一种互穿网络结构交联透明质酸或其盐凝胶及其制备方法与流程
1.本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶及其制备方法。
背景技术：
2.透明质酸是一种天然粘多糖，由(1-β-4)d-葡糖醛酸和(1-β-3)n-乙酰基-d-氨基葡糖双糖单位重复连接而成，是人和动物皮肤、玻璃体、关节润滑液和软骨组织的重要成分，透明质酸钠在人体内具有多种作用，包括：空间填充、水合作用、关节润滑、以及提供细胞可以通过其迁移的基质，虽然透明质酸的优点众多，但是天然的透明质酸力学性能薄弱、在体内容易被降解等性质限制了其在生物材料方面的应用。交联透明质酸钠是透明质酸钠通过化学交联修饰得到的高分子凝胶，弥补了天然透明质酸钠存留时间短的缺点，现有技术中，往往采用多次交联来改善透明质酸钠的粘滞性、内聚性以及吸水性等性能。但是，二次交联制备工艺复杂，操作不够简便，且两次交联均需要加入交联剂，可能会造成交联剂残留，影响其安全性。另外，多次交联往往需要将透明质酸钠的分子量控制在适宜的范围内才能得到高粘滞性、高内聚性、低吸水性的凝胶，因而制备工艺的批间稳定性较差，实现产业化的难度则较高。因此，现有技术不能兼顾透明质酸凝胶制备工艺简单，安全性好，粘滞性强，内聚性高，吸水率低等产业化需求。
3.现有技术有加入水溶性纤维素对交联透明质酸钠进行改性的方案，如专利cn102492180b是将透明质酸钠(ha)与羟丙基甲基纤维素(hpmc)物理混合，利用hpmc填补ha凝胶颗粒间的间隙，其游离于透明质酸钠凝胶颗粒与颗粒之间，阻止透明质酸酶的进入，减少ha降解，但是该方案中hpmc是在交联ha凝胶形成后加入进去的，hpmc穿插到ha网格内部的难度很大，穿插到ha三维网络结构内部的效果有限，hpmc主要是游离在交联ha凝胶颗粒间的空隙中，因而不能有效提高交联ha凝胶内聚性和粘滞性，以及不能有效降低交联ha凝胶吸水性。
4.专利cn102226011b将透明质酸与羟丙基甲基纤维素进行酯化反应，得到透明质酸与羟丙基甲基纤维素复合非水凝胶，降低产品的体外酶解速率，提高产品的热稳定性能，但是该方案需要较长的反应时间，以及必须经过脱水等复杂的后处理步骤才能完成，制备工艺复杂，且反应过程需要引入有机溶剂，故有机溶剂的残留风险较高。
技术实现要素：
5.针对上述存在的问题，本发明提供一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶及其制备方法。本发明的交联透明质酸或其盐凝胶中含有水溶性纤维素，所述交联透明质酸或其盐具有三维网络结构，水溶性纤维素穿插到其三维网格内部，形成互穿网络结构，进一步稳固与紧致交联透明质酸或其盐的三维网格；同时，由于穿插在交联透明质酸或其盐三维网格中的水溶性纤维素分子间具有很强的相互作用力，因而增强了透明质酸或其盐凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性。本发明凝胶的吸水率低，内聚性高，粘滞性强，具有更好
的组织相容性，制备工艺简单，适合工业化生产。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.本发明第一方面公开了一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶，所述凝胶含有交联透明质酸或其盐和水溶性纤维素，所述交联透明质酸或其盐具有三维网络结构，所述水溶性纤维素通过先溶胀再溶解，使其穿插到交联透明质酸或其盐的三维网格内部，形成互穿网络结构。
8.进一步的，所述水溶性纤维素选自羟乙基甲基纤维素(hemc),羟丙基甲基纤维素(hpmc),羟丁基甲基纤维素(hbmc),乙基甲基纤维素(emc)和羧甲基纤维素(cmc)的一种或多种，优选为羟丙基甲基纤维素(hpmc)；
9.进一步的，所述羟丙基甲基纤维素的分子量为50～500kda；优选为100～400kda；更优选为150～300kda；
10.优选的，透明质酸或其盐的分子量为300～3000kda，更优选为500～2600kda。
11.所述凝胶中，交联透明质酸或其盐的含量为8～25mg/ml，水溶性纤维素的含量为0.4～4mg/ml。
