朱砂根药材的一测多评含量测定方法与流程
1.本发明涉及药材质量检测方法，具体涉及一种朱砂根药材的一测多评含量测定方法及其应用。
背景技术：
2.朱砂根为紫金牛科植物朱砂根ardisia crenata sims的干燥根，具有解毒消肿，活血止痛，祛风除湿的功效，用于咽喉肿痛，风湿痹痛，跌打损伤等，被贵州苗族人民奉为喉科圣药。朱砂根现行质量控制主要遵循《中国药典》(2020版)，以岩白菜素为含量测定指标性成分，其质量控制指标单一，专属性较差。通过文献调研，朱砂根中主要含有三萜皂苷、香豆素类、酚类等多种化合物，其有效成分除能够止咳平喘、抗炎抗菌外，具有抗肿瘤活性，抗生育、抑制血小板凝聚、降低血压、收缩子宫、camp磷酸二酯酶抑制作用等多方面作用。因此为解决朱砂根药材质量控制指标单一等问题，采用高效液相谱法，以岩白菜素为内标物建立朱砂根没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b含量测定方法。在此基础上为弥补朱砂根部分对照品价格昂贵(百两金皂苷a、百两金皂苷b)、部分对照品不稳定(棓儿茶酸)等诸多不足，检测成本较高等问题，研究建立这5个成分的一测多评测定方法。
技术实现要素：
3.为了解决上述技术问题，本发明提供一种朱砂根药材的一测多评含量测定的方法，为朱砂根质量标准提升提供依据。为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的。
4.本发明提供了一种朱砂根药材的一测多评含量测定的方法，包括以下步骤：
5.(1)对照品溶液的配制；
6.(2)供试品溶液的制备；
7.(3)建立同时测定没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b含量的高效液相谱法；
8.(4)以岩白菜素为内参物，确定没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a及百两金皂苷b相对校正因子；
9.(5)对于测得的供试品溶液谱图，计算岩白菜素含量，并根据相对校正因子分别计算没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a及百两金皂苷b含量。
10.根据本发明的方法，其中步骤(1)中，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液。
11.根据本发明的方法，其中步骤(1)中，制备对照品溶液时，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液，其中没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂
苷b五者浓度分别为2～4μg/ml、15～25μg/ml、0.3～0.7mg/ml、0.6～1.0mg/ml、0.5～1.0mg/ml。
12.根据本发明的方法，其中步骤(1)中，制备对照品溶液时，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液，其中没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b五者浓度分别为2.5～3.5μg/ml、18～24μg/ml、0.4～0.6mg/ml、0.8～0.9mg/ml、0.6～0.8mg/ml。
13.根据本发明的方法，其中步骤(2)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取朱砂根样品0.5g，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流40min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
14.根据本发明的方法，其中步骤(3)中，高效液相谱法的谱条件为：c18谱柱(例如谱柱规格为250mm
×
4.6mm，5μm，例如是diamonsil-c18柱)；以乙腈(a)和0.1％磷酸水溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0～22min，8％a；22～30min，8％～30％a；30～40min，30％～30％a；40～60min，30％～40％a；60～65min，40％～100％a)；流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长203nm；进样量10μl；理论塔板数按岩白菜素计不低于5000。
15.根据本发明的方法，其中步骤(4)中，没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b与内参物岩白菜素之间的相对校正因子分别在0.48～0.52范围内、0.42～0.46范围内、83.5～86.5范围内、94.0～104.0范围内；例如，没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b与内参物岩白菜素之间的相对校正因子分别为0.4900、0.4340、84.8548、98.3806。
