一种体外制备血小板的方法及其培养基与流程
1.本发明涉及干细胞分化领域，具体涉及脐带血造血干细胞的分离、纯化、增殖和分化。更具体地，涉及一种体外制备血小板的方法。
背景技术：
2.血小板是血液组成的部份，分化自骨髓当中的巨核细胞。血小板在临床主要用于血液肿瘤疾病，亦可应用于其他肿瘤疾病、败血症、内脏出血等。此外，血小板于再生医疗被广泛应用，有助于伤口复原、组织修护、抑制发炎等，部分眼科疾病亦会使用血小板眼药水进行角膜修护或干眼症。
3.血小板是巨核细胞成熟后胞质脱落产生的膜状结构，在体外生存期较短，而在骨髓中，巨核细胞的含量极低(占有核细胞的0.01％)，难于大量获得并进行原代培养。因此，可以透过体外培养提高巨核细胞的产量，进而高效率地得到血小板是目前迫切需要解决的问题。
4.现有技术中，血小板的主要来源为无偿献血与体外细胞培养。前者从血液中离心、压板等程序分离出血小板，然而该技术受限于血液的供给量，且血小板的量取决于原血源，较为不稳定；而后者则可以从ips细胞技术、脐带血(samarkanova等，blood transfus.2020,18(3):208
–
216)来制备血小板。ips细胞技术虽然可以诱导细胞转化为巨核细胞、血小板，但仍需尝试诱导条件，且稳定细胞状态、有效率地取得巨核细胞与血小板会是技术难点，耗时且耗费用。因此，近年国外已有从脐带血制备血小板的技术，并将此技术试图应用于欧洲gmp制程(good manufacturing practice)(lawrence等，npj regen.med.2021,6:27)。
5.目前国内脐带血在血液制备应用多用于制备血浆，例如富血小板血浆(platelet-rich plasma，prp)，再从离心血浆提取血小板。因此，现有技术较缺乏生产量高、纯度高、血小板分化效率高的方法。
技术实现要素：
6.本发明可以透过巨核细胞培养基、血小板成熟培养基，从脐带血造血干细胞稳定制备大量、纯度高的血小板。
7.为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：
8.本发明提供一种体外制备血小板的方法，包括以下步骤：
9.1)分离出血液样本中的干细胞；
10.2)于巨核细胞分化培养基中培养；
11.3)更换为血小板成熟培养基；
12.4)收集成熟的血小板。
13.优选地，血液样本为人脐带血。
14.优选地，上述分离纯化方法为透过磁力分离血液样本中的干细胞。
15.优选地，上述干细胞为cd34
+
人造血干细胞。
16.在一优选的实施方案中，巨核细胞分化培养基包含人血小板生成素和干细胞因子。
17.优选地，巨核细胞分化培养基由sfem培养基、50-100μg/ml人血小板生成素(human thrombopoietin,htpo)、50μg/ml干细胞因子(stem cell factor,scf)组成。
18.更优选地，巨核细胞分化培养基包含sfem培养基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干细胞因子组成。
19.优选地，巨核细胞分化培养基还包含rock抑制剂。
20.更优选地，上述rock抑制剂为y-27632。
21.更优选地，巨核细胞分化培养基包含10μm y-27632。
22.在一优选的实施方案中，血小板成熟培养基包含its、谷氨酰胺(glutamax)、硫代甘油(monothioglycerol)、抗坏血酸(ascorbic acid)、fbs、青链霉素(penicillin-streptomycin，ps)、肝素(heparin)、人血小板生成素(human thrombopoietin,htpo)、rock抑制剂、adam17抑制剂、ahr拮抗剂。
23.优选地，血小板成熟培养基包含imdm培养基(iscove modified dulbecco medium,imdm)、1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗坏血酸、15％fbs、1
×
青链霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μmkp-457和0.75μm sr-1。
24.本发明还提供一种分化培养基，上述分化培养基包含sfem培养基、50-100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干细胞因子。
25.优选地，上述分化培养基包含sfem培养基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干细胞因子。
26.更优选地，上述分化培养基还包含rock抑制剂。
27.更优选地，上述rock抑制剂为y-27632。