12.所述透明质酸盐为透明质酸的金属盐，选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙、透明质酸锌中的一种或多种，优选透明质酸钠。
13.本发明第二方面提供一种第一方面所述的具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐的凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
14.步骤一：将透明质酸或其盐溶解，加入碱性试剂，搅拌均匀后，混入水溶性纤维素，混合均匀后，水溶性纤维素溶胀但不溶解，然后加入交联剂进行交联，得到交联的透明质酸或其盐；
15.步骤二：将交联的透明质酸或其盐调节ph值至6.5～7.5，加入局部麻醉剂，再加入生理上可接受的等张缓冲液载体，混合均匀，均质，湿热灭菌，即得。
16.所述步骤一中透明质酸或其盐的分子量为300～3000kda；所述分子量包括但不限于：300kda、400kda、500kda、600kda、700kda、800kda、900kda、1000kda、1100kda、1200kda、1500kda、1800kda、2000kda、2200kda、2500kda、3000kda，优选为500～2600kda；
17.优选的，所述水溶性纤维素为羟丙基甲基纤维素。
18.所述羟丙基甲基纤维素的分子量为50～500kda，包括但不限于：50kda、80kda、100kda、150kda、200kda、250kda、300kda、350kda、400kda，450kda、500kda，优选为100～400kda。
19.优选的，步骤一中，透明质酸或其盐的浓度为5％～35％，优选为10％～25％，通过控制透明质酸或其盐的浓度，使水溶性纤维素在碱化透明质酸或其盐的体系中，处于溶胀但不溶解的状态。本发明中所用的浓度均为质量浓度。
20.所述步骤一中加入碱性试剂后透明质酸或其盐溶液的ph为9以上，优选为10～13。
21.所述碱性试剂包括：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸钠、亚硫酸钾，更优选为氢氧化钠；
22.和/或，所述交联反应温度为10～30℃；更优选的，所述交联反应温度为15～25℃；
23.和/或，所述交联剂为：1,4-丁二醇二缩水甘油醚(bdde)、二乙烯基砜、聚乙二醇、京尼平、乙二醇二缩水甘油醚(egde)、1,6-己二醇二缩水甘油醚(hde)、一缩二乙二醇二缩
水甘油醚(dgeg)和碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合，优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚。
24.优选的，所述交联反应时间为2～60h；优选为12～24h；
25.进一步的，所述交联剂与透明质酸或其盐的质量比为：0.5％～5％；
26.本发明通过控制交联前透明质酸或其盐的浓度范围，可以使水溶性纤维素实现从溶胀到逐渐溶解状态。如果交联前透明质酸或其盐浓度低，水溶性纤维素会溶解，但是交联效果较弱，凝胶难以形成互穿网络结构，耐湿热灭菌能力较差，填充效果有限；即使提高交联剂用量，hpmc可能会交联，但难以形成互穿网络结构，而且交联的hpmc可能会存在体内降解问题，产生一定风险；如果交联前透明质酸或其盐浓度过高，可能存在交联程度不均匀，虽然水溶性纤维素不溶解，但是其难以均匀分散到交联透明质酸或其盐的三维网格内部。
27.进一步的，所述步骤二中交联透明质酸或其盐的含量为8～25mg/ml，水溶性纤维素的含量为0.4～4mg/ml；
28.所述生理上可接受的等张缓冲液载体包括乳酸钠林格试液、醋酸钠林格试液、磷酸盐缓冲溶液、眼内冲洗液中的一种或多种，优选为乳酸钠林格试液；
29.所述局部麻醉剂包括利多卡因、丁卡因、布比卡因和普鲁卡因中的一种以上，优选为利多卡因；
30.优选的，所述混合还包括再加入维生素、氨基酸、卵磷脂、肉毒碱中的一种或多种。
31.进一步的，所述混匀的时间为24～48h。
32.所述方法还包括灌装、灭菌步骤；
33.优选的，所述灌装包括：将混合样品灌装至预灌封注射器中，得到罐装样品；
