一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法
1.本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法。
背景技术：
2.豆血红蛋白（leghemoglobin，legh）是根瘤菌感染大豆后共同产生的植物来源的血红蛋白。豆血红蛋白作为植物肉生产过程中的添加剂，可以很大程度上提高植物肉的泽和质地，使其与动物肉更为接近。目前豆血红蛋白的主要来源还是从大豆中提取，但是大豆种植周期长，而且天然的豆血红蛋白在大豆中产量比较低，提取较为困难，后期加工成本较高，因此利用微生物表达豆血红蛋白受到人们的广泛关注，且具有很大的市场前景。
3.巴斯德毕赤酵母（pichia pastoris）是一种常用的外源蛋白生产菌，目前已有美国impossible foods公司利用重组毕赤酵母商业化生产豆血红蛋白的报道，但关于毕赤酵母产豆血红的相关研究报道还比较少，且存在血红蛋白的产量较低的问题。
技术实现要素：
4.针对现有技术中存在的豆血红蛋白产量低的问题，本发明设计的目的在于提供一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，该方法能够提高发酵液中菌体密度，提高豆血红蛋白产率。本发明通过以下技术方案加以实现。
5.所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，该方法包括以下步骤：1）毕赤酵母重组菌种子液的制备；2）将步骤1）得到的毕赤酵母重组菌种子液接种到生长培养基中进行菌体发酵培养；3）待培养至对数生长中期后，将发酵液静置或离心，使菌液分离，倾倒出上清液，得到对数生长期的毕赤酵母菌体，向毕赤酵母菌体中补入与倾倒出的上清液等体积新鲜的发酵培养基，重新进行发酵，发酵过程中，每隔24h，向发酵培养基中补入适量的甲醇，使发酵培养基中甲醇终浓度维持在0.8-1.2%之间；4）发酵结束后，将发酵液静置，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液，进行豆血红蛋白的含量测定。
6.进一步地，步骤1）中，毕赤酵母重组菌种子液制备用的培养基体系中含有1%的葡萄糖，1%的甘油，2%的普通蛋白胨，1%的酵母提取物。
7.进一步地，步骤1）中，毕赤酵母重组菌种子液培养条件为：培养时间为24h，培养温度30℃，摇床转速250r/min，毕赤酵母重组菌种子液的接种量为2%。
8.进一步地，步骤2）中生长培养基的体系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的无氨基酵母氮源，1%的硫酸铵，4
×
10-5
%的生物素，1%的甘油，100mm ph为6.0的磷酸钾缓冲液。
9.进一步地，步骤2）菌体发酵培养的条件为：培养温度30℃，摇床转速250r/min。
10.进一步地，步骤3）中发酵培养基的体系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的ynb，1%的硫酸铵，4
×
10-5 %的生物素，1%的甲醇，100mm ph为6.0的磷酸钾缓冲液，10μm/l的铁盐。
11.进一步地，步骤3）中，发酵培养基的培养条件为：培养温度28℃，摇床转速250r/min。
12.进一步地，步骤3）中，发酵培养基中甲醇终浓度维持为0.8-1.2%，发酵时间为96h。
13.进一步地，所述蛋白胨为酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉蛋白胨及鱼蛋白胨中的任一种。
14.进一步地，所述铁盐为血红素、高铁血红素、氯化血红素、柠檬酸铁、硫酸亚铁及氯化亚铁中的任一种。
15.进一步地，本发明还提供了上述技术方案中所用的发酵培养基中添加不同来源的蛋白胨和不同种类的铁盐在毕赤酵母生产豆血红蛋白中的应用。
16.本发明方法通过采用向发酵培养基中加入不同来源的蛋白胨和不同种类的铁盐进行发酵生产，在发酵周期结束后，通过分离菌体细胞和发酵液，得到含豆血红蛋白的发酵液，经测定发酵液中的菌体密度和豆血红蛋白的产率都有所提高。
具体实施方式
17.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，以更好地理解本技术方案。
18.实施例1步骤1：选取培养良好的平板菌种挑取单菌落接种于种子培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养24h；上述种子培养基体系含有：葡萄糖1%（单独灭菌，接种前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
19.步骤2：将制备好的种子液以2%的比例接种至生长培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养16h；上述生长培养基体系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，无氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸铵，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm。