16.根据本发明的方法，其中还包括对所用高效液相谱法进行方法学考察，例如包括线性关系考察、精密度考察、重复性考察、稳定性考察及加样回收率验证。
17.本发明方法呈现本文上下文所详述的诸多有益效果。
18.本发明有益效果是：
19.(1)本发明建立了一种朱砂根多指标含量测定方法，基于高效液相谱技术，结合一测多评法，该方法准确、可靠，适用于朱砂根药材中多成分的含量测定，有利于朱砂根药材及相关制剂的全面质量控制，且本方法检测灵敏度高，稳定性好，操作简便，易于掌握，便于进一步推广。
20.(2)本发明一种一测多评法评价朱砂根药材的方法，以岩白菜素作为内参物，计算朱砂根中没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b的相对校正因子，并用校正因子计算没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b的含量。方法中百两金皂苷a、百两金皂苷b两个对照品价格昂贵并且稀缺，棓儿茶酸成分稳定性差，需要现用现配，采用一测多评含量测定方法可以针对这些问题大幅度降低检测成本和检测时间，减少工作量，提高效率，对朱砂根的质量控制和临床疗效的保证具有重要意义。
附图说明
21.图1为混合对照品(a)、朱砂根样品(b)的hplc图。其中，1：没食子酸；2：棓儿茶酸；3：岩白菜素；4：百两金皂苷a；5：百两金皂苷b。
具体实施方式
22.为了使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案能予以实施，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
23.实施例1：使用一测多评法对朱砂根药材进行含量测定
24.1、仪器与试药
25.1.1、仪器
26.agilent-1260型高效液相谱仪(美国agilent公司)；xs-205型十万分之一分析天平(瑞士mettler toledo公司)；hh-s6a型水浴锅(北京科伟永兴仪器有限公司)；fw-177型中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。
27.1.2、试药
28.没食子酸(批号：ps000688，纯度≥98％)、棓儿茶酸(批号：ps011955，纯度≥98％)、岩白菜素(批号：ps000991，纯度≥98％)、百两金皂苷a(批号：ps011511，纯度≥98％)、百两金皂苷b(批号：ps011507，纯度≥98％)对照品均购自成都普思生物科技有限公司；乙腈为谱纯；磷酸(gr，天津市科密欧化学试剂有限公司)；屈臣氏饮用水(ar，广州屈臣氏食品饮料有限公司)。
29.收集10批朱砂根药材，经贵州中医药大学魏升华教授鉴定为紫金牛科植物朱砂根ardisia crenata sims的干燥根及根茎。
30.2、方法与结果
31.2.1、对照品溶液的制备
32.分别精密称取没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b对照品适量，加50％甲醇溶解，制成含没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b的质量浓度为1.045mg/ml、2.034mg/ml、2.108mg/ml、2.118mg/ml、2.068mg/ml的对照品溶液。再分别精密量取上述相应对照品溶液适量，置于同一个10ml容量瓶中并用50％甲醇定容，制成浓度依次为3.135μg/ml、19.12μg/ml、0.4848mg/ml、0.8472mg/ml、0.7238mg/ml的混合对照品溶液，备用。
33.2.2、供试品溶液制备
34.称取朱砂根样品约0.5g，精密称定，置平底烧瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流40min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。
35.2.3、谱条件
36.采用diamonsil-c
18
(250mm
×
4.6mm，5μm)谱柱；流动相为乙腈(a)-0.1％磷酸水溶液(b)，梯度洗脱(0～22min，8％a；22～30min，8％～30％a；30～40min，30％～30％a；40～60min，30％～40％a；60～65min，40％～100％a)；流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长203nm；进样量10μl。
37.2.4、方法学考察
38.2.4.1、线性关系考察
39.分别精密吸取“2.1”项下混合对照品溶液适量，分别置于5ml容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，摇匀，制成系列混合对照品溶液，在“2.1”项谱条件下进样测定，以对照品溶液的浓度为横坐标，目标峰峰面积为纵坐标，计算回归方程，结果见表1。