34.优选的，灭菌包括：将灌装样品，置于高压蒸汽灭菌柜中，灭菌；
35.所述灭菌的时间包括5～30min，优选为15min；
36.所述灭菌的温度为110～130℃，优选为121℃。
37.本发明首先将水溶性纤维素均匀分散到透明质酸或其盐的碱性溶液中，以羟丙基甲基纤维素hpmc为例，通过控制透明质酸或其盐的浓度，使水溶性纤维素能均匀分散在碱化透明质酸或其盐的体系中，处于溶胀但不溶解的状态，其分子链段在此时呈蜷缩状；而当向碱性溶液中加入交联剂之后，蜷缩状的羟丙基甲基纤维素虽然不参与交联反应，但是仍能均匀的分散在交联透明质酸或其盐凝胶中；其次，在交联反应结束之后，随着反应体系被酸性试剂中和至中性以及反应体系被等张缓冲液载体稀释，此时分散在交联透明质酸或其盐凝胶中的羟丙基甲基纤维素则开始逐渐溶解，蜷缩分子链段在此时呈舒展状，其舒展的链段会逐渐穿插到交联透明质酸或其盐凝胶的三维网络结构中，将交联透明质酸或其盐凝胶的三维网格进一步加固和紧致，得到具有独特互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶。
38.通过本发明的制备方法，增强凝胶的强度，减少凝胶的吸水性；同时，由于穿插在交联透明质酸三维网格中的羟丙基甲基纤维素具有很强的分子间相互作用力，因而增强了透明质酸凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性，保证凝胶被均质之后仍能够保持较强的内聚力和粘滞性。本发明制备工艺简单，不需要通过复杂的二次交联即可得到吸水率低，内聚性高，粘滞性强，具有更好的组织相容性的凝胶。
39.相较于交联透明质酸钠凝胶与水溶性纤维素物理混合的工艺而言，本发明在透明
质酸或其盐交联反应之前引入水溶性纤维素，随着均匀分散的水溶性纤维素溶解状态变化，使其更容易穿插到交联透明质酸或其盐的三维网格内部，在交联透明质酸三维网络结构中形成更多“紧致点位”，从而能够有效稳固交联透明质酸的三维网格，增强凝胶强度和内聚力，以及降低凝胶吸水性。
40.本发明第三方面提供一种由第二方面所述的方法制备的交联透明质酸或其盐凝胶。
41.本发明第四方面还提供一种第一方面所述的凝胶或第三方面所述的交联透明质酸或其盐凝胶在制备组织工程材料、药品、化妆品中的应用。
42.优选的，所述组织工程材料包括软组织填充材料、软骨修复材料、组织植入材料、生物材料植入物的涂层；
43.优选的，所述生物材料植入物的涂层包括乳房填充物、导管、插管、骨骼修补物、软骨替代物、微型泵和其它药物输送装置、人工脏器和血管、组织增强用的网的涂层；
44.优选的，所述软组织填充材料包括作为面部、颈部、头部、耳部、乳房、关节的填充材料或关节润滑剂；
45.优选的，所述药品包括伤口愈合材料、注射液、活性剂的输送材料；
46.更优选的，所述伤口愈合药物为伤口敷料；
47.优选的，所述活性剂包括化学剂或生物学上的活性因子；
48.更优选的，所述活性因子包括消炎剂，抗生素，止痛药，麻醉剂，伤口愈合促进剂，细胞生长抑制剂，免疫刺激剂，免疫抑制剂和抗病毒药。
49.本发明的有益效果：
50.1、本发明的制备方法借助水溶性纤维素在碱化透明质酸或其盐中溶解状态变化，使得均匀分散在交联透明质酸或其盐中的纤维素分子链段从蜷缩到舒展后，更容易穿插到交联透明质酸的三维网格内部，形成互穿网络结构，进一步稳固与紧致凝胶的三维网格，增强凝胶的强度，减少凝胶的吸水性；同时，由于穿插到交联透明质酸三维网格内部的水溶性纤维素具有很强的分子间相互作用力，增强了透明质酸凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性，保证凝胶被均质之后仍能够保持较强的内聚力和粘滞性，最终形成了内聚性高，粘滞性强的凝胶，具有更好的组织相容性。
51.2、本发明通过控制交联前透明质酸或其盐浓度，水溶性纤维素实现从溶胀到逐渐溶解状态。如果交联前透明质酸浓度过低，则水溶性纤维素会溶解，缺少分子链段从蜷缩到舒展的过程，难以形成互穿网络结构，另外，该条件下的透明质酸交联程度也较弱，填充效果有限；即使提高交联剂用量，hpmc可能会交联，但难以无法形成互穿网络结构，而且交联的hpmc可能会存在体内降解问题，产生一定风险；如果交联前透明质酸浓度过高，可能存在交联程度不均匀，水溶性纤维素也难以均匀分散到交联透明质酸的三维网格内部的问题，较难实现产业化。
