一种富硒生物絮团的制备方法
1.本发明涉及生物技术，特别涉及一种富硒生物絮团的制备方法。
背景技术：
2.生物絮团技术最初由法国海洋开发研究所于20世纪70年代初提出，如今，在水产养殖模式中生物絮团技术得到了广泛应用。生物絮团技术(biofloc technology，bft)被誉是应对当前水产养殖业所面临养殖水污染问题的有效替代技术，甚至做到无水交换。生物絮团以丝状细菌、菌胶团细菌为核心，通过微生物胞外聚合物(eps)将水体中悬浮的细菌、藻类、原生动植物、有机碎屑等相互絮凝，形成的絮状的悬浮物，生物絮团的大小形态各异，一般絮体的大小在130-200μm之间。
3.bft运行的原理是通过外加碳源，调控c/n＞15，促使水体异养细菌同化c、n源构建细菌细胞，从而去除水体氨氮、亚硝氮，有助于在养殖中减少水量交换，并且生物絮团可供养殖对象摄食，能够代替部分饵料，减少残饵、粪便对养殖水体的污染，同时节约养殖成本、提高养殖收益。
4.常见的生物絮团主要由菌类、藻类相互絮凝组成，在实际生产过程中，生物絮团的培育始终难以形成稳定的生态系统，并且由于水产动物的发育过程中对各种微量元素的需求在不断的变化，所以养殖过程中的实际操作很难确定。
5.纳米硒是纳米级的单质硒，具有较高的生物安全性、抗氧化活性和抑菌性能，利用微生物合成的纳米硒，具有绿安全、环保无污染、产量高、成本低、低毒性等多种优势。硒也被应用于动物饲料添加中，而且硒元素具有保护肠道、肝脏的作用，而肝脏和肠道是正是水产动物的重要器官。水产动物摄入硒元素同时可以抵抗水体中有害菌体，增强其自身免疫力，从而提高存活率，增加养殖产量。
技术实现要素：
6.发明目的：本发明的目的在于提供一种制备富硒生物絮团的方法。
7.技术方案：富硒生物絮团的制备方法，包括以下步骤
8.1)培养富硒微生物培养物：
9.(1)所述富硒微生物培养物通过具有纳米硒合成功能的微生物还原亚硒酸钠得到，本专利采用副蕈状芽孢杆菌1805(保藏号为cgmcc no.24522)；
10.(2)副蕈状芽孢杆菌1805菌株将亚硒酸钠充分还原成纳米硒单质；
11.(3)该菌株在24h内将2mmol/l的亚硒酸钠充分还原成纳米硒单质。
12.2)培养普通小球藻，具体方法如下：
13.(1)将多次划线纯化后的普通小球藻接入已灭菌的bg11液体培养基中，于温度25-30℃，光照强度6500-9000lux，光照培养箱中培养2-5d使其达到对数生长期；
14.(2)普通小球藻能在144h完全去除浓度为10mg/l的亚硝态氮和浓度为6mg/l的氨氮。
15.3)培养光合细菌，具体方法如下：
16.(1)将冻存的沼泽红假单胞菌菌种活化，划线于一级种子培养基中，活化后再将其接种于液体种子培养基中培养(种子培养基121℃灭菌)。
17.(2)沼泽红假单胞菌可在3d内去除81.88％的浓度为29.69mmol/l的氨氮，完全去除浓度为19.12mmol/l的硝氮，完全去除浓度为5mmol/l的亚硝氮。
18.4)培养枯草芽孢杆菌，具体方法如下：
19.(1)将分离纯化得到的枯草芽孢杆菌置于lb液体种子培养基中培养，调ph、灭菌。配置固体培养基，则灭菌前加入琼脂。
20.5)采用向水体中投入培养好的富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌的方式，并且水体中设置曝气装置进行曝气。所述生物絮团中各组分的重量比例如下：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合细菌30份-50份、枯草芽孢杆菌20份-50份。
21.优选以葡萄糖和红糖的混合物为外源碳源、氯化铵为氮源，对养殖水体的c/n比控制在(15-20)∶1。采用稀释后的红糖对养殖水体的c/n进行调节控制。
