一种具有降镉和固氮作用的固氮-降镉微生物菌剂及其制备方法和应用与流程
7.6。
13.进一步的，发酵培养液中的总接种量为2％。
14.进一步的，生物质材料包括稻壳粉，生物质材料与混合的发酵培养液的固液比为1g:2-10ml。
15.一种采用上述制备方法制备的固氮-降镉微生物菌剂。
16.固氮-降镉微生物菌剂的应用，用于降低土壤中有效态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量。
17.本发明的固氮-降镉微生物菌剂，能够降低土壤中有效态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量，从而达到减少作物吸收镉的作用，而且也能够在一定程度上代替肥料的作用和化学钝化剂的作用，能够明显的提高土壤中的速效氮的含量，也带来了体系中其它养分的变化，可以速效钾与速效氮的变化趋势基本一致，速效磷在投加菌剂前期也有显著提高。
18.本专利菌剂制作方式简单，利用吸附方式将微生物固定化，省去了其它微生物固定化方式复杂的制作过程；本专利借助价廉易得的生物质材料作为载体，利用微生物修复土壤镉污染，与其它处理方式相比，投入成本小；本专利较其它化学处理方式相比，所选材料对环境的扰动性小，在降低土壤有效态镉的同时也降低了植物对镉的吸收，而且也能够在一定程度上代替肥料的作用，具有推广应用价值。
附图说明
19.图1为固氮微生物降镉功能曲线；
20.图2为制备的固氮-降镉微生物菌剂的照片；
21.图3为土壤体系有效态镉变化图(图中a、b、c、d标准代表是否出现显著性差异)；
22.图4为土壤镉形态分析图(cd(f1)-酸可提取态镉cd(f2)-可还原态镉cd(f3)-可氧化态镉cd(f4)-残渣态镉，ck为空白组，dn为菌剂组)；
23.图5为土壤体系中养分的测定结果图(分别是易于植物吸收利用的速效氮、速效磷、速效钾)；
24.图6为植株体内镉含量与植株生长状况监测图(*代表显著性差异)；
25.图7为植株体内镉含量测定结果图(大田试验，p《0.01，**代表具有显著性差异)。
具体实施方式
26.以下是本发明的具体实施例并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
27.固氮微生物的富集
28.称取10g新鲜土壤置于装有90ml无菌水的三角锥形瓶中，150r/min振荡2h后，静置后取上清液制得土壤菌悬液。使用固氮培养基对土壤菌悬液进行富集，得到目的富集产物。菌用甘油放置在-80℃冰箱保存。富集培养基成分见表1。
29.表1固氮培养基成分
[0030][0031]
固氮微生物的降镉功能验证
[0032]
配置牛肉膏蛋白胨培养基，一部分用于活化菌，一部分用于降镉功能验证实验。降镉功能验证实验体系中，培养基中含有5mg/lcd
2+
。按照时间梯度(0、1、2、3、4、5、6、7)对样品进行取样。采用火焰原子分光光度计测定体系中的cd
2+
。实验结果见图1，ck为空白组，n为菌剂组，实验数据表明，富集的固氮微生物具有很好的降镉功能，在体系中，1d前后反应即可达到平衡，去除体系中镉的效率达到70％左右。
[0033]
制备固氮微生物菌剂
[0034]
配置牛肉膏蛋白胨培养基：分别称取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，用氢氧化钠溶液调节至7.4-7.6。
[0035]
将活化后的菌株进行隔夜扩大培养，待培养基体系中od
600
达到1.0-1.2，停止培养。在冷冻离机中(设置离心条件：8000r/min，5min)进行离心，弃上清液，然后用灭菌的去离子水在涡旋仪上进行重悬，收集菌体。
[0036]
将上述菌体与灭菌的稻壳粉进行混合，在摇床上进行振荡(设置条件180r/min，24h)，使稻壳粉对微生物进行吸附固定，完成微生物菌剂的制备。参见附图2，为本实施技术方案制备的解磷微生物菌剂。
[0037]
土壤有效态镉监测
[0038]
按照国家标准《土壤质量有效态铅和镉的测定原子吸收法》gb/t23739-2009对盆栽实验体系中有效态镉进行监测。测定结果见图3，可以看出，固氮菌剂的添加能够降低土壤中有效态镉含量，在第25d前后趋于稳定。实验组与空白处理组出现显著性差异，有效态下降达到27.99％。
[0039]
土壤镉形态监测
[0040]
按照国际上常用的bcr连续提取法对体系中的镉形态进行监测，测定方法见表2，测定结果见图4。
[0041]
表2bcr连续提取法
[0042][0043]
实验结果表明，体系中酸可提取态镉、可还原态镉在固氮菌剂的作用下，含量出现下降，下降比例分别达到25.89％、18.33％；可氧化态镉、残渣态镉在菌剂的作用下，含量出现上升，上升比例分别达到45.23％、》100％，且上升与下降均出现显著性变化。残渣态镉的变化趋势最为明显。镉的生物有效性从酸可提取态到残渣态依次降低。上述实验数据表明，镉的形态从不稳定状态向稳定状态发生了转化，这解释了上述实验有效态镉含量出现下降的原因。
[0044]
土壤养分的测定
[0045]
按照《土壤农业化学分析方法》对体系的n-p-k进行测定。
[0046]
