一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用的制作方法
一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用。
背景技术：
2.肺炎克雷伯菌（klebsiella pneumoniae）是一种常见的人畜共患病原菌，近年来，多重耐药肺炎克雷伯菌已成为医源性感染的最主要病原体之一，该细菌不但对人类公共卫生事业造成了巨大威胁，而且在一定程度影响了动物养殖业的健康发展。
3.大多数肺炎克雷伯菌具有合成和分泌荚膜多糖的能力，荚膜多糖作为细菌的天然屏障可维持细菌毒力、粘附、阻断一些抗生素渗透，作为肺炎克雷伯菌的重要毒力因子，荚膜多糖对公众健康构成巨大威胁，此外，一些肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，因此，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验。
4.噬菌体解聚酶（depolymerase）通过降解细菌表面多糖，进而引导噬菌体吸附于宿主外膜蛋白。该酶通过随机攻击糖苷键以释放聚合物的重复单元，实现靶向降解荚膜多糖，诸多国内外研究表明，噬菌体解聚酶可有效清除并抑制生物被膜的形成，在控制病原感染等公共卫生领域具备一定的应用潜力。但是，不同来源、不同核酸序列以及不同蛋白结构的噬菌体解聚酶，对不同类型的荚膜多糖和生物被膜所表现的降解性能也是有非常大的差别。
5.例如，文献：“biological properties and genomics analysis of vb_kpns_gh-k3, a klebsiella phage with a putative depolymerase-like protein，virus genes (2019) 55:696
–
706”公开了一种噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对k2型起作用，对kl2型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。
技术实现要素：
6.本发明的目的在于提供一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，以解决上述背景技术中提出的肺炎克雷伯菌可形成生物被膜，即由细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构，能显著提高细菌对抗生素的耐药性及逃避宿主免疫系统识别的能力，从而加速细菌在病灶内的定植，生物被膜是医院内细菌感染的主要致病因素，另外，生物被膜能够稳定地附着于医用器械表面，通过常规物理化学手段难以清除，这给防控医疗继发感染带来了严峻考验，同时噬菌体解聚酶样蛋白，该蛋白表明只对kl2型起作用，对其他k型的肺炎克雷伯菌的荚膜多糖和生物被膜并没有降解效果。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，该噬菌体解聚酶depo58的制备与对肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解包括如下步骤：s1.通过pcr方法获得肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pet28a质粒上，得到pet28a-depo58质粒；s2.将pet28a-depo58质粒转化到大肠杆菌bl21，筛选得到bl21-depo58大肠杆菌，将该bl21-depo58大肠杆菌在1l含有50
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g/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；s3.向上述lb液体培养基中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为0.3 mm，并在16℃和180转/分振荡诱导表达16小时；s4.将诱导表达的bl21-depo58菌液离心集菌离心后进行超声破碎，将上清液样品加入ni-nta亲和层析柱，洗涤ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液并经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶depo58；s5.将含有100μl对数期细菌的0.5%半固体lb培养基均匀平铺在固体lb培养基上，自然晾干后，取5
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l稀释浓度的dpo58滴在双层平板上，缓冲液作为阴性对照，37℃培养箱中静置培养过夜，浓度为100
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g/ml~0.097
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g/ml的噬菌体解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑点；优选的：所述肺炎克雷伯菌噬菌株p719，名为klebsiellaphage p719。
8.优选的：所述该噬菌体解聚酶depo58为肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的原核表达和纯化产物。
9.优选的：所述该噬菌体解聚酶depo58的核苷酸序列如seqidno：1所示。
10.优选的：所述肺炎克雷伯菌包括kl2型肺炎克雷伯菌。
11.优选的：所述s1中肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的depo58基因pcr产物经纯化后连接至pet28a质粒的酶切位点为ndei和xhoi。
12.优选的：所述用于构建解聚酶表达载体的上游引物f（seqidno:3）的dna序列为：5
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gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’。
13.优选的：所述用于构建解聚酶表达载体下游引物r（seqidno:4）的dna序列为：5
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gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。
14.优选的：所述该解聚酶depo58可对kl2型肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：该基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用；1、本发明公开了一种肺炎克雷伯菌噬菌株p719，通过对肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框（orf58），进行原核表达和纯化而获得了噬菌体解聚酶depo58，该解聚酶能够清除kl2型肺炎克雷伯菌所形成的荚膜多糖；2、该噬菌体解聚酶depo58可对细菌自身产生的胞外多糖基质、脂蛋白、纤维蛋白等所包裹的细菌细胞所形成的膜状结构的形成具有高效的抑制作用，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。
附图说明