28.另一方面，本发明提供一种成熟培养基，上述成熟培养基包含胰岛素-转铁蛋白-硒、谷氨酰胺、硫代甘油、抗坏血酸、fbs、青链霉素、肝素、人血小板生成素、rock抑制剂、adam17抑制剂、ahr拮抗剂。
29.优选地，上述成熟培养基包含imdm培养基、1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗坏血酸、15％fbs、1
×
青链霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
30.本发明提供大规模制备血小板的步骤：
31.首先，将孵育好的人脐血干细胞加入聚苯乙烯管中，并将该管置于磁极进行分离，去除上清液，重复该步骤三次即可得到纯度高的造血干细胞特定亚(cd34
+
)。
32.接着，将高纯度的cd34
+
造血干细胞进行体外增殖培养，得到大量的高纯度cd34
+
造血干细胞，利于得到大量的巨核细胞。
33.将上述得到的cd34
+
造血干细胞种于巨核细胞分化培养基。在一些实施方式中，巨核细胞分化培养基为在sfem培养基中加入50-100μg/ml人血小板生成素与50μg/ml干细胞因子；亦可加入10μm y-27632，以减少细胞凋亡。利用该巨核细胞分化培养基培养11天可获得最高产量的巨核细胞。
34.其后将巨核细胞的培养基更换为血小板成熟培养基，以促进血小板的成熟，在一些实施方式中，其中使用优化的成熟培养基，其内容为imdm培养基中加入1
×
its、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗坏血酸、15％高过滤fbs、1
×
青链霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
35.血小板培养过程可将培养基水平摇震，摇动速度90rpm，并置于摄氏37度、5％co2的环境；抑或可对细胞进行搅拌培养，搅拌速度100rpm，并置于摄37度、5％co2的环境。培养血小板6-12天后，离心收集、检测成熟的血小板。
36.与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
37.1.从血液样本中分离出干细胞亚cd34
+
，使得起始细胞纯度更高，以更好实现下游分化，如巨核细胞的分化。
38.2.优化的巨核细胞分化培养基，能够保证产生更高质量和纯度的巨核细胞，利于血小板的产量与纯度。
39.3.优化的血小板成熟培养基，以此提高血小板的分化效率。
附图说明
40.构成本技术的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成本发明的不当限定。在附图中：
41.图1是表示体外制备血小板的流程。从脐血中通过磁力分选cd34
+
hpc作为起始细胞，之后诱导hpc分化为巨核细胞，在优化的成熟培养基作用下，将巨核细胞进一步成熟产生血小板。
42.图2是表示检测分化血小板的体外凝集功能结果。从体外分化的血小板，在cacl2、adp和纤维蛋白原(fibrinogen)存在的条件下，可形成交织的网状结构，且随着cacl2的浓度增加，交织效果越充分。
具体实施方式
43.以下结合附图与具体实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护内容不局限于以下实施例。还应该理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求及其任何等同物为本发明的保护范围。
44.本文中使用的所有技术和科学术语具有被本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。在其他情况下，本文使用的某些术语会在说明书中阐明其含义。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识。本技术中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
45.在本发明的说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，均为本领域技术人员的普遍知识和公知常识，或按照制造厂商所建议的条件。如无特别说明，实施例所用的所有材料和试剂均为市售产品。
46.通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施
例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
47.本发明旨在提供一种大规模制备血小板的方法，通过人脐血分离获得cd34
+
造血干细胞，并通过造血干细胞的增殖扩大起始细胞的数量，之后进一步使用优化的巨核细胞分化及血小板成熟培养基，以及血小板生成的物理条件，建立高纯度、高产量与高分化效率的血小板体外制备的方法。