40.表1：朱砂根中5个成分的线性关系考察结果
41.成分回归方程r线性范围(μg/ml)没食子酸y＝44.591x-2.79610.99980.2508～2.088棓儿茶酸y＝30.088x+121.030.99901.530～12.73岩白菜素y＝25.992x-69.8120.999338.79～322.9百两金皂苷ay＝0.2587x-4.10420.999167.78～762.5百两金皂苷by＝0.257x+2.09340.999557.90～482.1
42.2.4.2、精密度试验
43.取混合对照品溶液适量，按“2.3”项下谱条件连续进样测定6次，记录峰面积，计算得到没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a、百两金皂苷b峰面积的rsd分别为0.42％、2.11％、0.53％、2.60％、2.14％，表明仪器精密度良好。
44.2.4.3、稳定性试验
45.取朱砂根供试品溶液，分别于制备后0、2、4、6、8、12、24、36h进样，得到没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a、百两金皂苷b峰面积的rsd分别为2.66％、2.57％、2.50％、2.73％、1.67％，表明供试品溶液在36h内稳定性良好。
46.2.4.4、重复性试验
47.取同一批朱砂根供试品，按“2.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下谱条件进样测定，计算得到没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a、百两金皂苷b平均含量分别为38.94μg/g、249.76μg/g、15.02mg/g、32.25mg/g、24.05mg/g，rsd分别为3.53％、1.65％、1.29％、2.04％、1.34％，表明该方法重复性良好。
48.2.4.5、加样回收率试验
49.精密称取已知成分含量的朱砂根供试品6份，各0.25g，精密称定，分别加入混合对照品适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下谱条件进样测定，计算得到没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a、百两金皂苷b的平均加样回收率分别为100.10％、102.38％、103.42％、97.82％、99.50％，rsd分别为3.84％、1.97％、1.22％、1.29％、1.14％，表明该方法准确度良好。具体结果如下表2。
50.表2：朱砂根中5个成分的加样回收率试验结果
[0051][0052][0053]
2.5、校正因子的确定
[0054]
取混合对照品溶液，按“2.3”项下谱条件分别进样2、4、6、8、10μl，以岩白菜素为内参物(s)，计算没食子酸(a)、棓儿茶酸(b)、百两金皂苷a(c)、百两金皂苷b(d)4个成分的相对校正因子(f
i/s)
，取平均值作为定量用f
i/s
[f
i/s
＝fs/fi＝a
sci
/a
ics
，其中as为岩白菜素对照品的峰面积，cs为岩白菜素对照品的质量浓度，ai为待测成分的峰面积，ci为待测成分的质量浓度]。计算待测组分没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b的f
i/s
，结果见表3。结果显示，没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b与内参物岩白菜素之间的(f
i/s)
分别为0.4900、0.4340、84.8548、98.3806，rsd值分别为2.73％、3.08％、1.14％、3.76％。具体结果见表3。
[0055]
表3：朱砂根中4个成分的相对校正因子
[0056]
进样体积/μlf
a/sfb/sfc/sfd/s
20.48250.428686.4276103.650240.48100.427184.4292100.132860.48390.421883.849594.068980.48930.436584.633096.1188100.51330.456084.934597.9323平均值0.49000.434084.854898.3806rsd/％2.733.081.143.76
[0057]
注：s为岩白菜素，a～d分别为没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b
[0058]
2.6、耐用性和系统适用性研究
[0059]
2.6.1、仪器与谱柱对相对校正因子的影响
[0060]
分别选用agilent 1260和waters e2695高效液相谱系统及diamonsil-c
18
、platisil-c
18
、agilent5tc-c
18
(规格均为250mm
×