22.溶解氧(do)维持在3.0-5.0mg/l不间断持续供氧气，同时对水体形成搅拌作用。水体曝气是连续操作3天，其目的是为了提供溶解氧，以及通过曝气对水体形成搅拌作用，使得富硒微生物培养物及菌、藻在搅拌状态下絮凝混合，从而形成絮团。
23.纳米硒是纳米级的单质硒，具有较高的生物安全性、抗氧化活性和抑菌性能，利用微生物合成的纳米硒，具有绿安全、环保无污染、产量高、成本低、低毒性等多种优势，硒也被应用于动物饲料添加中，水产动物摄入硒元素可以抵抗水体中有害菌体，增强其自身免疫力，从而提高存活率，增加养殖产量。
24.光合细菌能够净化养殖环境，促进水生植物生长，在水产养殖中，拥有广阔的发展前景。光合细菌可以在厌氧光照或者好氧黑暗的情况下，利用有机物、硫化物、氨氮等进行光合作用。光合细菌体内富含生物素、蛋白质、多种维生素、辅酶q、类胡萝卜素等生理活性物质。并且光合细菌具有改善养殖水环境、天然饵料添加剂、预防水产动物疾病、降解食品生产有机污水和生物制氢等特性。
25.枯草芽孢杆菌可以改善水质，该菌能快速定植于水体中，通过位点竞争或营养竞争排斥有害病菌的生长繁殖，形成优势菌，以达到改善水质的目的。并且该菌具有极强的分泌功能，能够产生多种胞外酶，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等活性物质，在动物肠道酸性条件下具有很好的稳定性，能够用促进饲料中营养素的降解，提高饲料利用率。
26.微藻中丰富而均衡的营养成分(蛋白、脂肪酸、碳水化合物)和各种生物活性物质(pufa、维生素、甾醇)，可满足水产动物在幼苗期生长发育的营养需求。微藻对富营养水体的氮吸收效率极高，通过吸收固定作用将有害物质转化藻类的营养物质，高效降低水体中的氨氮、亚硝态氮等有害氮素，增加水体溶解氧，为水生动物的健康生长提供优质的水环境。
27.有益效果：本发明与现有技术相比，具有如下优势：
28.1、本发明制备的富硒生物絮团可应用于水产养殖中，尤其是南美白对虾养殖中，有利于净化养殖水体水质、增强养殖对象免疫力。
29.2、本发明以持续微量添加纳米硒及菌类、藻类，以稀释后的红糖水控制水体c/n比
为15-20∶1，并且对水体中持续曝气供氧，有利于生物絮团的快速形成。
30.3、本发明能够在较短的时间内形成生物絮团，通过合理调控，控制生物絮团的稳定，降低水体中氨氮和亚硝酸盐等有害物质。
31.4、本发明创新点在于在常见生物絮团的基础上增添了纳米硒，以满足面对水产动物的发育过程中对各种微量元素的需求不断变化，提供了更多的可能性。同时可以抑制养殖水体有害菌对养殖对象的侵害，保护养殖对象的肝脏和肠道等器官，可以有效提升养殖对象的成活率。
32.5、本发明的富硒的生物絮团，在菌藻絮凝的基础上添加了纳米硒和生物硒，以满足水产动物发育过程中对各种微量元素的需求，提供了更充足的营养。
33.6、本发明的富硒的生物絮团，可以有效去除养殖水体中氨氮和亚硝氮等有害物质，同时抑制水体有害菌，代替部分饵料，增强和提高养殖动物的免疫力及存活率。
附图说明
34.图1是单质硒质量的标准曲线图；
35.图2是6株高效合成菌株对亚硒酸钠的还原效率结果图；
36.图3是副蕈状芽孢杆菌1805革兰氏染结果图；
37.图4是扫描电镜表征副蕈状芽孢杆菌1805合成的红纳米硒；
38.图5是副蕈状芽孢杆菌1805扫描电镜eds成分分析图；
39.图6是模拟污水中普通小球藻对不同浓度nh
4+-n的去除率(r)及藻液浓度(od680)变化，普通小球藻对nh
4+-n的去除率(a)，藻液生物量变化情况(b)；图7是模拟污水中普通小球藻对不同浓度no
2-‑
n的去除率(r)及藻液浓度(od680)变化，普通小球藻对亚硝态氮的去除率(a)，藻液生物量变化情况(b)。
具体实施方式