20.步骤3：将步骤2发酵后的发酵液静置沉降分离出上清液，补入同体积的发酵培养基；上述发酵培养基体系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，ynb 0.34%，硫酸铵1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm，血红素10μm/l。
21.步骤4：向步骤3中的发酵液中每隔24h补充入一定甲醇，使甲醇浓度维持在1%，并且发酵持续96h后结束发酵，将震荡混匀后的发酵液静置一段时间后，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液。
22.经测定，在生长培养基和发酵培养基中采用大豆蛋白胨，并在发酵培养基中添加10μm/l的血红素，与使用普通蛋白胨和不添加血红素的培养基相比，豆血红蛋白的产量提高了40.7%。
23.实施例2步骤1：选取培养良好的平板菌种挑取单菌落接种于种子培养基中，装液量为
250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养24h；上述种子培养基体系含有：葡萄糖1%（单独灭菌，接种前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
24.步骤2：将制备好的种子液以2%的比例接种至生长培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养16h；上述生长培养基体系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，无氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸铵，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm。
25.步骤3：将步骤2发酵后的发酵液静置沉降分离出上清液，补入同体积的发酵培养基；上述发酵培养基体系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%， ynb 0.34%，硫酸铵1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm，柠檬酸铁10μm/l。
26.步骤4：向步骤3中的发酵液中每隔24h补充入一定甲醇，使甲醇浓度维持在0.8%，并且发酵持续96h后结束发酵，将震荡混匀后的发酵液静置一段时间后，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液。
27.经测定，在生长培养基和发酵培养基中采用大豆蛋白胨，并在发酵培养基中添加10μm/l的柠檬酸铁，与使用普通蛋白胨和不添加柠檬酸铁的培养基相比，豆血红蛋白产量提高了28.3%。
28.实施例3步骤1：选取培养良好的平板菌种挑取单菌落接种于种子培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养24h；上述种子培养基体系含有：葡萄糖1%（单独灭菌，接种前加入），普通蛋白胨2%，酵母提取物1%，甘油1%。
29.步骤2：将制备好的种子液以2%的比例接种至生长培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养16h；上述生长培养基体系含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%，无氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸铵，生物素4
×
10-5 %，甘油1%， 磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm。
30.步骤3：将步骤2发酵后的发酵液静置沉降分离出上清液，补入同体积的发酵培养基；上述发酵培养基体系中含有：酵母粉1%，大豆蛋白胨2%， ynb 0.34%，硫酸铵1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm。
31.步骤4：向步骤3中的发酵液中每隔24h补充入一定甲醇，使甲醇浓度维持在1%，并且发酵持续96h后结束发酵，将震荡混匀后的发酵液静置一段时间后，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液。
32.经测定，在生长培养基和发酵培养基中采用大豆蛋白胨代替普通蛋白胨，豆血红蛋白产量提高了15.2%。
33.实施例4步骤1：选取培养良好的平板菌种挑取单菌落接种于种子培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养24h；上述种子培养基体系含有：葡萄糖1%（单独灭菌，接种前加入），普通蛋白胨2%，酵