48.实施例1：人脐血造血干细胞特定亚(cd34
+
hpc)的分离纯化
49.1)采集脐血于抗凝管中并混匀，室温短暂保存或运输；
50.2)于无菌环境下将脐血收集于50ml离心管中，最大收集量为17ml；
51.3)按照5μl/ml脐带血的比例，将rosettesep cocktail(stemcell,#17897)加入脐血中，混匀并室温孵育10分钟；
52.4)加入等体积稀释缓冲液(sb buffer：pbs中加入2％fbs和1mm edta)并混匀；
53.5)在50ml sepmate
tm-50(stemcell，386450-1)中加入15ml密度梯度离心液lymphoprep(stemcell，#07801)，然后将上一步稀释后的脐血倒入；
54.6)1200g，10分钟离心，分层后将上层液体快速倒入新的50ml离心管中；
55.7)用sb buffer将此离心管加满；
56.8)300g，10分钟离心，小心去除上清液，并加入0.5ml sb buffer悬浮细胞；
57.9)将细胞加入12
×
75mm 5ml圆底聚苯乙烯管中；
58.10)按照100μl/ml的比例加入selection cocktail(stemcell,#17897)，混匀于室温孵育10分钟；
59.11)按照50μl/ml的比例加入rapidspheres(stemcell,#17897)，混匀并于室温孵育1分钟；
60.12)加入适量sb buffer，使得终体积为2.5ml；
61.13)将聚苯乙烯管置于磁极(stemcell，#18000)中，室温放置3分钟以分离细胞，之后去除上清并再次加入适量sb buffer，使得终体积为2.5ml；
62.14)再重复步骤13)三次；
63.15)将细胞转移至新的15ml离心管中，300g离心10分钟，低降速，之后去除上清；
64.16)用250μl sefm培养基(stemcell，#09650)悬浮细胞并计数。
65.实施例2：cd34
+
hpc的体外培养及扩增
66.1)按照每2ml扩增培养基加入2
×
104个细胞的比例将细胞种于低吸附6孔板中，于摄氏37度，5％co2下培养，每2-3天换液一次，每次更换3/4的新鲜扩增培养基；
67.2)扩增培养基：sfem培养基中加入1/10体积的stemspan
tm
扩增添加物(stemcell，#02691)；
68.3)细胞在扩增培养基中进行培养，约3天传代一次，每次按照1:5比例进行离心(1000rpm，5分钟，常温)传代。从使用扩增培养基开始计算，总体扩增时间不超过12天；
69.4)每两天对细胞进行计数，以记录细胞的倍增曲线；
70.5)对细胞进行cd34(bd biosciences，340669)和/或cd45(bdpharmingen，555482)染，通过流式细胞分析或免疫荧光实验以确定cd34
+
hpc的比例。
71.实施例3：人脐血来源血小板的制备
72.3.1巨核细胞的分化：
73.按照每2ml分化培养基加入5
×
105个细胞的比例将cd34
+
hpc种于低吸附6孔板中，于摄氏37度，5％co2下培养，每2-3天换液一次，每次更换3/4的新鲜分化培养基。
74.分化培养基：sfem培养基中加入50μg/ml人血小板生成素(human thrombopoietin，htpo；peprotech,300-18)和50μg/ml干细胞因子(stem cell factor，scf；peprotech,300-07)。
75.优化方法一：分化培养基中人血小板生成素的含量升高至100μg/ml，可提高巨核细胞分化效率。
76.优化方法二：分化培养基中加入10μm y-27632(selleck,s1049)，可减少凋亡细胞数量。
77.3.2巨核细胞的检测：
78.从使用分化培养基开始计算，巨核细胞总分化时间至11天左右时可达到最高产量，其纯度可以对细胞进行cd41a(bd pharmingen,555467)和cd42b(bd pharmingen,555472)染后，进行流式细胞分析或免疫荧光实验以确定。
79.3.3血小板的成熟：
80.将巨核细胞的培养基更换为成熟培养基，以促进血小板的成熟，一般在更换成熟培养基6-12天后进行血小板的收集和功能检测。
81.成熟培养基：iscove modified dulbecco medium(imdm；thermofisher,12440053)中加入1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒(its，insulin-transferrin-selenium)(thermofisher，41400045)、1
×
