一种巴西甜突变体及其应用的制作方法
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种巴西甜突变体及其应用。
背景技术：
2.甜味剂是食品加工领域不可或缺的重要添加剂。传统的甜味剂如蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖，具有食用安全和营养价值，然而存在甜度低，热量高，长期摄入容易引起龋齿、肥胖、心脑血管等疾病。正因为这些弊端，无热量的人工甜味剂相继被开发出来，如：阿巴斯甜，安赛蜜，糖精，纽甜。这些甜味剂得到了广泛使用，但依然存在头晕、头痛等不良反应，其代谢产物对环境和人体健康的安全性难以检测。所以迫切需要寻一种天然的甜味物质，以满足人们生活需要。
3.植物甜蛋白作为一种天然产物，因具有安全性高，甜度高，热量低的优点而被人们所关注。植物甜蛋白这些性质使其成为目前低热量高甜度的人工甜味剂的理想替代品。相继有八种植物甜蛋白被发现出来，这些甜蛋白是传统甜味剂和人工甜味剂的最佳替代品之一。其中brazzein是从西非攀缘植物中提取的甜蛋白，甜度是蔗糖的500-2000倍，而且与其他甜蛋白相比，甜味味觉感受与蔗糖更相似。在ph2.5-8.0范围内，保持稳定，而且耐热性好，易溶于水，适用于各种食品加工工艺。植物中的甜蛋白含量低，提取困难，难以规模化生产。
4.为了解决植物甜蛋白产量低，难以产业化的问题，近年来，国内外学者利用微生物异源表达甜蛋白，提升甜蛋白产量的报道较多。如大肠杆菌，丝状真菌，动物细胞等，然而这些都共同存在产量不足以用于生产的问题，这也是甜蛋白难以产业化的瓶颈。
技术实现要素：
5.本发明为解决现有技术问题，通过蛋白质工程技术，筛选能提高巴西甜brazzein甜度的基因突变位点，并在毕赤酵母中超量表达巴西甜，以期达到工业化的要求。
6.本发明一方面涉及一种巴西甜蛋白，其氨基酸序列为seq id no:1，编码核苷酸序列为seq id no:2。
7.本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:1的巴西甜蛋白的第14位氨基酸由ser变为arg。
8.所述突变体的氨基酸序列为seq id no:3，编码核苷酸序列为seq id no:4。
9.本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:3的巴西甜蛋白的第22位氨基酸由cys变为ala。
10.所述突变体的氨基酸序列为seq id no:5，编码核苷酸序列为seq id no:6。
11.本发明一方面涉及一种巴西甜突变体，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:5的巴西甜蛋白的第48位氨基酸由ile变为tyr。
12.所述突变体的氨基酸序列为seq id no:7，编码核苷酸序列为seq id no:8。
13.本发明还提供了一种重组表达质粒，携带有上述突变体的编码核苷酸序列
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达质粒。
14.在本发明的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母（pichia pastoris）。
15.将上述重组表达质粒转入毕赤酵母宿主细胞中进行重组表达，获得的巴西甜突变体的甜度得到显著提高。
16.本发明还涉及上述巴西甜突变体在饲料或食品加工领域中的应用。
17.本发明提供的巴西甜突变体b1-2、b1-3、b1-4在毕赤酵母中表达后，其甜度比突变前的巴西甜b1分别提高了133%、233%、300%，取得了意料不到的技术效果。所述突变体可作为甜味剂广泛应用于饲料、食品加工等领域，应用前景广阔。
具体实施方式
18.本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如molecular cloning: a laboratory manual, 3nd ed. (sambrook, 2001)和current protocols in molecular biology (ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
19.菌株与载体：大肠杆菌dh5α本公司保藏，毕赤酵母gs115、载体ppic9k、amp、g418、zeocin购自invitrogen公司。
20.酶与试剂盒：dna聚合酶购买自takara公司，t4连接酶、限制性内切酶购自fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自omega公司，genemorph ii随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
21.培养基配方：大肠杆菌培养基（lb培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%nacl，ph7.0；lb+amp培养基：lb培养基加100μg/ml氨苄青霉素；酵母培养基（ypd培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；ypd+zeocin培养基：ypd培养基加100μg/ml zeocin；酵母筛选培养基（md培养基）：1.34% ynb，4
×
10-5
生物素，1%甘油、2%琼脂糖；bmgy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，1%甘油；bmmy培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mm磷酸钾缓冲液(ph6.0)，1.34% ynb，4
×
10-5
%生物素，0.5%甲醇。
22.下面结合实施例，进一步阐述本发明。
