金银花U6启动子及其应用
金银花u6启动子及其应用
技术领域
1.本发明涉及金银花u6启动子克隆及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
2.近年来，crispr/cas9技术因其操作简便、试验周期短、效率高、脱靶率低等特点成为最常用的基因编辑技术，在作物遗传育种、植物基因改造及农作物品种改良方面展现巨大的潜力。crispr/cas9基因编辑系统包括能够作为核酸酶切割双链dna的cas9蛋白，以及一个人工融合的单向导rna(single guide rna，sgrna)，sgrna决定靶序列的特异性，在crispr/cas9基因编辑系统起着重要作用。现有研究表明，crispr/cas9技术编辑效率依赖于cas9和sgrna的高表达，强组成型rna聚合酶ⅱ启动子如花椰菜花叶病毒35s(camv35s)，通常用于驱动cas9表达，而sgrna通常由u6启动子驱动。u6启动子是一种rna聚合酶ⅲ启动子，具有明确的转录起始位点，能识别从g开始的高度保守的起始位点，已被频繁用于驱动植物小rna的高水平表达，并已成为驱动crispr/cas9载体中sgrna表达的首选。
3.现有研究表明，同一物种基因组中存在多个不同表达的u6基因，并非所有的u6启动子都能驱动基因表达且不同启动子转录效率并不相同，u6启动子的高度保守性使其在不同的物种之间仍具有转录活性，但在同源关系较远的不同物种之间转录活性存在一定差异，有文献报道内源性u6启动子可使sgrna表达增加，从而提高编辑效率，在大豆中，使用大豆内源性u6启动子gmu6-10构建pcas9-gmu6-sgrna载体突变率远高于使用拟南芥atu6-26构建的pcas9-atu6-sgrna载体的突变率。lu等使用棉花内源性ghu6.3启动子驱动sgrna发现其表达量是拟南芥atu6-29启动子的6～7倍，编辑的突变效率提高了4～6倍。目前，已在拟南芥、水稻、小麦、大豆、玉米、棉花、番茄等多种植物中利用植物自身的u6启动子建立crispr/cas9基因组编辑系统，实现目的基因的高效编辑。
4.金银花是常用大宗药材，具有清热解毒、疏散风热的功效，主要活性成分为黄酮类、有机酸、挥发油、三萜皂苷等，开发利用前景广阔，需求量逐年增加。然而，关于金银花u6启动子的研究尚未见报道，严重制约了金银花基因编辑技术的开展。
技术实现要素：
5.针对上述现有技术，本发明提供了金银花u6启动子，及其在转基因技术中的应用。本发明通过pcr及农杆菌侵染烟草叶片瞬时转化方法克隆并筛选高转录活性的金银花u6启动子，对于构建金银花crispr/cas9基因编辑系统，实现金银花的分子育种具有重要意义。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.金银花u6启动子，其核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2或seq id no.4所示。
8.所述金银花u6启动子在转基因技术中的应用，在金银花基因编辑中的应用，比如专门应用于金银花crispr/cas9编辑系统，用于驱动sgrna的表达。
9.一种基因编辑载体，含有上述的金银花u6启动子。
10.所述基因编辑载体在转基因技术中的应用，在金银花基因编辑中的应用，比如专门应用于金银花crispr/cas9编辑系统，用于驱动sgrna的表达。
11.一种pbi121融合表达载体，由植物表达载体pbi121与gus基因连接而成，植物表达载体pbi121的启动子为上述的金银花u6启动子。
12.本研究首次克隆得到4个金银花u6启动子，分别构建了其lju6-pbi121融合表达载体，在4个启动子中，有3个启动子具有转录活性，其中lju61-f1转录活性最高且长度最短，适用于金银花crispr/cas9编辑系统，可用于启动sgrna引导序列的表达。
13.本发明以金银花基因组dna为模板，克隆并筛选出具有较高转录活性的金银花u6启动子。采用pcr方法，从金银花基因组中克隆到4个lju6启动子，长度分别为336bp、708bp、359bp、602bp，plantcare分析发现4个启动子中均含有tata框以及caat框等典型的启动子顺式元件，且包含与光响应、胁迫响应等相关的调控元件；克隆产物经测序正确后，将lju6启动子连接至携带β-葡萄糖苷酸酶(gus)基因的pbi121载体，成功构建4个lju6-pbi121融合表达载体，通过农杆菌瞬时转化法转化烟草叶片，并对叶片进行gus组织化学染及gus定量测定，结果均显示lju61-f1转录活性最高，本研究初步筛选出转录活性较高的金银花u6启动子，为金银花crispr/cas9基因组编辑技术的建立奠定了基础。
14.本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。
附图说明
15.图1：金银花不同lju6启动子驱动gus的融合表达载体构建。