40.以下实施方式中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
41.实施例1：
42.富硒微生物培养物的制备及分析实验
43.一、材料与方法
44.1.菌株：从淮安的洪泽湖养殖塘采集肥沃的底泥中分离纯化得到一株高效合成纳米硒的菌株。
45.2.培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g，以上培养基所用试剂均为分析纯(ar)。用5mol/lnaoh调ph至7.0、121℃、20min高压蒸汽灭菌。配置固体培养基，则灭菌前加入15g琼脂。
46.3.na2seo3还原力测定
47.具体步骤为：单质硒标准曲线的绘制：精准称取不同质量单质硒粉放入试管中，然后各加入九水硫化钠溶液，震荡使其充分溶解，以未加硒粉的九水硫化钠溶液做对照，在分光光度计500nm波长下测其吸光度值。重复3组，绘制标曲，过标准曲线计算还原单质硒的含量。
48.4.菌株的鉴定
49.通过观察菌落的大小、颜、干湿情况、高度、形态、透明程度、边缘形态、气味等方面进行初步鉴定菌种。
50.菌的革兰氏染按照phygene life sciences公司购买染试剂盒操作，细胞形态观察采用1000
×
相差显微镜观察，按照伯杰氏手册进行操作。
51.5.副蕈状芽孢杆菌1805合成纳米硒的形貌表征分析
52.(1)纳米颗粒粒径分析
53.(2)扫描电镜sem-eds联用的测定
54.二、实验结果
55.1.na2seo3还原力的测定
56.通过na2s显法测定合成的单质硒质量标准曲线。如图1所示，硒单质在500nm波长处吸光值较好，呈现出较高的相关性。通过此还原率标曲，可以测量其具体还原能力的大小与强弱。
57.通过测量6株高效合成纳米硒的最优菌株还原能力，以还原能力最高的菌株为后续研究对象。如图2所示，副蕈状芽孢杆菌1805在24h时就可将2mmol/l的亚硒酸钠中15.92mg的硒单质充分还原，纳米硒的合成效率高达65.7％。
58.2.菌株副蕈状芽孢杆菌1805的鉴定
59.经革兰氏染、显微镜观察发现，菌株1805的细胞呈直杆状，常以成对或链状排列，有芽孢，无荚膜，如图3。
60.3.副蕈状芽孢杆菌1805合成纳米硒的形貌表征
61.本研究采用sem-eds联用的方法对副蕈状芽孢杆菌1805合成的红纳米硒进行表征。如图4所示，该纳米硒呈球状，粒径颗粒均匀，成分单一。eds结果表明，该纳米硒的组成分别为：硒的含量73.7％、氯的含量是14.7％、钠为8.8％，钽金属大致为2.8％如图5。
62.实施例2：
63.普通小球藻的培养及去除亚硝态氮和氨氮能力实验
64.一、材料与方法
65.1.使用藻种为普通小球藻。
66.2.培养基：改良后bg11培养基，磷酸二氢钾40mg、硫酸镁75mg、氯化钙36mg、碳酸钠20mg、柠檬酸6mg、微量元素1mg、去离子水1000ml。ph值为7.1，试剂纯度均为分析纯(ar)。
67.3.藻种制备
68.将多次划线纯化后的普通小球藻接入已灭菌的bg11液体培养基中，于25-30℃，光照强度6500-9000lux，光照培养箱中培养2-5d，达到对数生长期后，再转到另一瓶灭菌的bg11液体培养基中，培养至对数生长期，如此反复转接培养2-5次，使微藻处于对数生长期。取对数生长期的藻液，转速2000-4000r/min的离心机中离心，弃掉上清液，用改良液体bg11反复洗涤3次，消除原培养基中氮元素的影响。
69.4.实验方法
70.按照2-10％的接种量，使水体初始藻液od
680
值为0.08
±
0.01，总体积为100ml，置于25-30℃，光照强度6500-9000lux，光照培养箱中培养。将培养基中硝酸盐分别换为氯化铵和亚硝酸钠，精确称量氯化铵、亚硝酸钠使用去离子水定容，使nh
4+-n和no
2-‑