52.3、本发明形成的互穿网络结构，相对于交联透明质酸凝胶与水溶性纤维素物理混合的工艺而言，本发明在透明质酸或其盐交联反应之前引入水溶性纤维素，随着均匀分散的水溶性纤维素溶解状态变化，使其更容易穿插到交联透明质酸或其盐三维网格内部，在交联透明质酸或其盐三维网络结构中形成更多“紧致点位”，从而能够有效稳固交联透明质酸或其盐的三维网格，增强凝胶强度和内聚力，以及降低凝胶吸水性。
53.4、当采用本发明的透明质酸进行软组织填充时，很少吸水或几乎不吸水，与常规的交联透明质酸和羟丙基甲基纤维素的物理混合产品而言，吸水率减少70％，能够有效减少注射后发生红肿的概率，使即刻填充效果更佳；
54.5、本发明的制备方法通过采用热稳定性更好的乳酸钠林格试液，增强凝胶抵抗湿热灭菌的能力。
55.6、本发明的制备方法简便，不需要复杂的二次交联，能耗低、污染少，适合工业化生产。
56.总体来说，本发明的制备方法能够兼顾内聚性高，凝胶不易分散，粘滞性强，吸水较少，其简便，能耗低、污染少，适合工业化生产。
附图说明
57.图1所示为实施例1中凝胶的互穿网络结构示意图；
58.图2所示为实施例1中羟丙基甲基纤维素溶解前后的凝胶照片，其中，图2a所示为实施例1中羟丙基甲基纤维素溶解前的凝胶照片；图2b所示为实施例1中羟丙基甲基纤维素溶解后的凝胶照片；
59.图3所示为交联透明质酸钠凝胶的内聚性分级照片，其中，图3a所示为实施例1交联透明质酸钠凝胶产品的内聚性分级照片，图3b所示为对比例1交联透明质酸钠凝胶产品的内聚性分级照片；
60.图4所示为交联透明质酸钠凝胶的粘滞性分级照片，图4a所示为实施例1交联透明质酸钠凝胶产品的粘滞性分级照片，图4b所示为实施例3交联透明质酸钠凝胶产品的粘滞性分级照片，图4c所示为对比例1交联透明质酸钠凝胶产品的粘滞性分级照片，图4d所示为对比例3交联透明质酸钠凝胶产品的粘滞性分级照片；
61.图5所示为实施例1中凝胶的荧光显微镜照片；
62.图6所示为对比例1中凝胶的荧光显微镜照片；
63.图7所示为对比例2中凝胶的荧光显微镜照片；
64.图8所示为对比例3中凝胶的荧光显微镜照片；
65.图9所示为对比例4中凝胶的荧光显微镜照片。
具体实施方式
66.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
67.本发明中，术语“交联”是将具有化学反应活性的线型结构聚合物通过化学反应变为三维网状(体型)结构聚合物的过程。常被用于聚合物改性。
68.本发明中，术语“bdde”是指1,4-丁二醇二缩水甘油醚，属水溶性环氧树脂。黄透明液体，环氧值0.63～0.74，黏度15～20mpa
·
s。由1,4-丁二醇与环氧氯丙烷缩聚制得。多与双酚a型环氧树脂配合使用，常用于制备低黏度复合物、铸塑料、浸渍液、胶黏剂、涂料和树脂改性剂等。
69.本发明中，术语“交联剂”是指能在线型的分子之间产生能化学键，使线型分子相互连在一起，形成网状结构的试剂，用于提高高分子材料的强度。
70.本发明中，术语“乳酸钠林格试液”是指一种调节体液电解质及酸碱平衡的溶液，主要成分为乳酸钠、氯化钙、氯化钠和氯化钾，一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
71.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
72.实施例1交联透明质酸钠的制备
73.(1)称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到20ml注射用水中，溶解；加入5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至11，用电动搅拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min转速下搅拌15min，得到碱化后的透明质酸钠溶液；加入0.5g羟丙基甲基纤维素(分子量为280kda)，继续搅拌5min，并用多功能振荡器振摇5min，将羟丙基甲基纤维素均匀分散到碱化后的透明质酸钠溶液中，此时hpmc发生溶胀，整体呈乳白(如图2a)；再加入bdde150μl，室温下搅拌20min，25℃反应24h，得到交联的透明质酸钠凝胶。