16.图2：不同t-lju6表达载体的酶切鉴定，其中，m:2kb plus dna标准分子量；1:t-lju61-f1；2:t-lju61-f2；3:t-lju62-f1；4：t-lju62-f2；5:35s-pbi121酶切片段。
17.图3：trans5α感受态细胞中lju6-pbi121表达载体pcr检测，其中，m:2kb plus dna标准分子量；1:lju61-f1-pbi121；2:lju61-f2-pbi121；3:lju62-f1-pbi121；4:lju62-f2-pbi121。
18.图4：农杆菌lba4404感受态细胞中lju6-pbi121表达载体pcr检测，其中，m:2kb plus dna标准分子量；1:lju61-f1-pbi121；2:lju61-f2-pbi121；3:lju62-f1-pbi121；4:lju62-f2-pbi121。
19.图5：不同lju6启动子驱动gus在烟草叶片中的瞬时表达，其中，a:camv35s-pbi121阳性对照；b:lju61-f1:gus；c:lju61-f2:gus；d:农杆菌阴性对照；e:lju62-f1:gus；f:lju62-f2:gus。
20.图6：不同lju6启动子在烟草叶片中瞬时表达的gus酶活性。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域技术人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
22.下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
23.实验金银花u6启动子的研究
24.1.材料与方法
25.1.1试验材料
26.金银花、烟草栽培于山东中医药大学，经山东中医药大学蒲高斌教授鉴定为金银花lonicera japonica、烟草nicotiana tabacum。
27.试验所用pbi121载体由山东中医药大学药学院实验室保存；植物dna提取试剂盒和5mintm ta/blunt-zero cloning kit(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)；通用型dna纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒和dna分子量makerdl2000(天根生化科技(北京)有限公司)；t4 dna连接酶(neb北京有限公司)；trans 5αchemically competent cell(全式金生物)；限制性内切酶hindⅲ和bamhⅰ(赛默飞世尔科技)；lba4404 chemically competent cell(上海唯地生物技术有限公司)；纤维素酶r-10、离析酶r-10、x-gluc、10
×
pbs缓冲液(北京索莱宝科技有限公司)；引物由铂尚生物技术(上海)有限公司负责合成。
28.1.2方法
29.1.2.1金银花u6启动子的克隆
30.取金银花叶片，采用植物基因组dna提取试剂盒提取金银花的dna，利用设计的u6启动子引物(如表1所示，引物一列代表某个启动子的引物)，进行pcr扩增。pcr反应程序为：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min，32个循环；72℃5min；4℃保存。反应体系为ddh2o 11μl、2
×
m5 hiper plus taq hifi 10μl、dna模板1μl、上下游引物各0.5μl，共20μl体系。
31.1％琼脂糖凝胶电泳进行检测，切胶回收获得目的dna片段，分别为lju61-f1、lju61-f2、lju62-f1、lju62-f2。将启动子片段与ta/blunt-zero cloning kit连接，转化trans5α感受态细胞后进行测序，测序结果经dnaman进行序列比对分析，正确的质粒分别命名为t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2。
32.表1本研究使用引物序列
[0033][0034]
1.2.2启动子顺式作用元件分析
[0035]
将测序结果提交启动子元件在线分析网站plantcare，对金银花u6启动子中的顺式作用元件进行分析。
[0036]
1.2.3融合表达载体的构建
[0037]
分别用hindⅲ和bamhⅰ对t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2质粒及植物表达载体pbi121进行双酶切，切胶回收目的片段，将克隆的得到lju6启动子取代pbi121载体中的camv35s启动子，并与gus基因连接，从而构建pbi121融合表达载体。将融合表达载体转化trans5α感受态细胞，其一次活化菌液经pcr验证正确后，二次活化菌液提取质粒。质粒转入农杆菌感受态lba4404，28℃倒置培养2d，挑取单克隆于lb液体培养基(kan50μg.ml-1
