一种
一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法
技术领域
1.本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法。
背景技术：
2.目前，虽已在牡丹多种外植体培养中诱导出了愈伤组织，但不同基因型和外植体诱导成功率存在极大差异。近年来，愈伤组织诱导和增殖方法已较为成熟，主要的瓶颈问题之一是愈伤组织难以分化出健康的不定芽，而组织培养体系建立的最主要环节在于愈伤组织再分化过程。当前，大量研究仍以鳞芽为外植体这一直接器官发生途径来实现植株再生，通过体胚发生途径实现牡丹离体再生少有报道。有研究表明，诱导愈伤组织体胚发生进而再分化形成的再生植株可保持母株优良性状。
3.‘
凤丹’(paeonia ostiit.hong et j.x.zhang)因其籽油品质高成为目前新兴的木本油料植物之一。分株、嫁接等传统的繁殖方法，不能满足市场对优质牡丹种苗的需求。截至目前，
‘
凤丹’牡丹尚未建立起成熟稳定的组织培养体系，关键技术瓶颈之一是愈伤组织分化率低。因此，加快牡丹组织培养技术的研究，提高愈伤组织分化率，有利于牡丹快速育苗，保存母株的优良性状，为分子生物学育种研究提供基础。
技术实现要素：
4.本发明的目的在于提供一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法。本发明选用
‘
凤丹’无菌苗的子叶为外植体，配合优化组织培养方式，诱导体细胞胚再分化不定芽，可提高不定芽分化率，加快
‘
凤丹’牡丹快速育苗进程。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
6.本发明提供了一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法，包括如下步骤：
7.(1)取经浸泡、去皮、消毒处理后的
‘
凤丹’牡丹种子的种胚，接种于无菌苗诱导培养基，诱导培养，得到无菌苗；
8.(2)取所述无菌苗的子叶接入体细胞胚诱导培养基，诱导培养，得到体细胞胚；
9.(3)将所述体细胞胚接入再分化诱导培养基，诱导培养，得到不定芽。
10.优选的，步骤(1)中所述无菌苗诱导培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l，琼脂5～8g/l，naa 0.5～1.0mg/l，6-ba 0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l，所述无菌苗诱导培养基的ph值为5.8～6.0。
11.优选的，步骤(2)中所述体细胞胚诱导培养基以msb培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，所述体细胞胚诱导培养基的ph值5.8～6.0。
12.优选的，步骤(3)中所述再分化诱导培养基为以ms培养基、wpm培养基或mbp培养基为基础培养基。
13.优选的，所述以ms培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l，ph值为5.8～6.0。
14.优选的，以wpm培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l，ph值为5.8～6.0。
15.优选的，以mbp培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l，ph值为5.8～6.0。
16.优选的，步骤(1)～(3)中所述诱导培养的条件为：先进行暗培养，再进行光照培养；所述诱导培养的温度独立为24～25℃，相对湿度独立为85％～95％；所述光照培养的强度独立为2000～3000lx，光照周期独立为14～18h/d。
17.优选的，步骤(1)中所述诱导培养的总时间为4～5周；步骤(2)中所述诱导培养的总时间为3～4周；步骤(3)中所述诱导培养的总时间为3～4周；其中，步骤(1)～(3)的暗培养时间独立为5～10d。
18.本发明提供了一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法。本发明以无菌苗的子叶为外植体诱导愈伤组织形成体细胞胚，缩短了
‘
凤丹’牡丹愈伤组织脱分化培养时间，加速不定芽的形成，在诱导体细胞胚再分化的培养过程中，改变基础培养基，发现ms培养基对诱导体细胞胚不定芽分化具有显著效果，提高了
‘
凤丹’牡丹体细胞胚分化效率；改变基础培养基后，去掉外源激素的添加，大大增强了体细胞胚不定芽分化效率，为提高
‘
凤丹’牡丹体细胞胚不定芽发生的研究提供良好的技术体系，为
‘
凤丹’牡丹组织培养体系建立提供了可靠的技术支持。
附图说明
19.图1为实施例1，体细胞胚接入再分化诱导培养基4周后分化的不定芽。
20.图2为实施例2，体细胞胚接入再分化诱导培养基4周后分化的不定芽。
21.图3为实施例3，体细胞胚接入再分化诱导培养基4周后分化的不定芽。
22.图4为实施例1、2、3的不定芽诱导培养结果数据对比统计图，其中wpm为实施例1，mbp为实施例2，ms为实施例3。
具体实施方式
23.本发明提供了一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法，包括如下步骤：
24.(1)取经浸泡、去皮、消毒处理后的
‘
凤丹’牡丹种子的种胚，接种于无菌苗诱导培养基，诱导培养，得到无菌苗；