74.(2)向上述交联的透明质酸钠凝胶中加入1mol/l盐酸溶液调节体系ph值至6.9-7.1，再加入100mg/ml盐酸利多卡因溶液10ml，用乳酸钠林格试液调控凝胶中透明质酸钠的含量为15mg/ml，此时对应的羟丙基甲基纤维素含量为1.5mg/ml，此时hpmc溶解，体系呈清澈透明状(如图2b)。然后，置于滚式混匀器(美国精骐有限公司，mr-03u)上，在80r/min转速下混合42h，得到样品。
75.(3)将制备得到的样品均质后，灌装至预灌封注射器中。然后，将灌装后的样品置于高压蒸汽灭菌柜中121℃灭菌15min。
76.实施例2交联透明质酸钠的制备
77.制备方法与实施例1相同，不同之处在步骤(2)：将乳酸钠林格试液替换为磷酸盐缓冲溶液。
78.实施例3交联透明质酸钠的制备
79.制备方法与实施例1相同，不同之处在步骤(1)：称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到50ml注射用水中，溶解，以及bdde加入量为250μl。
80.实施例4交联透明质酸钠的制备
81.制备方法与实施例1相同，不同之处在步骤(1)：称取5g透明质酸钠(分子量为2470kda)加入到20ml注射用水中，溶解。
82.对比例1交联透明质酸钠的制备
83.(1)称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到20ml注射用水中；加入氢氧化钠溶液调节ph值至11，用电动搅拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min转速下搅拌15min，得到碱化后的透明质酸钠溶液；加入bdde 150μl，室温下搅拌20min，25℃反应24h，得到交联的透明质酸钠凝胶。
84.(2)向上述交联的透明质酸钠凝胶中加入1mol/l盐酸溶液调节体系ph值至6.9～7.1，再加入100mg/ml盐酸利多卡因溶液10ml，用乳酸钠林格试液调控凝胶中透明质酸钠的含量为15mg/ml。然后，置于滚式混匀器(美国精骐有限公司，mr-03u)上，在80r/min转速下混合42h，均质，得到样品。
85.(3)向上述样品中加入0.5g羟丙基甲基纤维素(分子量为280kda)，用多功能振荡
器振摇，将羟丙基甲基纤维素均匀分散到交联透明质酸钠凝胶中，此时对应的羟丙基甲基纤维素含量为1.5mg/ml。然后，置于滚式混匀器(美国精骐有限公司，mr-03u)上，在80r/min转速下混合24h，得到最终样品。
86.(4)将制备得到的样品灌装至预灌封注射器中。然后，将灌装后的样品置于高压蒸汽灭菌柜中121℃灭菌15min。
87.对比例2交联透明质酸钠的制备
88.(1)称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到20ml注射用水中；加入5mol/l氢氧化钠溶液调节ph值至11，用电动搅拌器(ika，eurostar 20digita)在150r/min转速下搅拌15min，得到碱化后的透明质酸钠溶液；再加入bdde 150μl，室温下搅拌20min，25℃反应24h，得到交联的透明质酸钠凝胶。
89.(2)向上述交联的透明质酸钠凝胶中加入1mol/l盐酸溶液调节体系ph值至6.9～7.1，再加入100mg/ml盐酸利多卡因溶液10ml，用乳酸钠林格试液调控凝胶中透明质酸钠的含量为15mg/ml。然后，加入0.5g羟丙基甲基纤维素(分子量为280kda)，用多功能振荡器振摇，将羟丙基甲基纤维素均匀分散到交联透明质酸钠凝胶中，此时对应的羟丙基甲基纤维素含量为1.5mg/ml；然后，置于滚式混匀器(美国精骐有限公司，mr-03u)上，在80r/min转速下混合42h，均质，得到样品。
90.(3)将制备得到的样品灌装至预灌封注射器中。然后，将灌装后的样品置于高压蒸汽灭菌柜中121℃灭菌15min。
91.对比例3交联透明质酸钠的制备
92.制备方法与实施例1相同，不同之处在步骤(1)：称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到110ml注射用水中，溶解，以及bdde加入量为400μl。
