离子颗粒，之后通过掺入β-gp、gptms及teos等成分，提高材料机械性能的同时保证其结构均一性，合成具有促进组织修复能力的温敏杂化水凝胶。利用同一温敏杂化水凝胶体系，实现负载多种生物活性离子以促进组织再生的目的。
6.为了实现上述目的，本发明提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
7.步骤1：将壳聚糖粉末溶于稀酸中，加入水溶性金属盐粉末，搅拌反应，之后加入碱溶液，搅拌反应得到水凝胶微球，过滤收集水凝胶微球进行洗涤和干燥，得到壳聚糖/金属盐颗粒；
8.步骤2：取步骤1制备得到的壳聚糖/金属盐颗粒溶解于乙酸水溶液中，室温下搅拌
得到壳聚糖/金属盐溶液，之后滴加3-缩水甘油氧丙基三甲氧基搅拌混合，得到混合溶液；
9.步骤3：将硅源在酸性条件下水解后加入步骤2所得的混合溶液中，继续搅拌，得到壳聚糖/金属盐/gptms/硅溶液，然后加入β-甘油磷酸酯溶液，搅拌并加热成胶，即得温敏杂化水凝胶。
10.优选地，所述步骤1中的金属盐粉末为氯化铜、氯化锌、硝酸银、氯化铈和氯化钙中至少一种，所述金属盐粉末与壳聚糖粉末中单体的摩尔比为0.005-0.04∶1。
11.优选地，所述步骤2中壳聚糖/金属盐颗粒与乙酸水溶液的加料比例为1～3g：100ml；所述乙酸水溶液的体积浓度为0.5～2％。
12.优选地，所述步骤2中壳聚糖/金属盐溶液与3-缩水甘油氧丙基三甲氧基的体积比为125～300：1，所述搅拌的温度为35～45℃，时间为2～4天。
13.优选地，所述步骤3中的硅源的加料量按照硅源与步骤2中的壳聚糖/金属盐颗粒的质量比为0.3～3:1的比例计算，所述硅源为硅酸四乙酯和/或硅酸四丁酯；所述加热的温度为37℃。
14.优选地，所述步骤3中壳聚糖/金属盐/gptms/硅溶液与β-甘油磷酸酯溶液的体积比为2～8:1，所述β-甘油磷酸酯溶液的浓度为10～20wt％。
15.本发明还提供了上述的温敏杂化水凝胶的制备方法制备所得的温敏杂化水凝胶在制备抗菌或修复组织缺损的产品中的应用。
16.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
17.本发明制备的温敏杂化水凝胶具有分子水平的均一形态，无机填料能够在水凝胶基质中均匀分散，形成一个相互贯穿的聚合物网络支架结构；螯合有多种生物活性离子的壳聚糖成分具有抗菌抗炎、促血管生成等生物活性，有利于促进软硬组织修复，实现利用同一温敏杂化水凝胶体系发挥不同生物活性作用的目的。
附图说明
18.图1为实施例1中温敏杂化水凝胶前驱溶液的照片；
19.图2为实施例1制备的温敏杂化水凝胶的照片。
20.图3为实施例1制备的温敏杂化水凝胶的傅里叶红外光谱结果；
21.图4为实施例2制备的温敏杂化水凝胶在100倍放大倍数下的扫描电镜结果；
22.图5为实施例2制备的温敏杂化水凝胶在500倍放大倍数下的扫描电镜结果；
23.图6为实施例2制备的温敏杂化水凝胶在1000倍放大倍数下的扫描电镜结果。
具体实施方式
24.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
25.以下实施例使用的壳聚糖粉末购于sigma-aldrich，货号为448877；氯化铜粉末、氯化锌粉末、硝酸银粉末、氯化铈粉末、氯化钙粉末均购于sigma-aldrich。
26.实施例1
27.本实施例提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法的制备步骤如下：