23.实施例1 巴西甜b1的基因合成查阅genbank中的基因序列，在pentadiplandra brazzeana中到一个巴西甜蛋白基因，命名为b1，genbank号为p56552.1。所述巴西甜蛋白的氨基酸序列为seq id no:1，其编码核苷酸序列为seq id no:2。由华大基因公司进行全基因合成；b1基因全长165bp。
24.实施例2 巴西甜b1突变体的筛选为了进一步提高巴西甜b1的甜味活性，通过定向进化技术对该基因进行了大量的突变筛选；以b1基因为模板，利用引物1（f）和引物1（r）用genemorph ii随机突变pcr试剂盒
（stratagene）进行pcr扩增；引物1（f）：gcgcgaattccaagataaatgtaagaaggtgtacg；引物1（r）：taaagcggccgctcaatattcacaataatcaca。
25.胶回收pcr产物，ecori、not i进行酶切处理后与经同样酶切后的pet21a载体连接，转化至大肠杆菌bl21（de3）中，涂布于lb+amp平板，37℃倒置培养；待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150 ul含有0.1mm iptg的lb+amp培养基，37℃、220 rpm培养6 h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有巴西甜的大肠杆菌细胞裂解液。再离心去除菌体，将上清液进行巴西甜的甜味活性测定。
26.实验结果表明，有些突变对巴西甜b1的甜味活性没有影响，有些突变甚至使其甜味活性变得更低了。最终，申请人筛选到甜味活性显著提高的突变位点及其组合：s14r单点突变，s14r/c22a两点突变，s14r/c22a/i48y三点突变。
27.将含单点突变s14r的巴西甜突变体命名为b1-2，其氨基酸序列为seq id no:3，编码核苷酸序列为seq id no:4。
28.将含s14r/c22a两点突变的巴西甜突变体命名为b1-3，其氨基酸序列为seq id no:5，编码核苷酸序列为seq id no:6。
29.将含s14r/c22a/i48y三点突变的巴西甜突变体命名为b1-4，其氨基酸序列为seq id no:7，编码核苷酸序列为seq id no:8。
30.以上突变体的基因由华大基因公司合成。
31.用引物1（f）和引物1（r）对上述三个突变体进行pcr扩增，pcr条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温10min。结果显示，突变体b1-2、b1-3、b1-4三个基因的长度与b1基因相同，全长165bp。
32.实施例3重组表达巴西甜的毕赤酵母工程菌的构建1、重组质粒的构建将克隆得到的巴西甜基因b1和三个突变体基因（b1-2、b1-3、b1-4）分别用限制性内切酶ecor i和not i进行双酶切，100 μl酶切体系如下：巴西甜基因b1（b1-2、b1-3、b1-4）的 pcr产物40 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、ecor i 5 μl、not i 5 μl、ddh2o 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
33.将表达载体ppic9k先用限制性内切酶ecor i进行单酶切，100 μl酶切体系如下：表达载体ppic9k 20 μl、10
×
h buffer 10 μl、ecor i 5 μl、ddh2o 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶not i进行单酶切，100 μl酶切体系如下：ppic9k回收片段20 μl、10
×
h buffer 10 μl、10
×
bsa 10 μl、10
×
triton 10 μl、not i 5 μl、ddh2o 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。
34.将经ecor i和not i双酶切的b1片段、b1-2片段、b1-3片段、b1-4片段分别与经同样酶切后的表达载体ppic9k连接，构建重组表达质粒ppic9k-b1、ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4。连接体系如下：表达载体ppic9k双酶切产物5 μl、b1（b1-2、b1-3、b1-4）基因双酶切产物3 μl、10
×
t
4 ligase buffer 1 μl、t
4 ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌dh5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到lb+amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒ppic9k-b1（ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4）。
35.2、转化与筛选将重组酵母表达质粒ppic9k-b1、ppic9k-b1-2、ppic9k-b1-3、ppic9k-b1-4分别用sal i进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母gs115，涂布md平板。在md平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素g418的ypd平板上筛选多拷贝的转化子。
36.3、摇瓶发酵验证挑取单个多拷贝转化子分别接入bmgy培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入bmmy培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行甜蛋白活性测定。
