一种体外诱导IPS细胞分化生成人软骨组织的方法与流程
一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法
技术领域
1.本发明涉及软骨细胞分化技术领域，具体为一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法。
背景技术：
2.软骨组织是一种富含蛋白多糖、胶原和透明质酸等物质的组织，由软骨细胞和软骨基质构成，在体内主要起支撑和减少摩擦的作用。但软骨组织缺乏血管，因此，软骨组织一旦受到损伤便很难修复，即便是微小的软骨组织损伤，也很难自然修复。目前，临床上用于软骨组织损伤修复的方法主要有软骨和软骨下骨去除、微骨折和软骨下骨钻孔、自体骨软骨移植和同种异体骨软骨移植、软骨或骨膜移植等。这些方法在一定程度上均能够对软骨组织损伤进行修复，但均存在明显缺点，如微骨折和软骨下骨钻孔方法能够使干细胞到达损伤部位，但因局部环境和机械应力不同，干细胞很难向软骨细胞分化；自体骨软骨移植安全、有效，但会给患者带来新的创伤；异体骨软骨移植避免了自体骨软骨移植给患者带来的新的创伤，但存在供体来源限制、免疫排斥反应和疾病传播风险等。
3.诱导多能干细胞是指通过一定的方法，将某些特定的转录因子转入到已分化的成体细胞，使其重编程为形态和功能上类似于胚胎干细胞的一类细胞。由于其避开了既往胚胎干细胞研究在细胞来源和伦理道德方面等问题，从一诞生起就迅速引发了科学界的强烈兴趣，并在再生医学、疾病建模及新型药物筛选方面展现出极大的优势。软骨由于其组织结构的特异性，缺乏神经血管分布，出现局部破坏和缺损后难以自行修复，常造成不同程度的关节功能障碍乃至整个关节功能的丧失。
4.目前研究发现采用ips细胞诱导培养软骨细胞是一种非常具有潜力的技术，ips细胞的出现，为软骨损伤和缺损的提供了新的途径。但是目前的利用ips细胞分离培养人软骨组织的条件十分复杂，且细胞诱导的形成效率低。
技术实现要素：
5.针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种可以有效提高分化效率的体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法。
6.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，具体包括下列步骤：
7.(1)取ips细胞接种到盛有dmem培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；
8.(2)将第一代细胞置于培养基a上培养，培养温度为37℃，环境空气为5％co2，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞；
9.(3)将第二代细胞按照5
×
104～9
×
104个细胞/cm2的个数接种到培养基b上进行培养，培养基b诱导第二代细胞生产细胞微团；
10.(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基c上进行诱导培
养，诱导培养时间为20～23天即可分化生成软骨组织，每隔3天更换一次培养基c。
11.进一步地，所述培养基a以无血清培养基为基础培养基，还包括：质量浓度为8～15％的胎牛血清，100～120u/ml的氨苄青霉素浓度、50～100u/ml的链霉素双抗，8～13μg/l的成纤维细胞生长因子，5～8mg/l的阿米卡星。
12.进一步地，所述培养基b以高糖dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为6～12％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰岛素、65～85μmol/ml的地塞米松、6.8～9.2mg/ml的转铁蛋白、20～35mg/ml的抗坏血酸和0.8～1.2μmol/mlbmp7。
13.进一步地，所述培养基c以dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为5～10％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰岛素、95～110μmol/ml的地塞米松、4.2～6.6mg/ml的转铁蛋白、20～35mg/ml抗坏血酸、10～50ng/ml转化生长因子β1、10～35ng/ml的tgf-β剂、20～50mg/ml的1，25-二羟基维生素d3和20～50mg/ml的atst-trin蛋白和5～10ng/ml的dapt。
14.采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，通过培养基a、培养基b和培养基c的定向诱导，有效的提高了ips细胞定向分化效率，从而增高了软骨组织的形成率。
具体实施方式
15.下面将结合本发明的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
16.实施例1
17.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，具体包括下列步骤：
18.(1)取ips细胞接种到盛有dmem培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；
19.(2)将第一代细胞置于培养基a上培养，培养温度为37℃，环境空气为5％co2，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞，所述培养基a以无血清培养基为基础培养基，还包括：质量浓度为11.5％的胎牛血清，110u/ml的氨苄青霉素浓度、75u/ml的链霉素双抗，10.5μg/l的成纤维细胞生长因子，6.5mg/l的阿米卡星；
20.(3)将第二代细胞按照5
×
104～9
×
104个细胞/cm2的个数接种到培养基b上进行培养，培养基b诱导第二代细胞生产细胞微团，所述培养基b以高糖dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为9％的胎牛血清、3.75mg/ml的胰岛素、75μmol/ml的地塞米松、8mg/ml的转铁蛋白、27.5mg/ml的抗坏血酸和1.0μmol/mlbmp7；
21.(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基c上进行诱导培养，诱导培养时间为20～23天即可分化生成软骨组织，每隔3天更换一次培养基c，所述培养基c以dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为7.5％的胎牛血清、3.75mg/ml的胰岛素、102.5μmol/ml的地塞米松、5.4mg/ml的转铁蛋白、27.5mg/ml抗坏血酸、30ng/ml转化生长因子β1、22.5ng/ml的tgf-β剂、35mg/ml的1，25-二羟基维生素d3和35mg/ml的atst-trin蛋白
和7.5ng/ml的dapt。
22.实施例2
23.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，具体包括下列步骤：
24.(1)取ips细胞接种到盛有dmem培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；