28.1)cs/cu颗粒的制备：将0.6g壳聚糖粉末溶解在30ml的0.1m盐酸水溶液中，加入0.013g氯化铜粉末，继续搅拌1h，将溶解后的液体逐滴加入到2倍体积的0.1m氢氧化钠水溶
液中，得到蓝的水凝胶微球，将微球继续在氢氧化钠水溶液中搅拌2h，微球结构稳定后，用漏斗过滤微球并用去离子水清洗，最后将微球在60℃的烘箱中干燥12h，即得cs/cu颗粒；
29.2)温敏杂化水凝胶的制备：
30.a.将3g cs/cu颗粒加到150ml的1％v/v的乙酸水溶液中搅拌，室温搅拌2-3h，得到cs/cu溶液；
31.b.向上述cs/cu溶液中逐滴滴加0.59ml gptms溶液，在40℃下搅拌3天，得到cs/cu/gptms溶液；
32.c.向4.1ml teos(正硅酸乙酯)中加入1.37ml水和0.46ml 2m盐酸溶液，在室温下搅拌1h，水解teos，得到teos水解溶液；
33.d.向cs/cu/gptms溶液中加入teos水解溶液，继续搅拌0.5h，得到cs/cu/gptms/teos溶液；
34.e.将6.71gβ-gp粉末(β-gp，β-甘油磷酸酯)溶于33.55ml去离子水中，得到β-gp溶液；
35.f.向cs/cu/gptms/teos溶液中加入β-gp溶液，得到温敏杂化水凝胶前驱溶液，该前驱溶液为澄清透明的均一溶液，如图1所示，接着继续搅拌15min，将溶液加热到37℃成胶，即得190ml温敏杂化水凝胶，如图2所示，该温敏杂化水凝胶均一透明。傅里叶红外光谱表征结果(图3)显示，该水凝胶内部存在壳聚糖中的c＝o、teos中的si-o-si以及si-o-c键，说明壳聚糖成功与gptms及teos发生反应，形成杂化水凝胶。
36.实施例2
37.本实施例提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法的制备步骤如下：
38.1)cs/zn颗粒的制备：将0.6g壳聚糖粉末溶解在30ml的0.1m盐酸水溶液中，加入0.013g氯化锌粉末，继续搅拌1h，将溶解后的液体逐滴加入到2倍体积的0.1m氢氧化钠水溶液中，得到水凝胶微球，将微球继续在氢氧化钠水溶液中搅拌2h，微球结构稳定后，用漏斗过滤微球并用去离子水清洗，最后将微球在60℃的烘箱中干燥12h，即得cs/zn颗粒；
39.2)温敏杂化水凝胶的制备：
40.a.将3g cs/zn颗粒加到150ml的1％v/v的乙酸水溶液中搅拌，室温搅拌2-3h，得到cs/zn溶液；
41.b.向上述cs/zn溶液中逐滴滴加0.59ml gptms溶液，在40℃下搅拌3天，得到cs/zn/gptms溶液；
42.c.向4.1ml teos中加入1.37ml水和0.46ml 2m盐酸溶液，在室温下搅拌1h，水解teos，得到teos水解溶液；
43.d.向cs/zn/gptms溶液中加入teos水解溶液，继续搅拌0.5h，得到cs/zn/gptms/teos溶液；
44.e.将6.71gβ-gp粉末溶于33.55ml去离子水中，得到β-gp溶液；
45.f.向cs/zn/gptms/teos溶液中加入β-gp溶液，得到澄清透明的温敏杂化水凝胶前驱溶液，接着继续搅拌15min，将溶液加热到37℃成胶，即得189ml温敏杂化水凝胶，所得水凝胶均一透明。图4，5，6为该水凝胶的扫描电镜结果，由图可知，水凝胶呈现三维多孔形状，孔壁光滑，孔径较为均一。该水凝胶1h、2h、3h、12h的溶胀率分别为651％、706％、780％、889％。
46.实施例3
47.本实施例提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法的制备步骤如下：