n的质量浓度分别为2、4、6、8、10mg/l，每个质量浓度设置3个平行，分别采用生物比浊法、纳氏试剂分
光光度法、α-萘胺分光光度法检测藻细胞密度与nh
4+-n和no
2-‑
n的质量浓度，并记录数据。
71.二、实验结果
72.1.普通小球藻对氨氮的去除效果
73.在5个nh
4+-n质量浓度去除实验中，普通小球藻处理不同浓度nh
4+-n模拟污水168h，nh
4+-n的去除率(r)和藻液生物量(od
680
)变化如图6所示。
74.普通小球藻处理nh
4+-n模拟污水，当实验进行48h的nh
4+-n去除率迅速增大，当实验进行至96h时，nh
4+-n质量浓度为2mg/l组的去除率达到100％。随着实验的继续，分别在120h和144h处nh
4+-n质量浓度4mg/l和6mg/l组的去除率均达到100％，说明普通小球藻能在144h完全去除6mg/l的nh
4+-n，并且8mg/l和10mg/l组的去除率分别为75.6％和56.99％(图6a)。
75.当实验进行至48h时，普通小球藻开始迅速扩增，随着反应时间的增加，普通小球藻保持稳定持续的增长，nh
4+-n质量浓度最大时，普通小球藻的od
680
值也最大，nh
4+-n质量浓度为4mg/l组的od
680
值仅次于最大值。而其他nh
4+-n浓度组次的od
680
值差异不大(图6b)。结果表明：普通小球藻能够在144h内完全去除6mg/l的nh
4+-n，并且8mg/l和10mg/l组的去除率分别达到75.6％和56.99％，去除效率最高。
76.2.普通小球藻对亚硝态氮的去除效果
77.在5个no
2-‑
n质量浓度去除实验中，普通小球藻处理不同浓度no
2-‑
n模拟污水144h，no
2-‑
n的去除率(r)和藻液生物量(od
6g0
)变化如图7所示。
78.普通小球藻处理no
2-‑
n模拟污水，当实验进行48h，no
2-‑
n去除率迅速增大，当实验进行至96h时，no
2-‑
n质量浓度为2mg/l和4mg/l组的去除率达到100％。随着实验的继续，在120h处no
2-‑
n质量浓度6mg/l和8mg/l组的去除率均达到100％，当实验进行至144h，no
2-‑
n质量浓度为10mg/l组的去除率达到100％，说明普通小球藻能在144h完全去除10mg/l的no
2-‑
n(图7a)。
79.当实验进行至72h时，普通小球藻开始迅速扩增，随着反应时间的增加，普通小球藻保持稳定持续的增长，no
2-‑
n质量浓度最大时，普通小球藻的od
680
值也最大，且普通小球藻的od
680
值随着no
2-‑
n质量浓度的递增而递增(图7b)。结果表明：普通小球藻能够在120h内完全去除10mg/l的no
2-‑
n，去除效率最高。
80.实施例3：
81.光合细菌的培养实验
82.三、材料与方法
83.1.菌株：沼泽红假单胞菌。
84.2.培养基：乙酸钠2.46g、磷酸氢二钾0.9g、磷酸二氢钾0.6g、硫酸镁0.2g、氯化钙0.075g、硫酸铁0.018g、微量元素1ml、生长因子1ml、去离子水1000ml。
85.3.菌种制备
86.取沼泽红假单胞菌，该菌株具有在3d内去除81.88％的浓度为29.69mmol/l的氨氮，完全去除浓度为19.12mmol/l的硝氮，完全去除浓度为5mmol/l的亚硝氮的能力。在无菌操作台上，接种于培养基中，培养基上方加入无菌液体石蜡，置于26-35℃，2500-4000lx的光照培养箱中培养一周。
87.二、实验结果
88.1.观察发现培养基底部出现铁红培养物，然后取1ml红培养物转移到另一瓶液体培养基中，加入无菌液体石蜡，置于光照培养箱中培养，如此反复富集3-4次，得到颜深红的富集培养液。