93.对比例4交联透明质酸钠的制备
94.制备方法与实施例1相同，不同之处在步骤(1)：称取5g透明质酸钠(分子量为710kda)加入到110ml注射用水中，溶解。
95.验证例1交联透明质酸钠的吸水率测试
96.称取1g样品质量记为m0，置于500目筛网上，筛网的质量记为m1，将筛网置于平皿中，一次性加入30ml 0.9％氯化钠溶液，使其完全浸润样品，静置溶胀30min，将筛网并样品一起取出，用滤纸吸去筛网底部和周边多余液体水分，称量记作m2(凝胶加筛网的质量)，根据公式吸水率＝(m
2-m
1-m0)/m0计算。对实施例和对比例中的样品进行吸水率测试，测试结果见表1。从表中结果可知，相同透明质酸钠含量和缓冲溶液条件下，实施例1-4中样品的吸水率明显低于对比例1-3中样品的吸水率；对比例4由于交联度效果较弱，灭菌后无法维持凝胶形貌，无法检测吸水率。说明在实施例的制备工艺下，更有助于羟丙基甲基纤维素的分子链段向交联透明质酸钠的三维网格内部穿插，更易于形成互穿网络结构，进一步稳固与紧致凝胶的三维网络结构，使得可以进入三维空间网格的水量变少，进而减少凝胶的吸水性，故能够得到吸水率相对较低的样品，即可以满足低吸水、不肿胀的临床需求。因此，当采用本发明的实施例中样品进行软组织填充时，能够减少注射后发生红肿的概率，使即刻填充效果更佳。
97.表1交联透明质酸钠凝胶的吸水率测试结果
98.编号吸水率
实施例10.36实施例20.49实施例30.45实施例40.33对比例11.13对比例20.94对比例31.97对比例4灭菌后呈溶液态，无法检测
99.验证例2交联透明质酸钠的内聚性测试
100.将样品用1％的甲苯胺蓝染后，安装27g
×
1/2推挤针头，缓慢推注样品至生理盐水中，100r/min转速下搅拌5min，观察并记录样品的状态来表征内聚性。对实施例和对比例中的样品进行内聚性测试，测试结果见表2。从表中结果可知，在相同转速、相同搅拌条件下，实施例1-4中的样品仍呈规则、平滑长线状(实施例1如图3a)，对比例1-3中的样品呈长短不一的线段状(对比例1如图3b)，对比例4由于灭菌后无法维持凝胶状态，几乎呈溶液态，无法验证内聚性。说明在实施例的制备工艺下，不仅在交联透明质酸与羟丙基甲基纤维素之间形成了互穿网络结构，而且由于羟丙基甲基纤维素分子间很强的相互作用力，使得透明质酸凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性增强，即使是在强力搅拌后凝胶仍不易分散，保持原有的规则、平滑长线状，即内聚性更高。
101.表2交联透明质酸钠凝胶的内聚性测试结果
102.编号内聚性(在生理盐水中搅拌5min之后的性状)实施例1呈规则、平滑长线状实施例2呈规则、平滑长线状实施例3呈规则、平滑长线状实施例4呈规则、平滑长线状对比例1长短不一的线段状对比例2长短不一的线段状对比例3长短不一的线段状对比例4——
103.验证例3交联透明质酸钠的流动性测试
104.分别向聚四氟乙烯板(300mm
×
200mm)上10mm
×
10mm的区域推注0.5ml样品(使用前与生理盐水按照2:1体积比进行混合)。然后，将聚四氟乙烯板置于90
°
支撑架上，观察各样品沿着聚四氟乙烯板竖直向下流动30min后的情况，进而模拟样品在注射至人体组织后的粘滞性与相容性。对实施例和对比例中的样品进行流动性测试，测试结果见表3。从表中结果可知，实施例1、实施例3以及对比例1、对比例3中的样品在聚四氟乙烯板上竖直悬挂30min后均呈现流动但不滚动状态(实施例1如图4a；实施例3如图4b)，即样品的粘滞性更强，组织相容性更好；而对比例1、3样品则呈现滚动状态(对比例1如图4c；对比例3如图4d)，即样品的粘滞性较差，具有较差的组织相容性，进一步说明在实施例的制备工艺下，透明质酸凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性得到增强，保证凝胶被均质之后仍能够保持较强的粘滞性。
105.表3交联透明质酸钠凝胶的流动性测试结果
106.编号流动状态实施例1流动但不滚动实施例2流动但不滚动实施例3流动但不滚动实施例4流动但不滚动对比例1滚动对比例2滚动对比例3滚动对比例4流动