，rif 20μg.ml-1
)进行一次活化，对一次活化菌液进行pcr验证，验证成功后，
保存一次活化菌液于-80℃备用。
[0038]
1.2.4不同启动子在烟草叶片中的瞬时表达分析
[0039]
gus组织化学染法参考蒲艳等的方法(蒲艳,刘超,李继洋,等.番茄u6启动子的克隆及crispr/cas9基因编辑体系的建立[j].中国农业科学,2018,51:315-326.)，以不加入目的基因的农杆菌作为阴性对照，camv35s-pbi121作为阳性对照。将构建的4个lju6-pbi121融合表达载体以及阳性对照camv35s-pbi121、阴性对照纯农杆菌的一次活化农杆菌菌液划线培养，挑取单克隆于lb液体培养基中(kan 50μg.ml-1
，rif 20μg.ml-1
)，28℃，200r.min-1
进行活化，培养至菌液od
600
＝0.6～0.8；分别吸取不同体积的活化菌液接种到5ml lb培养基(含50μg.ml-1
kan和20μg.ml-1
rif)中，使每个农杆菌起始菌液od值相同，再次28℃，200r.min-1
摇菌至所有菌液的od
600
＝1.2时，12 000
×
g离心5min收集菌体，弃上清液，重悬于buffer(50mmol.l-1
mgcl2、200mmol.l-1
mes、20mmol.l-1
乙酰丁香酮)至1ml，室温放置3h后分别注射到生长2～3周的烟草叶片中，注射完成后做好标记，进行过夜暗培养。用剪刀分别剪下暗培养过夜后的烟草叶片，浸泡在100μlgus染液中(20mmol.l-1
x-gluc，50mmol.l-1
pbs缓冲液)，抽真空30min。每种农杆菌转化进行技术重复3次，生物学重复3次。将抽完真空后的烟草叶片置于37℃，180r.min-1
振荡染6～7h，吸尽gus染液。最后加入300μl95％乙醇进行脱处理，脱时，每3～4h更换一次脱液，直至叶片绿褪去，观察脱后的叶片并拍照。
[0040]
gus定量测定参考张利娜等的方法(张利娜,刘瑜,林拥军.水稻cdpk12基因启动子的表达模式及其逆境应答元件分析[j].农业生物技术学报,2015,23(10):1261-1272.)，采用jeff erson(jefferson ra,kavanagh ta,bevan mw.gus fusions：beta-glucuronidase as asensitive and versatile gene fusion marker in higher plants[j].the embo journ al,1987,6(13):3901-3907.)报道的方法测定gus蛋白活性，结以所生成的4-甲基伞形酮(4-methylumbel-liferone,4-mu)的量与总蛋白含量和时间的比值(pmol.mg-1
.min-1
)表示。
[0041]
根据染情况及定量测定结果筛选出高效转录的u6启动子。
[0042]
2.结果与分析
[0043]
2.1金银花启动子片段鉴定
[0044]
从金银花基因组dna中成功克隆出lju61-f1、lju61-f2、lju62-f1、lju62-f2共4个lju6启动子片段，长度分别为336bp、708bp、359bp、602bp，核苷酸序列如seq id no.1～4所示。将启动子片段分别与ta/blunt-zero cloning kit连接，转化trans5α感受态细胞后测序，测序结果显示序列正确。
[0045]
2.2启动子序列分析
[0046]
通过序列分析(表2和表3)，可以发现4个启动子中均含有tata框以及caat框等典型的启动子顺式元件，lju61中还存在at富集区，脱落酸反应顺式作用元件abre(acgtg)、防御和应激反应顺式作用元件tc-rich repeats(attctctaac)、生长素反应元件auxre(tgtctcaataag)等，此外还含有多个光反应或光反应相关的元件ace(gacacgtatg)、g-box(tacgtg)、box ii(tggtaataa)、gt1-motif(ggttaa)等，与lju61相比，lju62中含有顺式作用元件种类较少，主要为光反应或光反应相关的元件4cl-cma1b(attccgataaact)、box 4(attaat)及ga-motif(atagataa)等，此外还含有参与逆境反应元件ccaat-box。
[0047]
表2 lju61启动子顺式作用元件分析
[0048][0049]
表3 lju62启动子顺式作用元件分析
[0050]
[0051][0052]
2.3融合表达载体的构建
[0053]