89.2.取对数期菌液于温度4℃，转速5500-8000r/min的超低温离心机中离心，弃掉上清液，用改良无氮光合细菌培养基反复洗涤2-5次，消除原培养基中氮元素的影响，收集菌体制成菌悬液。
90.实施例4：
91.枯草芽孢杆菌培养
92.1.菌种：枯草芽孢杆菌。
93.2.菌种活化：将已保存的菌种转接至lb固体培养基中，37℃静止培养24h后待用。
94.3.培养基：胰蛋白胨10.0g、酵母提取物5.0g、氯化钠10.0g，以上培养基所用试剂均为分析纯(ar)。用5mol/lnaoh调ph至7.0、121℃、20min高压蒸汽灭菌。
95.4.种子液制备：挑取活化的菌株单菌落于含50ml种子培养基的250ml三角瓶中，150-250r/min，30-37℃摇床振荡16-18h后待用。
96.5.菌液发酵：取一定量的种子液，按2％的比例接入含50ml发酵培养基的三角瓶中，然后置于30-37℃的摇床中，振荡培养24h，转速为200r/min。
97.实施例5：
98.富硒生物絮团的制备
99.1.将实施例1、2、3、4中所获得的富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌按照质量比例分别为10％、20％、30％和40％关系，投入充分曝气的水体中，并进行持续曝气。
100.2.以葡萄糖和红糖的混合物为外源碳源、氯化铵为氮源，对养殖水体的c/n比控制在(15-20)∶1。采用稀释后的红糖对养殖水体的c/n进行调节控制。
101.3.水体ph值控制在6.5-8.5之间，温度：20-25℃。
102.4.溶解氧(do)维持在3.0-5.0mg/l不间断持续供氧气，同时对水体形成搅拌作用。水体曝气是连续操作3天，其目的是为了提供溶解氧，以及通过曝气对水体形成搅拌作用，使得富硒微生物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌在搅拌状态下絮凝混合，从而形成絮团。
103.实施例6：
104.富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌质量比例分别为5％、20％、30％和45％，其余步骤同实施例5。
105.实施例7：
106.富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌质量比例分别为5％、10％、50％和35％，其余步骤同实施例5。
107.实施例8：
108.富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌质量比例分别为10％、30％、40％和20％，其余步骤同实施例5。
109.实施例9：
110.富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌质量比例分别为10％、
20％、20％和50％，其余步骤同实施例5。
111.针对上述实施例，分析检测研究了本发明所述方法制备的富硒生物絮团纳米硒含量及对氨氮和亚硝态氮的去除效果。结果表明，本发明所述方法制备出可以高效去除水体中氨氮和亚硝态氮的富硒生物絮团。
112.表1是实施例5、6、7、8、9制备的生物絮团中纳米硒的含量。结果表明本发明所述的方法成功制备出富硒生物絮团。上述实施例5、6、7、8、9制备的生物絮团中纳米硒的含量分别为650
±
12mg/kg、340
±
8mg/kg、351
±
5mg/kg、664
±
9mg/kg和653
±
17mg/kg。
113.表1实施例5、6、7、8、9制备生物絮团中纳米硒的含量(mg/kg)
[0114] 施例5施例6施例7施例8施例9纳米硒含量650
±
12340
±
8351
±
5664
±
9653
±
17
[0115]