107.验证例4交联透明质酸钠的弹性模量测试
108.采用流变仪(ta，dhr-2)对实施例和对比例中的样品进行弹性模量测试，来表征凝胶的坚固性。具体方法如下：测试夹具为直径25～60mm的平板夹具，装载间隙为1000μm，测试温度通过帕尔贴板进行控制，测试时间为60s～120s，测试形变量为0.01～3000％，测试频率为0.1～10hz，测试结果见表4。从表中结果可知，在相同的检测条件下，实施例1中样品的弹性模量为328pa，对比例1和对比例2中样品的弹性模量则分别为239pa、253pa；进一步说明本发明实施例的制备方法更有利于形成互穿网络结构。另外，值得注意的是，实施例1与实施例2制备工艺基本一致，唯一区别在于所加入的缓冲盐溶液不同，而制备得到最终样品的弹性模量却相差较大，分别为328pa和296pa，说明当选择不含磷酸盐的乳酸钠林格试液作为缓冲溶液时，可以得到更耐湿热灭菌的凝胶。推测乳酸钠林格试液由于含有乳酸根，相较于磷酸缓冲盐中的磷酸氢根，其热稳定性更好，故能够更好的保护凝胶的三维网络结构以及互穿网络结构，尽量减少高温对其结构的破坏，进而增强凝胶抵抗湿热灭菌的能力。而对比例4经灭菌后几乎呈溶液态，弹性模量无测试意义。
109.表4交联透明质酸钠凝胶的弹性模量测试结果
110.编号弹性模量实施例1328pa实施例2296pa实施例3307pa实施例4345pa对比例1239pa对比例2253pa对比例3135pa对比例4无测试意义
111.验证例5交联透明质酸钠的互穿网络结构表征
112.将异硫氰酸荧光素(fitc)标记的羟丙基甲基纤维素hpmc作为原料，分别按照实施例1、对比例1-4中的制备方法制备得到fitc标记的交联透明质酸钠凝胶，并经过透析得到最终样品，通过荧光显微镜拍摄各样品在470nm波长下的荧光照片(放大倍数50
×
)，来表征羟丙基甲基纤维素与交联透明质酸钠凝胶形成互穿网络结构的实际情况，具体结果如图5～图9(即图中荧光点即代表hpmc)。从图中可以看出，实施例1中的样品(图5)在显微镜视野
下的荧光分布较为致密、均匀，这是由于本发明的制备方法使hpmc从溶胀到逐渐溶解状态，使得hpmc均匀分散在交联透明质酸钠中，hpmc分子链段更容易穿插在交联透明质酸的三维网格内部，形成互穿网络结构；而对比例1、对比例2和对比例3中的样品(依次为图6、图7和图8)在相同显微镜视野下的荧光分布则较为稀疏，且不均匀，这是由于对比例1-2制备方法中的hpmc均是在溶解状态下与交联透明质酸钠凝胶混合，hpmc难以均匀分散到交联透明质酸钠的三维网格内部，因此，hpmc荧光点数量较少且不均匀；对比例3制备方法中的hpmc虽然可能会在提高交联剂用量后发生交联反应，但难以形成互穿网络结构，而且经湿热灭菌，三维网络结构容易被破坏，因此，hpmc荧光点数量也较少。另外，对比例4中的样品(图9)在显微镜视野下并未观察到荧光现象，这是由于在对比例4的制备方法中，交联反应前的透明质酸钠浓度低，虽然hpmc基本上溶解于碱性的透明质酸钠中，但由于体系中hpmc与透明质酸钠的浓度均较低，交联效果较弱，耐湿热灭菌能力较差，故推测在灭菌的高温条件下交联ha三维网络结构可能被完全破坏，也很难得到交联态的hpmc，仍然主要为游离态hpmc，所以透析后未观察到荧光现象。
技术特征：
1.一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶，其特征在于，所述凝胶含有交联透明质酸或其盐和水溶性纤维素，所述交联透明质酸或其盐具有三维网络结构，所述水溶性纤维素通过先溶胀再溶解，使其穿插到交联透明质酸或其盐的三维网格内部，形成互穿网络结构。2.如权利要求1所述的凝胶，其特征在于，所述水溶性纤维素选自羟乙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，乙基甲基纤维素和羧甲基纤维素的一种或多种，优选为羟丙基甲基纤维素。3.如权利要求2所述的凝胶，其特征在于，所述羟丙基甲基纤维素的分子量为50～500kda；优选为100～400kda；透明质酸或其盐的分子量为300～3000kda，优选为500～2600kda。4.如权利要求1所述的凝胶，其特征在于，交联透明质酸或其盐的含量为8～25mg/ml，水溶性纤维素的含量为0.4～4mg/ml。