一种环状RA在HPV16阳性宫颈癌预后评估中的应用的制作方法
一种环状rna在hpv16阳性宫颈癌预后评估中的应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种环状rna在hpv16阳性宫颈癌预后评估中的应用。
背景技术：
2.宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，发病率和死亡率呈逐年升高的趋势，居女性恶性肿瘤死亡率第二位。超过50％的宫颈癌患者存在高危人乳头瘤病毒hpv16感染，是宫颈癌的主要致病元凶之一。虽然目前hpv16疫苗已在临床上用于宫颈癌预防，但对已经感染hpv及其所致的宫颈癌和癌前病变，尚无特异性方法。最新重磅研究显示：hpv16独特的致癌性主要取决于病毒核心dna编码的e7癌蛋白，e7促进了hpv16阳性宫颈癌的发生发展，但具体机制尚不明确。因此，以e7癌蛋白为切入点，深入探索hpv16相关宫颈癌的发生发展机制，挖掘其诊疗特异性靶标，具有非常现实的临床转化意义。
3.近年来不断有研究报道病毒相关的肿瘤与非编码rna(non-coding rna,ncrna)关系密切：如hbv相关肝癌中lncrna hbx-line1可通过emt途径促进肝癌侵袭转移，并与预后显著相关；ebv编码的mir-bart6-3p可通过emt下调lncrna-loc553103表达抑制ebv相关鼻咽癌和胃癌的侵袭转移。在宫颈癌领域，mir-146a-5p通过上调kdm2b的表达促进了hpv16相关宫颈癌的侵袭转移；e7癌蛋白通过下调lncrnahotair的表达激活下游促癌基因hoxd10表达，从而促进hpv16相关宫颈癌的恶性进展。环状rna(circular rna，circrna)作为一类特殊的非编码rna分子，可调控肿瘤的恶性进展。
技术实现要素：
4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了环状rna circ-0036602或其检测试剂在制备预防或宫颈癌或宫颈癌预后评估药物中的应用
5.技术方案：本发明提供了环状rna circ-0036602或其检测试剂在制备预防或宫颈癌或宫颈癌预后评估药物中的应用。
6.其中，所述宫颈癌为hpv16阳性宫颈癌。
7.本发明的环状rna在hpv16阳性宫颈癌组织中高表达。
8.本发明的环状rna在hpv16阳性宫颈癌细胞(caski和siha)中高表达，在hpv16阴性细胞(c33a)中及正常宫颈上皮细胞(hacat)中低表达或者不表达。
9.本发明的环状rna在hpv16阳性宫颈癌组织中与患者预后相关，呈其表达越高，预后越差。基于此，我们提出环状rna基因表达检测可以应用于hpv16阳性宫颈癌的预后评估，指导个体化。
10.本发明内容还包括一种检测宫颈癌组织或细胞或正常宫颈细胞或hpv16阴性细胞中环状rnacirc-0036602表达水平的试剂或试剂盒。
11.其中，所述宫颈癌细胞为caski细胞或siha细胞，所述正常宫颈细胞为hacat细胞，所述hpv16阴性细胞为c33a细胞。
12.其中，所述试剂或试剂盒包括针对所述环状rna的引物对。
13.其中，所述引物对序列如seq id：no.3和seq id：no.4所示，其长度约20bp，扩增产物约200bp
14.其中，所述试剂盒还可包含针对内参基因的核酸序列引物对，其内参引物对序列参见seq id：no.9和seq id：no.10所示。
15.其中，所述试剂盒包括反转录试剂盒或荧光定量pcr试剂盒。
16.其中，所述反转录试剂盒包括聚合酶链式反应所需的其他元件。
17.其中，所述荧光定量pcr试剂盒包括pcr反应管、预混合反应液和无菌水。
18.有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：本发明公开了环状rna(circ-0036602)是一种可靠的与hpv16阳性宫颈癌预后相关分子靶标，可以通过检测患者该类基因表达水平判断预后，指导临床制定个体化化疗方案，提高疗效。
附图说明
19.图1：(a)e7干扰效率检测；(b)caski-nc组和caski-shrna-e7组circrna表达谱芯片结果和go分析；(c)siha-nc组和siha-shrna-e7组circrna表达谱芯片结果和kegg分析；(d)芯片分析获得的3条上调和3条下调的circrna基本信息；
20.图2：(a-f)circ-0011968，circ-0005092，circ-0036602，circ-0013306，circ-0008995，circ-0008731在30例hpv16阳性和30例hpv16阴性宫颈癌组织中的表达水平；
21.图3：(a)circ-0036602表达与e7癌蛋白表达正相关；(b-c)circ-0036602表达与分化程度及淋巴结转移相关性分析；(d)kaplan-meier生存分析；(e)circ-0036602在hpv16阳性和hpv16阴性宫颈癌细胞株以及正常宫颈上皮细胞中的表达；(hpv16+cc：hpv16阳性宫颈癌，hpv16-cc：hpv16阴性宫颈癌)。
具体实施方式
22.根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
23.实施例
24.1、宫颈癌组织样本收集
25.收集hpv16阳性宫颈癌组织和hpv16阴性宫颈癌组织各30例，所有样本离体后立即放入液氮冻存，整个操作及保存过程遵循无酶原则。
26.2、rna提取
27.trizol裂解宫颈癌细胞和组织。利用细胞和组织rna抽提试剂盒(tiangen公司)提取总rna，具体操作详见说明书。
28.3、rna样品的质量分析
29.nanodrop2000检测rna的浓度和纯度，od260/280范围区间为1.8-2.2，agilenttechnologies 2100 bioanalyzer检测总rna的浓度、rin值、28s/18s和片段大小，rna完整性指数合格，浓度≥20ng/μl，进行mrna文库构建。
30.4、逆转录和荧光定量pcr
31.将rna的定量统一后，按照takara反转录试剂盒(rt reagent kit with gdna eraser)的说明书进行第一链cdna的制备：
32.1)基因组dna的除去反应：