37.结果显示，摇瓶水平下转化子中巴西甜b1的甜度最高达到标准蔗糖的300倍，蛋白含量为1.50g/l，将该转化子编号为b1-33；巴西甜b1-2的甜度最高达到标准蔗糖的700倍，蛋白含量为1.63g/l，将该转化子编号为b1-2-78；巴西甜b1-3的甜度最高达到标准蔗糖的1000倍，蛋白含量为1.43g/l，将该转化子编号为b1-3-46；巴西甜b1-4的甜度最高达到标准蔗糖的1200倍，蛋白含量为1.49g/l，该转化子编号为b1-4-24。
38.上述结果显示，本发明提供的巴西甜突变体b1-2、b1-3、b1-4在毕赤酵母中表达后，其甜度比突变前的巴西甜b1分别提高了133%、233%、300%，取得了意料不到的技术效果。
39.一、甜味蛋白的甜味检测方法甜味蛋白的甜味鉴定采用盲测实验。盲测实验对照组采用10%的蔗糖水溶液，甜味蛋白的待检测样品配制成不同浓度梯度后随机编号，由10人组成评定小组对样品进行品尝，判断不同浓度梯度样品中与10%蔗糖水溶液的甜度相同或相近的样品，从而计算出样品的甜度。
40.公式为：相对蔗糖甜度倍数=10
×
稀释倍数甜味蛋白不同浓度梯度样品的配制：先称取甜味蛋白样品1.0g加蒸馏水稀释至100ml，即成1.0%的样品溶液；再量取1.0%样品溶液，用蒸馏水进一步稀释成2倍，4倍，6倍，8倍，10倍，20倍，50倍，100倍，200倍，300倍等不同稀释倍数的待测溶液。
41.二、考马斯亮蓝法检测蛋白含量1、试剂（1）考马斯亮蓝g-250染液：取考马斯亮蓝g-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀释至1升，常温可使用1个月；（2）标准蛋白溶液：用牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1 mg/ml的蛋白质标准溶液；（3）标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.05g结晶牛血清蛋白，于小烧杯中，加入少量蒸馏水溶解后转入50ml容量瓶中，烧杯内残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。配制成标准原液，其中牛血清蛋白浓度为1000μg/ml。
42.2、标准曲线的绘制。
43.（1）分别取6支试管，编号，按下表加入试剂，混匀。管号123456样品（ml）00.10.20.30.40.5水（ml）2.01.91.81.71.61.5蛋白质含量（mg/ml）00.050.10.150.20.25
44.准确吸取2.5ml 考马斯亮蓝溶液于6支干净试管中，准确吸取上述各管溶液0.1ml，对应放于各自编号的试管中，涡旋混匀，室温放置5min后，以1号试管调零，测定在595nm处比，记录吸光值。
45.（2）绘制标准曲线：记录1-6管所读吸光值，以蛋白质含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。注意，由于考马斯亮蓝染能力强，比杯一定要洗干净。不可用石英杯测定。
46.3、样品的测定样品的准备：（1）液体样品：将待测样品稀释至蛋白含量0.1-0.3mg/ml，控制除去空白后的吸光值（减去空白以后）在0.2-0.4之间；（2）固体样品：准确称取1.0000g样品于100ml三角瓶中，用移液加入20ml去离子水，磁力搅拌10min，4000rpm离心10min，取上清进一步稀释测定蛋白含量，稀释方法参见液体样品。
47.样品检测：取干净试管，加入到含有2.5ml考马斯亮蓝溶液，然后加入待测样品，涡旋震荡摇匀，室温放置5min，以标准曲线空白作对照，用1cm光径的微量比杯在595nm测定吸光度，根据标曲求得蛋白含量。
48.4、蛋白含量计算蛋白含量=x*稀释倍数*标样折算系数。
49.x：根据标曲求出的蛋白含量（mg/ml）；标样折算值：标样为47mg/ml，根据实测值折算一个系数。
50.本发明提供的巴西甜突变体可作为甜味剂广泛应用于饲料、食品加工等领域，应用前景广阔。
技术特征：
1.一种巴西甜，其特征在于，所述巴西甜的氨基酸序列为seq id no:1，编码核苷酸序列为seq id no:2。2.一种巴西甜突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:1的巴西甜的第14位氨基酸由ser变为arg。3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为seq id no:3，编码核苷酸序列为seq id no:4。4.一种巴西甜突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:3的巴西甜的第22位氨基酸由cys变为ala。5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为seq id no:5，编码核苷酸序列为seq id no:6。6.一种巴西甜突变体，其特征在于，所述突变体是氨基酸序列为seq id no:5的巴西甜的第48位氨基酸由ile变为tyr。7.如权利要求6所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列为seq id no:7，编码核苷酸序列为seq id no:8。8.一种重组表达质粒，其特征在于，所述质粒携带有权利要求2-7任一所述突变体的编码核苷酸序列。9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求8所述的重组表达质粒。10.权利要求2-7任一所述的巴西甜突变体在饲料或食品加工领域中的应用。
技术总结
本发明涉及基因工程与蛋白质改造技术领域，具体涉及一种巴西甜突变体及其应用。申请人通过蛋白质工程技术，筛选到显著提高巴西甜Brazzein甜度的基因突变位点，并在毕赤酵母中超量表达巴西甜。所述突变体可作为甜味剂，广泛应用于饲料或食品加工领域。泛应用于饲料或食品加工领域。