5.如权利要求3所述的凝胶，其特征在于，所述透明质酸盐选自透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙、透明质酸锌中的一种或多种，优选透明质酸钠。6.一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一：将透明质酸或其盐溶解，加入碱性试剂，搅拌均匀后，混入水溶性纤维素，混合均匀后，水溶性纤维素溶胀但不溶解，然后加入交联剂进行交联，得到交联的透明质酸或其盐；步骤二：将交联的透明质酸或其盐调节ph值至6.5～7.5，加入局部麻醉剂，再加入生理上可接受的等张缓冲液载体，混合均匀，均质，灭菌，即得。7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中透明质酸或其盐的分子量为300～3000kda；优选为500～2600kda；所述水溶性纤维素选自：羟乙基甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羟丁基甲基纤维素，乙基甲基纤维素和羧甲基纤维素的一种或多种；优选的，所述水溶性纤维素为羟丙基甲基纤维素；优选的，所述羟丙基甲基纤维素的分子量为50～500kda；优选为100～400kda。8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中透明质酸或其盐的浓度为5％～35％，优选为10％～25％；所述步骤一中加入碱性试剂后透明质酸或其盐溶液的ph为9以上，优选为10～13。9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述碱性试剂包括：氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、亚硫酸钠、亚硫酸钾，优选为氢氧化钠；和/或，步骤一交联反应温度10～30℃；更优选的，反应温度为15～25℃；和/或，所述交联剂为：1,4-丁二醇二缩水甘油醚、二乙烯基砜、聚乙二醇、京尼平、乙二醇二缩水甘油醚、1,6-己二醇二缩水甘油醚、一缩二乙二醇二缩水甘油醚和碳化二亚胺中的一种或任意两种以上的混合，优选为1,4-丁二醇二缩水甘油醚；优选的，所述交联反应时间为2～60h；更优选为12～24h；所述交联剂与透明质酸或其盐的质量比为：0.5％～5％；所述生理上可接受的等张缓冲液载体包括乳酸钠林格试液、醋酸钠林格试液、磷酸盐缓冲溶液、眼内冲洗液中的一种或多种，优选为乳酸钠林格试液；
所述局部麻醉剂包括利多卡因、丁卡因、布比卡因和普鲁卡因中的一种以上，优选为利多卡因；优选的，所述混合还包括再加入维生素、氨基酸、卵磷脂、肉毒碱中的一种或多种。10.权利要求1所述的凝胶或权利要求6-9任一项所述制备方法得到的凝胶在制备组织工程材料、药品、化妆品中的应用；优选的，所述组织工程材料包括软组织填充材料、软骨修复材料、组织植入材料、生物材料植入物的涂层；优选的，所述生物材料植入物的涂层包括乳房填充物、导管、插管、骨骼修补物、软骨替代物、微型泵和其它药物输送装置、人工脏器和血管、组织增强用的网的涂层；优选的，所述软组织填充材料包括作为面部、颈部、头部、耳部、乳房、关节的填充材料或关节润滑剂；优选的，所述药品包括伤口愈合材料、注射液、活性剂的输送材料；更优选的，所述伤口愈合药物为伤口敷料；优选的，所述活性剂包括化学剂或生物学上的活性因子；更优选的，所述活性因子包括消炎剂，抗生素，止痛药，麻醉剂，伤口愈合促进剂，细胞生长抑制剂，免疫刺激剂，免疫抑制剂和抗病毒药。
技术总结
本发明涉及一种具有互穿网络结构的交联透明质酸或其盐凝胶，所述凝胶含有交联透明质酸或其盐和水溶性纤维素，所述交联透明质酸或其盐具有三维网络结构，水溶性纤维素穿插到其三维网格内部，形成互穿网络结构，进一步稳固与紧致交联透明质酸或其盐的三维网格；同时，由于穿插在交联透明质酸或其盐三维网格中的水溶性纤维素的分子间具有很强的相互作用力，因而增强了交联透明质酸或其盐凝胶颗粒与颗粒之间的粘附性。本发明制备所得凝胶的吸水率低，内聚性高，粘滞性强，具有更好的组织相容性，制备工艺简单，适合工业化生产。适合工业化生产。适合工业化生产。