金银花不同启动子驱动gus基因的融合表达载体示意图如图1所示。hindⅲ和bamhⅰ双酶切t-lju61-f1、t-lju61-f2、t-lju62-f1、t-lju62-f2质粒和植物表达载体pbi121，1％琼脂糖凝胶电泳得到目的片段，其大小与预测片段大小相符(图2)；切胶回收不同lju6片段及切除camv35s启动子后pbi121载体大片段，将目的片段用t4连接酶连接后转化trans5α感受态细胞，利用其一次活化菌液进行pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳显示可扩增出启动子条带且大小与预期相符(图3)，表明融合表达载体构建成功，可进行下一步实验；菌液二次活化后提取质粒，将融合表达载体质粒转化农杆菌感受态lba4404，对其一次活化菌液进行pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳显示可扩增出目的条带且大小与预期相符(图4)，表明转化成功。
[0054]
2.4不同启动子转录活性分析
[0055]
将构建好的融合表达载体lju61-f1-pbi121、lju61-f2-pbi121、lju62-f1-pbi121、lju62-f2-pbi121、阳性对照camv35s-pbi121、阴性对照纯农杆菌通过农杆菌注射法瞬时转化烟草叶片，通过gus组织化学染脱后可发现，阴性对照及lju62-f1启动子处理叶片未观察到蓝，camv35s、lju61-f1、lju61-f2、lju62-f2启动子处理的烟草叶片可观察到蓝，说明克隆的4个lju6启动子中有3个能驱动报告基因gus的表达，且转录活性各不相同(图5)。
[0056]
为进一步精确分析不同启动子驱动gus的表达差异，对gus酶活性进行定量测定，结果如图6所示，结果显示阴性对照以及lju62-f1启动子处理的烟草叶片几乎检测不到酶活性，lju61-f1与camv35s活性相差不大，且活性较高，为lju61-f2的1.5倍，lju62-f2活性最低，这与gus染结果一致。
[0057]
3.讨论
[0058]
本研究首次克隆得到金银花lju6启动子，并对其进行顺式作用元件进行分析，现有研究表明启动子的结构包括顺式作用元件的排列位置及距离影响其与rna聚合酶的识别、结合，从而影响基因表达水平；同时，顺式作用元件caat框对于基因的转录具有较强的激活作用，在tata框上游含有caat框将使基因的表达量大幅度增加。在本研究中发现相较于lju62，lju61中含有更多的caat框，这可能是其转录活性高于lju62的一个原因。
[0059]
本研究利用gus作为报告基因，通过瞬时转化烟草叶片后染颜深浅以及定量测定结果判断启动子活性，gus组织化学染结果及定量测定结果显示，克隆的4个u6启动子在烟草叶片中的转录效率各不相同，相对于lju61-f2，lju61-f1的转录活性更高，lju62-f2转录活性低于lju61-f2。lju62-f1在gus染中未显蓝且几乎检测不到酶活性，观察序列发现lju62-f1中除少数tata以及光响应序列无其他结构，其是否因为缺少某些元件而丧失了转录活性仍有待进一步研究。
[0060]
给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的
实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。
技术特征：
1.金银花u6启动子，其核苷酸序列如seq id no.1所示。2.金银花u6启动子，其核苷酸序列如seq id no.2所示。3.金银花u6启动子，其核苷酸序列如seq id no.4所示。4.权利要求1～3中任一项所述的金银花u6启动子在金银花基因编辑中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：专门应用于金银花crispr/cas9编辑系统，用于驱动sgrna的表达。6.一种基因编辑载体，其特征在于：含有如权利要求1～3中任一项所述的金银花u6启动子。7.权利要求6所述的基因编辑载体在金银花基因编辑中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：专门应用于金银花crispr/cas9编辑系统，用于驱动sgrna的表达。9.一种pbi121融合表达载体，其特征在于：由植物表达载体pbi121与gus基因连接而成，植物表达载体pbi121的启动子为权利要求1～3中任一项所述的金银花u6启动子。
技术总结
本发明公开了金银花U6启动子，其核苷酸序列如SEQ ID O.1、SEQ ID O.2或SEQ ID O.4所示。本发明从金银花基因组中克隆到了4个LjU6启动子，将LjU6启动子连接至携带β-葡萄糖苷酸酶基因的pBI121载体，通过农杆菌瞬时转化法转化烟草叶片，并对叶片进行GUS组织化学染，染结果显示其中3个启动子具有转录活性，其中LjU61-F1转录活性最高且长度最短。本发明的金银花U6启动子适用于金银花CRISPR/Cas9编辑系统，可用于启动sgRA引导序列的表达，本发明为金银花CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立奠定了基础。术的建立奠定了基础。术的建立奠定了基础。