[0033][0034][0035]
2)基因组dna的除去反应程序：42℃反应2分钟；4℃保存；
[0036]
3)逆转录反应：
[0037][0038]
4)程序：37℃反应15分钟；85℃反应5秒钟；4℃反应5分钟；
[0039]
5)将逆转录所得到的cdna样品以及剩余的rna样品，-80℃冰箱内保存备用。
[0040]
6)荧光定量pcr
[0041]
10μl real-time pcr体系：
[0042][0043]
引物序列：
[0044]
在ncbi数据库里面选择znf592、circ-0036602、mir-34a-5p、mir-431-5p和β-actin，然后查到相应基因的dna序列。使用引物设计软件primer 5.0进行引物设计，引物序列见下表：
[0045][0046][0047]
7)pcr扩增程序：95℃，3分钟；
[0048][0049]
8)结果分析
[0050]
以β-actin为内参，应用荧光定量pcr仪进行扩增，检测各个样本的ct值，然后结果导出excel表格，相对定量使用公式2
‑△△
ct进行计算，
△△
ct＝(目的基因ct值-β-actinct值)实验组-(目的基因ct值-β-actinct值)对照组。
[0051]
5、统计学分析
[0052]
采用spss22.0和graphpadprism6.0软件进行数据统计和结果分析，结果以平均值
±
标准误表示。hpv16阳性宫颈癌组织和hpv16阴性宫颈癌组织两组间比较时用独立样本t检验分析。以p＜0.05和p＜0.01为差异，具有统计学意义。
[0053]
6、实验结果
[0054]
6.1功能circrna的筛选
[0055]
选取hpv16阳性宫颈癌细胞株caski和siha，应用慢病毒构建e7蛋白敲减稳转细胞株(caski-shrna-e7、siha-shrna-e7)，western blot检测干扰效率，同时选取对照细胞株(caski-nc、siha-nc)分别进行circrna表达谱芯片检测，caski-nc组与caski-shrna-e7组相比，共有1265个circrna差异表达，其中894条上调，371条下调(fold change》3，p《0.05)；对差异表达circrna所对应宿主基因进行go分析显示，与细胞粘附、染体分离及细胞内外受体互作密切相关(图1a)。siha-nc组与siha-shrna-e7组相比，共有1384个circrna差异表达，其中963条上调，421条下调(fold change》3，p《0.05)；对差异表达circrna所对应的宿主基因进行kegg pathway分析显示，与细胞进程及调控、细胞的侵袭转移等相关(图1b)。进一步，将上述2类差异表达基因取交集，结合表达丰度高，均一性好，上下调一致原则，获得3条高表达以及3条低表达差异circrna(图1c)。
[0056]
6.2目标circrna的验证
[0057]
为进一步筛选候选验证靶标，我们采用qrt-pcr技术，针对上述6个差异表达circrna成环位点设计特异性背向引物(divergent primer)，在30例hpv16阳性和30例hpv16阴性宫颈癌组织中进行验证，结果发现circ-0036602在hpv16阳性宫颈癌组织中表达差异最显著，上调4.07倍，均一性好。(图2a-f)。
[0058]
6.3 circ-0036602与宫颈癌患者临床病理特征分析
[0059]
将circ-0036602与e7癌蛋白的表达进行相关性分析。发现circ-0036602与e7癌蛋白表达显著相关(图3a)，结合临床病理特征，circ-0036602表达水平与分化(p＝0.02，图3b)和淋巴结转移密切相关(p＝0.017，图3c)，并且表达越高患者预后越差(图3d)。在hpv16阳性宫颈癌细胞株(caski和siha)中、hpv16阴性宫颈癌细胞株(c33a)和正常宫颈上皮细胞(hacat)中检测，发现circ-0036602在caski和siha中表达高于c33a和hacat(图3e)。
技术特征：
1.环状rna circ-0036602或其检测试剂在制备预防或宫颈癌或宫颈癌预后评估药物中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述宫颈癌为hpv16阳性宫颈癌。3.一种检测宫颈癌组织或细胞或正常宫颈细胞或hpv16阴性细胞中环状rna circ-0036602表达水平的试剂或试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述宫颈癌细胞为caski细胞或siha细胞，所述正常宫颈细胞为hacat细胞，所述hpv16阴性细胞为c33a细胞。5.根据权利要求3所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括针对所述环状rna的引物对。6.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述引物对序列如seq id：no.3和seq id：no.4所示。7.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还可包含针对内参基因的核酸序列引物对。8.根据权利要求5所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括反转录试剂盒或荧光定量pcr试剂盒。9.根据权利要求7所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述反转录试剂盒包括聚合酶链式反应所需的其他元件。10.根据权利要求8所述的试剂或试剂盒，其特征在于，所述荧光定量pcr试剂盒包括pcr反应管、预混合反应液和无菌水。
技术总结
本发明公开了环状RA circ-0036602或其检测试剂在制备预防或宫颈癌或宫颈癌预后评估药物中的应用。本发明还公开了检测宫颈癌组织或细胞或正常宫颈细胞或HPV16阴性细胞中环状RA circ-0036602表达水平的试剂或试剂盒。本发明公开的环状RA（circ-0036602）是一种可靠的与HPV16阳性宫颈癌预后相关分子靶标，可以通过检测患者该类基因表达水平判断预后，指导临床制定个体化化疗方案，提高疗效。提高疗效。提高疗效。