如图5所示，固氮微生物菌剂的添加，能够明显的提高土壤中的速效氮的含量，各个处理时间段均出现显著性差异，值得注意的是，虽然添加的是固氮微生物菌剂，但由于添加的是微生物菌，菌也带来了体系中其它养分的变化，可以速效钾与速效氮的变化趋势基本一致，速效磷在投加菌剂前期也有显著提高。这些表明，投加的微生物菌剂不仅能够起到降低土壤中有效态镉的作用，也能够在一定程度上代替肥料的作用。
[0047]
植株体内镉含量与植株生长状况监测
[0048]
按照国家标准《食品安全国家标准食品中镉的测定》gb5009.15-2014对生菜体内镉含量进行监测，使用直尺测定植株株高，使用天平测定植株鲜重。实验结果如下图6，固氮微生物菌剂的添加能够降低植株体内镉含量，降幅达到21.07％，并且出现显著性差异。在降低植株体内镉含量的同时，固氮微生物菌剂能够促进植株的生长，在一个生长周期中，植株的鲜重增幅达到23.45％，植株的高度增幅达到25.59％。数据表明，植株的鲜重与植株的高度有一定的正相关关系。植株的生长状况得到改善，与植株体内镉含量下降有关，表明微生物菌剂缓解了重金属镉对植株的毒害作用，这也有微生物菌剂促进了体系中养分含量的升高有关。
[0049]
野外大田应用试验探究
[0050]
将制备得到的固氮微生物菌剂应用到野外镉污染土壤(浙江省金华市永康县芝英镇)，测定种植生菜植株体内镉含量。测定结果见图7，数据表明，固氮微生物菌剂在野外环境同样具有效果，且效果明显，出现显著性差异，植株体内镉含量下降比例达到21.63％。
[0051]
以上未涉及之处，适用于现有技术。
[0052]
虽然已经通过示例对本发明的一些特定实施例进行了详细说明，但是本领域的技术人员应该理解，以上示例仅是为了进行说明，而不是为了限制本发明的范围，本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例来做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的方向或者超越所附权利要求书所定义的范围。本领域的技术人员应该理解，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种具有降镉和固氮作用的固氮-降镉微生物菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：s1:微生物发酵液的制备：配置发酵培养液；s2:微生物的扩大培养：将固氮-降镉微生物菌剂添加到发酵培养液中；s3:微生物菌剂的制备：待上述发酵液发酵培养18h后，将投入生物质材料进行混合，混合后，前8个小时，每隔2小时对菌剂进行搅拌，使得混合物内各组分状态均一，8小时后，待其自然稳定到24h，完成菌剂的制作；其中，固氮-降镉微生物菌剂的富集过程如下：称取新鲜土壤置于装有无菌水中振荡，静置后取上清液制得土壤菌悬液；使用固氮-降镉培养基对土壤菌悬液进行富集，得到目的富集产物固氮-降镉微生物菌剂。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述固氮-降镉培养基成分如下，甘露醇10g/l；caso
4 0.20g/l；k2hpo40.20g/l；caco35g/l；mgso
4 0.20g/l；namoo4·
2h2o 20ul/l；nacl 0.02g/l；fecl320ul/l。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述配置发酵培养液为牛肉膏：3g、蛋白胨：10g、氯化钠：5g、ph：7.4-7.6。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：发酵培养液中的总接种量为2％。5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：生物质材料包括稻壳粉，生物质材料与混合的发酵培养液的固液比为1g:2-10ml。6.一种采用权利要求1-5任一项所述制备方法制备的固氮-降镉微生物菌剂。7.如权利要求6所述的固氮-降镉微生物菌剂的应用，其特征在于：用于降低土壤中有效态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量。
技术总结
本发明公开了一种具有降镉和固氮作用的固氮-降镉微生物菌剂及其制备方法和应用。制备方法包括如下步骤：S1:微生物发酵液的制备：配置发酵培养液；S2:微生物的扩大培养：将固氮-降镉微生物菌剂添加到发酵培养液中；S3:微生物菌剂的制备：待上述发酵液发酵培养18h后，将投入生物质材料进行混合，搅拌一段时间后稳定，完成菌剂的制作；其中，固氮-降镉微生物菌剂的富集过程如下：称取新鲜土壤置于装有无菌水中振荡，静置后取上清液制得土壤菌悬液；使用固氮-降镉培养基对土壤菌悬液进行富集，得到目的富集产物固氮-降镉微生物菌剂。本发明的固氮-降镉微生物菌剂，能够降低土壤中有效态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量。态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量。态镉含量和提高土壤中的速效氮的含量。