4.6mm，5μm)3种谱柱，考察其对相对校正因子的影响。结果显示不同仪器、谱柱对内参物与待测组分没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a的相对校正因子无显著影响(rsd《5.00％)，百两金皂苷b的rsd值略大(rsd《7.00％)。结果见表4。
[0061]
表4：不同仪器和谱柱对朱砂根中4个成分相对校正因子的影响
[0062]
[0063]
注：s为岩白菜素，a～d分别为没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b
[0064]
2.6.2、柱温、流速对相对校正因子的影响
[0065]
在相同条件下，采用agilent 1260高效液相谱系统和diamonsil-c
18
谱柱，分别考察不同柱温(25、30、35℃)和不同流速(0.8、1.0、1.2ml/min)对相对校正因子的影响。结果显示其rsd《3.00％，表明不同柱温和流速对相对校正因子无显著影响，表明该方法系统耐受性较好。结果见表5。
[0066]
表5：不同柱温和流速对朱砂根中4个成分相对校正因子的影响
[0067][0068]
注：s为岩白菜素，a～d分别为没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b
[0069]
2.6.3、待测组分谱峰的定位
[0070]
利用相对保留值法，以内参物与待测组分间相对保留值(rrt)为定位标准，对各谱峰进行定位，以岩白菜素为内参物(s)，计算没食子酸(a)、棓儿茶酸(b)、百两金皂苷a(c)、百两金皂苷b(d)这4个成分的相对保留时间(t
i/s
)，分别考察不同谱系统和谱柱对相对保留时间(t
i/s
)的影响，结果显示不同仪器、谱柱对内参物与待测组分没食子酸、棓儿茶酸的相对保留值的影响较小(rsd《5.00％)，能够实现谱峰的准确定位，但百两金皂苷a、百两金皂苷b的rsd值均大于5.00％，达到11％以上，因此百两金皂苷a、百两金皂苷b的定位只能采用定性对照品定位，结果见表6。
[0071]
表6：不同仪器和谱柱下朱砂根中4个成分的相对保留值
[0072]
[0073][0074]
注：s为岩白菜素，a～d分别为没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b
[0075]
2.7、一测多评法与外标法测定结果的比较
[0076]
外标法是使用各成分自身的对照品计算其在朱砂根中的含量，而一测多评法是在计算没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b四者时使用它们与岩白菜素之间的相对校正因子进行计算。
[0077]
取0.5g样品粉末，精密称定10份，按“2.2”项下方法制备样品溶液，按“2.3”项下谱条件进样测定，记录峰面积，分别采用外标法(esm)和一测多评法(qams)计算10个批号朱砂根样品中5个成分含量，结果见表7。
[0078]
表7：朱砂根中5个成分的含量测定结果(mg/g)
[0079][0080]
如上表所示，四种成分的外标法(esm)和一测多评法(qams)测定结果之间无明显差异；总体上讲，对于没食子酸、棓儿茶酸二者，外标法结果比一测多评法结果稍高，例如，各样品没食子酸外标法结果比一测多评法结果高14.5％～15％，例如z01样品没食子酸外标法结果比一测多评法结果高14.55％，各样品棓儿茶酸外标法结果比一测多评法结果高9％～9.5％，例如z01样品棓儿茶酸外标法结果比一测多评法结果高9.26％；然而，对于百两金皂苷a、百两金皂苷b二者，一测多评法结果比外标法结果稍高，例如，各样品百两金皂苷a一测多评法结果比外标法结果高2％～2.2％，例如z01样品百两金皂苷a一测多评法结
果比外标法结果高2.06％，各样品百两金皂苷b一测多评法结果比外标法结果高3.7％～3.8％，例如z01样品百两金皂苷b一测多评法结果比外标法结果高3.73％。
[0081]
3、讨论
[0082]
3.1、供试品制备条件的选定
[0083]
本实施例考察了样品提取量(0.5、0.8、1.0、1.2g)，提取方法(超声、回流)，提取时间(40、60、80、100min)，以检测成分较多且峰形较好为指标，最终确定朱砂根供试品溶液的制备方法为取朱砂根样品0.5g，精密加入甲醇25ml，称重，提取方法为回流提取，回流时间为40min，放冷，甲醇补重，摇匀，滤过，取续滤液过0.22μm微孔滤膜，即得。
[0084]
3.2、谱条件的选定
[0085]
在选择流动相时，分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相体系，以朱砂根中所测5个成分的分离效果为指标，最终确定流动相乙腈-0.1％磷酸水溶液，考察不同柱温(25、30、35℃)对谱峰的分离情况，在保证各谱峰分离度的前提下，最终选择柱温30℃。
[0086]
3.3、检测波长的选定
[0087]
本实施例1采用dad检测器在190～400nm进行光谱扫描，由于百两金皂苷a、百两金皂苷b紫外吸收响应值相对较低属于末端吸收，确定检测波长为203nm。
[0088]
3.4、内参物的选定
[0089]