谷氨酰胺(glutamax；thermofisher,35050-061)、0.45mm硫代甘油(monothioglycerol,sigma,m6145)、50g/ml抗坏血酸(ascorbic acid,sigma,a4544)、15％高过滤(highly filtered)的fbs(gibico,10100147)，1
×
青链霉素(penicillin-streptomycin)(thermofisher,15140122)、10u/ml肝素(heparin；stemcell,#07980)、50μg/ml人血小板生成素(htpo)、10μm y-27632，15μm kp-457(mce,hy-110397)、0.75μm sr-1(merck millipore,182706)。
82.优化方法一：更换成熟培养基后，将细胞放置于水平摇床上进行摇震培养，转速90rpm，摄氏37度，5％co2；此方法成熟效率高于静置培养。
83.优化方法二：更换成熟培养基后，将细胞放置于50ml离心管中，总培养体系20ml，加入搅拌桨(十字形，4叶，叶宽0.8cm)对细胞进行搅拌培养，搅拌速度100rpm，摄氏37度，5％co2；此方法血小板的成熟效率最高。
84.实施例4：血小板的体外凝集功能检测
85.通过两步离心法(800rpm，5分钟收集上清，上清再次2500rpm离心10分钟后收集沉淀)收集成熟的血小板。对血小板计数后进行体外凝集功能检测：每100μl反应体系中，加入1-100
×
105血小板，1-10mm cacl2，10μm adp(sigma，a2754-500mg)和10μg/ml纤维蛋白原(fibrinogen；sigma，f3879-100mg)，pbs补齐至100μl。吹打混匀后放入摄氏37度培养箱进行反应，在反应0小时和24小时对细胞进行显微拍照记录(结果见图2)，结果显示在cacl2、adp和纤维蛋白原(fibrinogen)存在的条件下，可形成交织的网状结构，且随着cacl2的浓度增加，交织效果越充分。
86.本发明提及的所有文献都在本技术中全文引用作为参考。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价
形式的修改同样落于本技术权利要求书所限定的范围。
技术特征：
1.一种体外制备血小板的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离纯化血液样本中的干细胞；2)于巨核细胞分化培养基中培养；3)更换为血小板成熟培养基；4)收集成熟的血小板。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血液样本为人脐带血。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分离纯化步骤为透过磁力分离血液样本中的干细胞。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞为cd34
+
人造血干细胞。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞分化培养基包含人血小板生成素和干细胞因子。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞分化培养基包含sfem培养基、50-100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干细胞因子。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞分化培养基包含sfem培养基、100μg/ml人血小板生成素、50μg/ml干细胞因子。8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述巨核细胞分化培养基包含rock抑制剂。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述rock抑制剂为y-27632。10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血小板成熟培养基包含胰岛素-转铁蛋白-硒、谷氨酰胺、硫代甘油、抗坏血酸、fbs、青链霉素、肝素、人血小板生成素、rock抑制剂、adam17抑制剂、ahr拮抗剂。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述血小板成熟培养基包含imdm培养基、1
×
胰岛素-转铁蛋白-硒、1
×
谷氨酰胺、0.45mm硫代甘油、50g/ml抗坏血酸、15％fbs、1
×
青链霉素、10u/ml肝素、50μg/ml人血小板生成素、10μm y-27632、15μm kp-457、0.75μm sr-1。
技术总结
本发明提供一种通过体外细胞培养体系制备血小板的方法。该方法涉及分离纯化人脐带血，进而得到人类造血干细胞亞(CD34