25.(2)将第一代细胞置于培养基a上培养，培养温度为37℃，环境空气为5％co2，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞，所述培养基a以无血清培养基为基础培养基，还包括：质量浓度为8％的胎牛血清，100u/ml的氨苄青霉素浓度、50u/ml的链霉素双抗，8μg/l的成纤维细胞生长因子，5mg/l的阿米卡星；
26.(3)将第二代细胞按照5
×
104～9
×
104个细胞/cm2的个数接种到培养基b上进行培养，培养基b诱导第二代细胞生产细胞微团，所述培养基b以高糖dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为6％的胎牛血清、3.5mg/ml的胰岛素、65μmol/ml的地塞米松、6.8mg/ml的转铁蛋白、20mg/ml的抗坏血酸和0.8μmol/mlbmp7；
27.(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基c上进行诱导培养，诱导培养时间为20～23天即可分化生成软骨组织，每隔3天更换一次培养基c，所述培养基c以dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为5％的胎牛血清、3.5mg/ml的胰岛素、95μmol/ml的地塞米松、4.2mg/ml的转铁蛋白、20mg/ml抗坏血酸、10ng/ml转化生长因子β1、10ng/ml的tgf-β剂、20mg/ml的1，25-二羟基维生素d3和20mg/ml的atst-trin蛋白和5ng/ml的dapt。
28.实施例3
29.本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，具体包括下列步骤：
30.(1)取ips细胞接种到盛有dmem培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；
31.(2)将第一代细胞置于培养基a上培养，培养温度为37℃，环境空气为5％co2，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞，所述培养基a以无血清培养基为基础培养基，还包括：质量浓度为15％的胎牛血清，120u/ml的氨苄青霉素浓度、100u/ml的链霉素双抗，13μg/l的成纤维细胞生长因子，8mg/l的阿米卡星；
32.(3)将第二代细胞按照5
×
104～9
×
104个细胞/cm2的个数接种到培养基b上进行培养，培养基b诱导第二代细胞生产细胞微团，所述培养基b以高糖dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为12％的胎牛血清、4mg/ml的胰岛素、85μmol/ml的地塞米松、9.2mg/ml的转铁蛋白、35mg/ml的抗坏血酸和1.2μmol/mlbmp7；
33.(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基c上进行诱导培养，诱导培养时间为20～23天即可分化生成软骨组织，每隔3天更换一次培养基c，所述培养基c以dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为10％的胎牛血清、4mg/ml的胰岛素、110μmol/ml的地塞米松、6.6mg/ml的转铁蛋白、35mg/ml抗坏血酸、50ng/ml转化生长因子β1、35ng/ml的tgf-β剂、50mg/ml的1，25-二羟基维生素d3和50mg/ml的atst-trin蛋白和10ng/ml的dapt。
34.要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体
或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物料或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物料或者设备所固有的要素。
35.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
技术特征：
1.一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，其特征在于，具体包括下列步骤：(1)取ips细胞接种到盛有dmem培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；(2)将第一代细胞置于培养基a上培养，培养温度为37℃，环境空气为5％co2，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞；(3)将第二代细胞按照5
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104～9
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104个细胞/cm2的个数接种到培养基b上进行培养，培养基b诱导第二代细胞生产细胞微团；(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基c上进行诱导培养，诱导培养时间为20～23天即可分化生成软骨组织，每隔3天更换一次培养基c。2.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，其特征在于，所述培养基a以无血清培养基为基础培养基，还包括：质量浓度为8～15％的胎牛血清，100～120u/ml的氨苄青霉素浓度、50～100u/ml的链霉素双抗，8～13μg/l的成纤维细胞生长因子，5～8mg/l的阿米卡星。3.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，其特征在于，所述培养基b以高糖dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为6～12％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰岛素、65～85μmol/ml的地塞米松、6.8～9.2mg/ml的转铁蛋白、20～35mg/ml的抗坏血酸和0.8～1.2μmol/mlbmp7。4.根据权利要求1所述的一种体外诱导ips细胞分化生成人软骨组织的方法，其特征在于，所述培养基c以dmem为基础培养基，还包括：质量浓度为5～10％的胎牛血清、3.5～4mg/ml的胰岛素、95～110μmol/ml的地塞米松、4.2～6.6mg/ml的转铁蛋白、20～35mg/ml抗坏血酸、10～50ng/ml转化生长因子β1、10～35ng/ml的tgf-β剂、20～50mg/ml的1，25-二羟基维生素d3和20～50mg/ml的atst-trin蛋白和5～10ng/ml的dapt。
技术总结
本发明公开了一种体外诱导IPS细胞分化生成人软骨组织的方法，具体包括下列步骤：(1)取IPS细胞接种到盛有DMEM培养液的细胞培养瓶中贴壁培养1天，待细胞贴壁后用胰蛋白酶消化离心，得到第一代细胞；(2)将第一代细胞置于培养基A上培养，待细胞长至80％～90％融合时，用胰蛋白酶消化处理，然后离心分离，得到第二代细胞；(3)将第二代细胞接种到培养基B上进行培养，培养基B诱导第二代细胞生产细胞微团；(4)将细胞微团转移到离心管中，离心，弃上清，之后接种到培养基C上进行诱导培养。本发明涉及软骨细胞分化技术领域，具体提供了一种可以有效提高分化效率的体外诱导IPS细胞分化生成人软骨组织的方法。骨组织的方法。