48.1)cs/ag颗粒的制备：将0.6g壳聚糖粉末溶解在30ml的0.1m盐酸水溶液中，加入0.016g硝酸银粉末，继续搅拌1h，将溶解后的液体逐滴加入到2倍体积的0.1m氢氧化钠水溶液中，得到水凝胶微球，将微球继续在氢氧化钠水溶液中搅拌2h，微球结构稳定后，用漏斗过滤微球并用去离子水清洗，最后将微球在60℃的烘箱中干燥12h，即得cs/ag颗粒；
49.2)温敏杂化水凝胶的制备：
50.a.将3g cs/ag颗粒加到150ml的1％v/v的乙酸水溶液中搅拌，室温搅拌2-3h，得到cs/ag溶液；
51.b.向上述cs/ag溶液中逐滴滴加0.59ml gptms溶液，在40℃下搅拌3天，得到cs/ag/gptms溶液；
52.c.向4.1ml teos中加入1.37ml水和0.46ml 2m盐酸溶液，在室温下搅拌1h，水解teos，得到teos水解溶液；
53.d.向cs/ag/gptms溶液中加入teos水解溶液，继续搅拌0.5h，得到cs/ag/gptms/teos溶液；
54.e.将6.71gβ-gp粉末溶于33.55ml去离子水中，得到β-gp溶液；
55.f.向cs/ag/gptms/teos溶液中加入β-gp溶液，得到澄清透明的温敏杂化水凝胶前驱溶液，接着继续搅拌15min，将溶液加热到37℃成胶，即得188ml温敏杂化水凝胶，所得水凝胶均一透明。
56.实施例4
57.本实施例提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法的制备步骤如下：
58.1)cs/ce颗粒的制备：将0.6g壳聚糖粉末溶解在30ml的0.1m盐酸水溶液中，加入0.024g氯化铈粉末，继续搅拌1h，将溶解后的液体逐滴加入到2倍体积的0.1m氢氧化钠水溶液中，得到水凝胶微球，将微球继续在氢氧化钠水溶液中搅拌2h，微球结构稳定后，用漏斗过滤微球并用去离子水清洗，最后将微球在60℃的烘箱中干燥12h，即得cs/ce颗粒；
59.2)温敏杂化水凝胶的制备：
60.a.将3g cs/ce颗粒加到150ml的1％v/v的乙酸水溶液中搅拌，室温搅拌2-3h，得到cs/ce溶液；
61.b.向上述cs/ce溶液中逐滴滴加0.59ml gptms溶液，在40℃下搅拌3天，得到cs/ce/gptms溶液；
62.c.向4.1ml teos中加入1.37ml水和0.46ml 2m盐酸溶液，在室温下搅拌1h，水解teos，得到teos水解溶液；
63.d.向cs/ce/gptms溶液中加入teos水解溶液，继续搅拌0.5h，得到cs/ce/gptms/teos溶液；
64.e.将6.71gβ-gp粉末溶于33.55ml去离子水中，得到β-gp溶液；
65.f.向cs/ce/gptms/teos溶液中加入β-gp溶液，得到澄清透明的温敏杂化水凝胶前驱溶液，接着继续搅拌15min，将溶液加热到37℃成胶，即得188ml温敏杂化水凝胶，所得水凝胶均一透明。
66.实施例5
67.本实施例提供了一种温敏杂化水凝胶的制备方法，该方法的制备步骤如下：
68.1)cs/ca颗粒的制备：将0.6g壳聚糖粉末溶解在30ml的0.1m盐酸水溶液中，加入0.013g氯化钙粉末，继续搅拌1h，将溶解后的液体逐滴加入到2倍体积的0.1m氢氧化钠水溶液中，得到水凝胶微球，将微球继续在氢氧化钠水溶液中搅拌2h，微球结构稳定后，用漏斗过滤微球并用去离子水清洗，最后将微球在60℃的烘箱中干燥12h，即得cs/ca颗粒；
69.2)温敏杂化水凝胶的制备：
70.a.将3g cs/ca颗粒加到150ml的1％v/v的乙酸水溶液中搅拌，室温搅拌2-3h，得到cs/ca溶液；
71.b.向上述cs/ca溶液中逐滴滴加0.59ml gptms溶液，在40℃下搅拌3天，得到cs/ca/gptms溶液；