16.图1为本发明的噬菌体解聚酶depo58的电泳图；图2为本发明噬菌体解聚酶depo58的sds-page电泳图；图3为不同浓度的解聚酶depo58对kl2型肺炎克雷伯菌kp125的抑制效果图。
具体实施方式
17.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
18.本发明提供了一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用；实施例1本技术方案提供一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，噬菌体解聚酶depo58的制备其具体步骤如下：s1：目的产物扩增设计用于构建解聚酶表达载体的引物：上游引物f（seqidno:3）的dna序列为：5
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gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’；下游引物r（seqidno:4）的dna序列为：5
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gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。
19.pcr扩增程序为95℃变性3min；95℃变性15s；50℃退火15s；72℃延伸2min；并进行30个循环。
20.将来自肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的depo58基因pcr产物经纯化后连接至pet28a质粒：酶切位点ndei和xhoi；s2：将pet28a-depo58质粒加入到100μl大肠杆菌bl21（de3）感受态细胞中，轻弹管壁进行液体均匀混匀，随后在冰上静置30min，将静置后的液体置于42℃水浴热激45sec后，随后迅速置于冰上静置2min；向离心管中加入900μlsoc液体培养基，混匀后置于37℃，180rpm摇床中复苏1h。
21.并离心3min，弃掉900μl上清，用剩余培养基将菌体重悬后，均匀涂布在含卡那霉素的lb固体培养基平板上。
22.将平板正置于37℃培养箱10min，待菌液被完全吸收后，倒置平板，过夜培养；使用通用t7引物扩增，再经琼脂糖凝胶电泳筛选得到bl21-depo58阳性克隆大肠杆菌，琼脂糖凝胶电泳图见附图1，其中，泳道m为marker，泳道1，2为随机挑选的单菌落pcr产物。
23.s3：将bl21-depo58在1l含有50μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期（od
600 0.6~1.0）；s4：向培养液中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为0.3mm，16℃、180转/分
振荡培养16小时；s5：将诱导表达的bl21-depo58菌液离心集菌（6000转/分，10分钟），使用预冷的pbs洗涤菌体2~3次，然后用适量的蛋白纯化缓冲液悬浮菌体。悬起的bl21-depo58菌液经冰浴后，进行超声破碎（工作3秒，间歇6秒，全过程冰浴），离心并吸取上清；将上清液样品轻轻加入平衡后的ni-nta亲和层析柱，待上清液与ni柱充分结合后，收集流出液以待后续分析。依次使用含50 mm咪唑、100 mm咪唑、250 mm咪唑的洗涤缓冲液各4个柱体积，洗涤ni柱以去除杂蛋白；然后用4个柱体积含500mm咪唑的洗脱液，洗脱目的蛋白。收集洗脱液后经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶depo58，其核苷酸序列如seqidno：1所示；氨基酸序列如seqidno：2所示。使用bca蛋白定量试剂盒对纯化后的噬菌体解聚酶depo58进行浓度测定，分装并保存于-80℃冰箱。
24.s6：sds-page电泳分析配制12％的分离胶和5％的浓缩胶，如下表1和表2所示：表1sds-page分离胶（12%）溶液成分体积（ml）ddh2o3.330%丙烯酰胺4.01.5mol/ltris
·
hcl（ph8.8）2.510％sds0.110％过硫酸胺（ap）0.1temed0.004total10表2sds-page浓缩胶（5%丙烯酰胺）溶液成分体积（ml）ddh2o6.830%丙烯酰胺1.71.5mol/ltris
·
hcl（ph8.8）1.2510％sds0.110％过硫酸胺（ap）0.1temed0.01total10纯化样品煮沸10分钟后上样，浓缩胶电压80v，20min，分离胶电压120v，电泳1.5h，考马斯亮蓝染，脱观察，在~80kda处有明显的条带出现，纯化蛋白电泳图见附图2，其中，泳道1为marker，泳道2为纯化蛋白。
25.实施例2本技术方案提供一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58分别清除kl2型细菌荚膜多糖，其具体步骤如下：s1、采用斑点实验来检测噬菌体解聚酶depo58对大肠杆菌生物被膜的抑制活性，将含有100μl对数期细菌的0.5%半固体lb培养基均匀平铺在固体lb培养基上，自然晾干后，5ꢀµ
l一系列稀释浓度的dpo58 （100
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g/ml、25
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g/ml、5.256
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g/ml、1.56
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g/ml、0.39
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g/ml和0.097
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g/ml、0.024
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g/ml）滴在双层平板上，缓冲液作为阴性对照，37℃培养箱中静置培养过夜，浓度为100
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g/ml~0.097
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g/ml的噬菌体解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑点，如图3所示。
26.进而可以得出通过对肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框（orf58），进行原核表达和纯化而获得噬菌体解聚酶depo58，该解聚酶能够清除kl2型肺炎克雷伯菌所形成的荚膜多糖，对肺炎克雷伯菌进行有效的抑制作用，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。
27.本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
28.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
29.序 列 表《120》 一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用《141》
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2021-11-01《160》