选定好的内参物是建立一测多评法的关键，在选择内参物时，一般选择含量大、稳定性好、制备简单、检测简单的成分。岩白菜素易得、价格低廉、峰面积和保留时间稳定、供试品中的含量高，且在建立的谱系统中分离度较好，位于朱砂根中5个待测成分的中间位置，有利于峰定位时相对保留值的稳定，故本实施例1选定岩白菜素为内参物。
[0090]
本文中所举的实施例仅用以说明本发明的组成及功效，并非因此局限本发明的专利范围，故对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出类似修改，均隶属于本发明的专利范畴。这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
技术特征：
1.朱砂根药材的一测多评含量测定的方法，包括以下步骤：(1)对照品溶液的配制；(2)供试品溶液的制备；(3)建立同时测定没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b含量的高效液相谱法；(4)以岩白菜素为内参物，确定没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a及百两金皂苷b相对校正因子；(5)对于测得的供试品溶液谱图，计算岩白菜素含量，并根据相对校正因子分别计算没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a及百两金皂苷b含量。2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液。3.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，制备对照品溶液时，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液，其中没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b五者浓度分别为2～4μg/ml、15～25μg/ml、0.3～0.7mg/ml、0.6～1.0mg/ml、0.5～1.0mg/ml。4.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)中，制备对照品溶液时，用50％甲醇作为溶剂配制包含没食子酸对照品、棓儿茶酸对照品、岩白菜素对照品、百两金皂苷a对照品及百两金皂苷b对照品的对照品溶液，其中没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷a及百两金皂苷b五者浓度分别为2.5～3.5μg/ml、18～24μg/ml、0.4～0.6mg/ml、0.8～0.9mg/ml、0.6～0.8mg/ml。5.根据权利要求1的方法，其中步骤(2)中，供试品溶液的制备方法为：精密称取朱砂根样品0.5g，精密加入甲醇25ml，称定重量，加热回流40min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm微孔滤膜过滤，即得。6.根据权利要求1的方法，其中步骤(3)中，高效液相谱法的谱条件为：c18谱柱(例如谱柱规格为250mm
×
4.6mm，5μm，例如是diamonsil-c18柱)；以乙腈(a)和0.1％磷酸水溶液(b)为流动相，梯度洗脱(0～22min，8％a；22～30min，8％～30％a；30～40min，30％～30％a；40～60min，30％～40％a；60～65min，40％～100％a)；流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长203nm；进样量10μl；理论塔板数按岩白菜素计不低于5000。7.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b与内参物岩白菜素之间的相对校正因子分别在0.48～0.52范围内、0.42～0.46范围内、83.5～86.5范围内、94.0～104.0范围内。8.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中，没食子酸、棓儿茶酸、百两金皂苷a、百两金皂苷b与内参物岩白菜素之间的相对校正因子分别为0.4900、0.4340、84.8548、98.3806。9.根据权利要求1的方法，其中还包括对所用高效液相谱法进行方法学考察。10.根据权利要求1的方法，其中还包括对所用高效液相谱法进行方法学考察，包括线性关系考察、精密度考察、重复性考察、稳定性考察及加样回收率验证。
技术总结
本发明公开一种朱砂根药材的一测多评含量测定方法，该方法采用高效液相谱法建立了测定朱砂根中没食子酸、棓儿茶酸、岩白菜素、百两金皂苷A及百两金皂苷B含量，并以岩白菜素为内标物一测多评的含量测定方法。检测结果准确稳定，可用于朱砂根药材的质量控制；同时可以弥补朱砂根部分对照品价格昂贵(百两金皂苷A、百两金皂苷B)、部分对照品不稳定(棓儿茶酸)等诸多不足。该发明可以降低检测成本和检测时间，减少工作量，提高效率，为朱砂根的质量标准提升奠定基础。提升奠定基础。提升奠定基础。