72.c.向4.1ml teos中加入1.37ml水和0.46ml 2m盐酸溶液，在室温下搅拌1h，水解teos，得到teos水解溶液；
73.d.向cs/ca/gptms溶液中加入teos水解溶液，继续搅拌0.5h，得到cs/ca/gptms/teos溶液；
74.e.将6.71gβ-gp粉末溶于33.55ml去离子水中，得到β-gp溶液；
75.f.向cs/ca/gptms/teos溶液中加入β-gp溶液，得到澄清透明的温敏杂化水凝胶前驱溶液，接着继续搅拌15min，将溶液加热到37℃成胶，即得187ml温敏杂化水凝胶，所得水凝胶均一透明。
76.上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将壳聚糖粉末溶于稀酸中，加入水溶性金属盐粉末，搅拌反应，之后加入碱溶液，搅拌反应得到水凝胶微球，过滤收集水凝胶微球进行洗涤和干燥，得到壳聚糖/金属盐颗粒；步骤2：取步骤1制备得到的壳聚糖/金属盐颗粒溶解于乙酸水溶液中，室温下搅拌得到壳聚糖/金属盐溶液，之后滴加3-缩水甘油氧丙基三甲氧基搅拌混合，得到混合溶液；步骤3：将硅源在酸性条件下水解后加入步骤2所得的混合溶液中，继续搅拌，得到壳聚糖/金属盐/gptms/硅溶液，然后加入β-甘油磷酸酯溶液，搅拌并加热成胶，即得温敏杂化水凝胶。2.如权利要求1所述的温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤1中的金属盐粉末为氯化铜、氯化锌、硝酸银、氯化铈和氯化钙中至少一种，所述金属盐粉末与壳聚糖粉末中单体的摩尔比为0.005-0.04∶1。3.如权利要求1所述的温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中壳聚糖/金属盐颗粒与乙酸水溶液的加料比例为1～3g：100ml；所述乙酸水溶液的体积浓度为0.5～2％。4.如权利要求1所述的温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤2中壳聚糖/金属盐溶液与3-缩水甘油氧丙基三甲氧基的体积比为125～300：1，所述搅拌的温度为35～45℃，时间为2～4天。5.如权利要求1所述的温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中的硅源的加料量按照硅源与步骤2中的壳聚糖/金属盐颗粒的质量比为0.3～3:1的比例计算，所述硅源为硅酸四乙酯和/或硅酸四丁酯；所述加热的温度为37℃。6.如权利要求1所述的温敏杂化水凝胶的制备方法，其特征在于，所述步骤3中壳聚糖/金属盐/gptms/硅溶液与β-甘油磷酸酯溶液的体积比为2～8:1，所述β-甘油磷酸酯溶液的浓度为10～20wt％。7.权利要求1～6中任意一项所述的温敏杂化水凝胶的制备方法制备所得的温敏杂化水凝胶在制备抗菌或修复组织缺损的产品中的应用。
技术总结
本发明公开了一种温敏杂化水凝胶的制备方法及其应用。本发明的制备方法包括：采用壳聚糖粉末和金属盐粉末制备得到壳聚糖/金属盐颗粒，将壳聚糖/金属盐颗粒加到乙酸水溶液中得到壳聚糖/金属盐溶液，向壳聚糖/金属盐溶液中逐滴滴加GPTMS溶液，得到壳聚糖/金属盐/GPTMS溶液，将硅源水解后加入壳聚糖/金属盐/GPTMS溶液中，得到壳聚糖/金属盐/GPTMS/硅溶液，向壳聚糖/金属盐/GPTMS/硅溶液中加入β-GP溶液，在37℃制备得到温敏杂化水凝胶。该方法实现了水凝胶负载多种生物活性离子以促进组织再生的目的。组织再生的目的。组织再生的目的。