表2是实施例5、6、7、8、9制备的生物絮团对氨氮及亚硝态氮的去除效果。结果表明本发明所述方法制备出的富硒生物絮团，能够高效去除模拟污水中氨氮和亚硝态氮。模拟污水中，初始氨氮和亚硝态氮浓度均为4mg/l，富硒生物絮团处理模拟污水3天后，对水体中的氨氮达到99％以上，对亚硝态氮去除率达到95％以上。
[0116]
表2实施例5、6、7、8、9制备生物絮团对氨氮和亚硝态氮去除率(％)
[0117]
技术特征：
1.一种富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)培养富硒微生物培养物副蕈状芽孢杆菌1805(保藏号为cgmcc no.24522)：富硒微生物培养物通过具有纳米硒合成功能的微生物还原亚硒酸钠得到，将富硒微生物培养物、普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌按一定比例投入水中，水体中设置曝气装置进行曝气；2)水体的c/n比控制在(15-20)∶1；3)水体ph值控制在6.5-8.5之间，温度：20-25℃；4)溶解氧(do)维持在3.0-5.0mg/l不间断持续供氧气，同时进行搅拌。2.根据权利要求1所述的富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，所述生物絮团中各组分的重量比例如下：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合细菌30份-50份、枯草芽孢杆菌20份-50份。3.根据权利要求1所述的富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，步骤1)中制备富硒微生物培养物的方法如下：1)土壤中分离纯化得到高效合成纳米硒的菌株，通过生理生化鉴定和16s rdna基因序列比对，将此高效合成纳米硒的菌株命名为：副蕈状芽孢杆菌1805(bacillus paramycoides 1805)；2)副蕈状芽孢杆菌1805最佳生长条件均为30℃、ph 6、200r/min，可在24h内将2mmol/l的亚硒酸钠充分合成单质纳米硒。4.根据权利要求1所述的富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，步骤2)中培养普通小球藻的方法如下：普通小球藻多次划线纯化后的微藻接入已灭菌的bg11液体培养基中，于温度25-30℃，光照强度6500-9000lux，光照培养箱中培养2-5d使其达到对数生长期。5.根据权利要求1所述的富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，步骤2)中培养光合细菌的方法如下：1)取沼泽红假单胞菌菌株，冻存；2)将冻存的菌种活化，划线于一级种子培养基中，活化后再将其接种于液体种子培养基中培养，即得。6.根据权利要求1所述的富硒生物絮团的制备方法，其特征在于，步骤2)中培养枯草芽孢杆菌的方法如下：1)将草芽孢杆菌菌种置于lb液体种子培养基中培养，调ph，灭菌，配置固体培养基，灭菌前加入琼脂；2)挑取活化的菌株单菌落于种子培养基中，摇床培养，制得种子液；3)将种子液接入发酵培养基中个，摇床培养。
技术总结
本发明公开一种富硒生物絮团的制备方法，将具有合成纳米硒功能的微生物在适宜的含亚硒酸盐培养基中培养，亚硒酸被充分还原成纳米硒后，将富硒微生物培养物与普通小球藻、光合细菌和枯草芽孢杆菌按照以下质量比例混合培养：富硒微生物5份-10份、普通小球藻10份-40份、光合细菌30份-50份、枯草芽孢杆菌20份-50份。经分析检测，本发明所述方法制备的生物絮团具有富硒特性，同时还具有去除水体中氨氮和亚硝态氮等有害物的净水功能。亚硝态氮等有害物的净水功能。亚硝态氮等有害物的净水功能。