母提取物1%，甘油1%。
34.步骤2：将制备好的种子液以2%的比例接种至生长培养基中，装液量为250ml三角瓶中50ml种子培养基，于摇床28℃，250 r/min培养16h；上述生长培养基体系含有：酵母粉1%，普通蛋白胨2%，无氨基酵母氮源0.34%，1 %硫酸铵，生物素4
×
10-5 %，甘油1%，磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm。
35.步骤3：将步骤2发酵后的发酵液静置沉降分离出上清液，补入同体积的发酵培养基；上述发酵培养基体系中含有：酵母粉1%，普通蛋白胨2%，ynb 0.34%，硫酸铵1%，生物素4
×
10-5 %，甲醇1%，磷酸钾缓冲液（ph 6.0）100mm，血红素10μm/l。
36.步骤4：向步骤3中的发酵液中每隔24h补充入一定甲醇，使甲醇浓度维持在1%左右，发酵持续96h后结束发酵，将振荡混匀后的发酵液静置一段时间后，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液。
37.经测定，在生长培养基和发酵培养基中采用普通蛋白胨、在发酵培养基中添加血红素10μm/l的血红素，与不添加血红素相比，豆血红蛋白产量提高了17.1%。
技术特征：
1.一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：1）毕赤酵母重组菌种子液的制备；2）将步骤1）得到的毕赤酵母重组菌种子液接种到生长培养基中进行菌体发酵培养；3）待培养至对数生长中期后，将发酵液静置或离心，使菌液分离，倾倒出上清液，得到对数生长期的毕赤酵母菌体，向毕赤酵母菌体中补入与倾倒出的上清液等体积新鲜的发酵培养基，重新进行发酵，发酵过程中，每隔24h，向发酵培养基中补入适量的甲醇，使发酵培养基中甲醇终浓度维持在0.8-1.2%之间；4）发酵结束后，将发酵液静置，小心倾倒进行菌液分离，得到含有豆血红蛋白的发酵液清液，进行豆血红蛋白的含量测定。2.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤1）中，毕赤酵母重组菌种子液制备用的培养基体系中含有1%的葡萄糖，1%的甘油，2%的普通蛋白胨，1%的酵母提取物。3.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤1）中，毕赤酵母重组菌种子液培养条件为：培养时间为24h，培养温度30℃，摇床转速250r/min，毕赤酵母重组菌种子液的接种量为2%。4.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤2）中生长培养基的体系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的无氨基酵母氮源，1%的硫酸铵，4
×
10-5
%的生物素，1%的甘油，100mm ph为6.0的磷酸钾缓冲液。5.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤2）菌体发酵培养的条件为：培养温度30℃，摇床转速250r/min。6.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤3）中发酵培养基的体系中含有1%的酵母粉，2%的蛋白胨，0.34%的ynb，1%的硫酸铵，4
×
10-5 %的生物素，1%的甲醇，100mm ph为6.0的磷酸钾缓冲液，10μm/l的铁盐。7.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤3）中，发酵培养基的培养条件为：培养温度28℃，摇床转速250r/min。8.如权利要求1所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于步骤3）中，发酵培养基中甲醇终浓度维持为0.8-1.2%，发酵时间为96h。9.如权利要求4或6所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于所述蛋白胨为酵母蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨、牛肉蛋白胨及鱼蛋白胨中的任一种。10.如权利要求6所述的一种提高重组毕赤酵母产豆血红蛋白的方法，其特征在于所述铁盐为血红素、高铁血红素、氯化血红素、柠檬酸铁、硫酸亚铁及氯化亚铁中的任一种。
技术总结
本发明公开了一种提高重组毕赤酵母发酵产豆血红蛋白的方法，涉及微生物工程技术领域，本发明方法通过在发酵培养基中添加不同来源的蛋白胨和不同种类的铁盐以促进毕赤酵母豆血红蛋白的发酵生产。菌体在生长培养基中培养一定时间后，将菌体沉淀后，弃去上清液，补入添加不同来源蛋白胨和不同种类铁盐的新鲜发酵培养基将菌体重新悬浮后继续发酵，进行豆血红蛋白的诱导表达。本发明利用向发酵培养基中加入不同种类的蛋白胨和铁盐，提高了发酵液中重组毕赤酵母的菌体密度和豆血红蛋白的产率。重组毕赤酵母的菌体密度和豆血红蛋白的产率。