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4《170》
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siposequencelisting 1.0《210》
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1《211》
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2292《212》
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dna《213》
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k.peneumoniae《400》
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2《211》
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763《212》
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prt《213》
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k.peneumoniae《400》
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3《211》
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31《212》
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dna《213》
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artificial sequence《400》
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技术特征：
1.一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：该噬菌体解聚酶depo58的制备与对肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解包括如下步骤：s1.通过pcr及基因片段纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pet28a质粒上，得到pet28a-depo58质粒；s2.将pet28a-depo58质粒转化到大肠杆菌bl21，筛选得到bl21-depo58大肠杆菌，将该bl21-depo58大肠杆菌在1l含有50
ꢀµ
g/ml卡那霉素的lb液体培养基中，37℃振荡培养至对数生长期；s3.向上述lb液体培养基中加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷至终浓度为0.3 mm，并在16℃和180转/分振荡诱导表达16小时；s4.将诱导表达的bl21-depo58菌液离心集菌离心后进行超声破碎，将上清液样品加入ni-nta亲和层析柱，洗涤ni柱以去除杂蛋白，最后收集洗脱液并经超滤得到纯化的噬菌体解聚酶depo58；s5.随后将含有100
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l对数期细菌的0.5%半固体lb培养基均匀平铺在固体lb培养基上，自然晾干后，取5
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l稀释浓度的dpo58滴在双层平板上，缓冲液作为阴性对照，37℃培养箱中静置培养过夜，浓度为100、25、6.256、1.56、0.39和0.097
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g/ml的噬菌体解聚酶depo58使平板上形成半透明的斑点。2.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌噬菌株p719，名为klebsiellaphage p719。3.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述该噬菌体解聚酶depo58为肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的原核表达和纯化产物。4.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述该噬菌体解聚酶depo58的核苷酸序列如seqidno：1所示。氨基酸序列如seq id no：2所示。5.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述肺炎克雷伯菌包括kl2型肺炎克雷伯菌。6.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述s1中肺炎克雷伯菌噬菌株p719第58位开放阅读框的depo58基因pcr产物经纯化后连接至pet28a质粒的酶切位点为ndei和xhoi。7.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述用于构建解聚酶表达载体的上游引物f（seqidno:3）的dna序列为：5
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gtgccgcgcggcagccatatggcactatacagacaaggcaaa-3’。8.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：所述用于构建解聚酶表达载体下游引物r（seqidno:4）的dna序列为：5
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gtggtggtggtggtgctcgagttagataaagtttattagaacgccatcg-3’。9.根据权利要求1所述的一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株p719的噬菌体解聚酶depo58及应用，其特征在于：该解聚酶depo58可对kl2型肺炎克雷伯菌荚膜多糖降解。
技术总结
本发明公开了一种基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的解聚酶Depo58及应用，该噬菌体解聚酶Depo58的制备包括如下步骤：S1.通过PCR及基因片段纯化获得肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框的depo58基因片段，将该depo58基因片段连接至pET28a质粒上，得到pET28a-depo58质粒；S2.将pET28a-depo58质粒转化到大肠杆菌BL21。基于肺炎克雷伯菌噬菌株P719的噬菌体解聚酶Depo58及应用：通过对肺炎克雷伯菌噬菌株P719第58位开放阅读框（orf58），进行原核表达和纯化而获得了噬菌体解聚酶Depo58，该解聚酶能够清除KL2型肺炎克雷伯菌所形成的荚膜多糖，并且具有对生物被膜的形成具有高效的抑制作用的潜力，可广泛应用于制备抗生素替代制剂及医疗器械消毒剂中，具有显著地临床效果。具有显著地临床效果。具有显著地临床效果。