25.(2)取所述无菌苗的子叶接入体细胞胚诱导培养基，诱导培养，得到体细胞胚；
26.(3)将所述体细胞胚接入再分化诱导培养基，诱导培养，得到不定芽。
27.本发明取经浸泡、去皮、消毒处理后的
‘
凤丹’牡丹种子的种胚，接种于无菌苗诱导培养基，诱导培养，得到无菌苗。
28.在本发明中，所述
‘
凤丹’牡丹种子优选选取当年8月份新收取的，经过后熟后的种子。
29.在本发明中，所述浸泡优选使用蒸馏水。
30.在本发明中，所述浸泡的时间优选为24～48h，进一步优选为36h。
31.在本发明中，所述消毒优选为在超净工作台内进行。
32.在本发明中，所述消毒处理的方法优选用紫外灯照射20～30min，通风5～10min，再使用75％医用酒精浸泡10～30s后无菌水涮洗2～3次，然后用0.1％的浸泡5～10min后再以无菌水涮洗3～8次；进一步优选用紫外灯照射30min，通风10min，再使用75％医用酒精浸泡20s后无菌水涮洗3次，然后用0.1％的浸泡8min后再以无菌水涮洗6次。
33.在本发明中，所述无菌苗诱导培养基以ms培养基为基础培养基，优选包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l，琼脂5～8g/l，naa 0.5～1.0mg/l，6-ba0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l；进一步优选包括以下浓度的组分：蔗糖22～30g/l，琼脂6～8g/l，naa 0.6～0.9mg/l，6-ba 1.0～1.5mg/l和活性炭1.0～1.5mg/l；再进一步优选包括以下浓度的组分：蔗糖30g/l，琼脂6.8g/l，naa 0.8/mg/l，6-ba 1.4mg/l和活性炭1.0mg/l。
34.在本发明中，所述无菌苗诱导培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.9。
35.在本发明中，所述诱导培养的条件优选为先进行暗培养，再进行光照培养。
36.在本发明中，所述诱导培养的温度优选为24～25℃，进一步优选为25℃。
37.在本发明中，所述诱导培养的相对湿度优选为85％～95％，进一步优选为90％。
38.在本发明中，所述诱导培养的总时间优选为4～5周，进一步优选为4周；
39.在本发明中，所述暗培养的时间优选为5～10d，进一步优选为7d。
40.在本发明中，所述光照培养的强度优选为2000～3000lx，进一步优选为2500lx。
41.在本发明中，所述光照培养的光照周期优选为14～18h/d，进一步优选为16h/d。
42.本发明诱导培养得到无菌苗后，取所述无菌苗的子叶接入体细胞胚诱导培养基，诱导培养，得到体细胞胚。
43.在本发明中，所述接入前，优选将无菌苗和体细胞胚诱导培养基带入超净工作台进行消毒处理。
44.在本发明中，所述消毒处理优选为用紫外灯照射20～30min，再通风5～10min；进一步优选用紫外灯照射30min，再通风10min。
45.在本发明中，所述无菌苗的子叶接入体细胞胚诱导培养基前，优选切取1/3～5/6部分，在其背部划2～3处切口；进一步优选切取2/3部分，在其背部划3处切口。
46.在本发明中，所述体细胞胚诱导培养基以msb培养基为基础培养基，优选包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，进一步优选包括以下浓度的组分：蔗糖22～30g/l、琼脂6～8g/l、tdz 0.3～0.6mg/l、2,4-d 0.5～0.8mg/l；再进一步优选包括以下浓度的组分：蔗糖30g/l、琼脂6.8g/l、tdz 0.3mg/l、2,4-d 0.7mg/l。
47.在本发明中，所述体细胞胚诱导培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.9。
48.在本发明中，所述诱导培养的条件优选为先进行暗培养，再进行光照培养。
49.在本发明中，所述诱导培养的温度优选为24～25℃，进一步优选为25℃。
50.在本发明中，所述诱导培养的相对湿度优选为85％～95％，进一步优选为90％。
51.在本发明中，所述诱导培养的总时间优选为3～4周，进一步优选为3周；
52.在本发明中，所述暗培养的时间优选为5～10d，进一步优选为7d。
53.在本发明中，所述光照培养的强度优选为2000～3000lx，进一步优选为2500lx。
54.在本发明中，所述光照培养的光照周期优选为14～18h/d，进一步优选为16h/d。
55.本发明诱导培养得到体细胞胚后，将所述体细胞胚接入再分化诱导培养基，诱导培养，得到不定芽。
56.在本发明中，所述接入前，优选将体细胞胚和再分化诱导培养基带入超净工作台进行消毒处理。
57.在本发明中，所述消毒处理优选为用紫外灯照射20～30min，再通风5～10min；进一步优选用紫外灯照射30min，再通风10min。
58.在本发明中，所述再分化诱导培养基优选为以ms培养基、wpm培养基或mbp培养基为基础培养基。
59.在本发明中，所述再分化诱导培养基以ms培养基为基础培养基时，优选包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l；进一步优选包括以下浓度的组分：蔗糖30g/l、琼脂6.8g/l。
60.在本发明中，所述再分化诱导培养基以wpm培养基为基础培养基时，优选包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l；进一步优选包括以下浓度的组分：琼脂6～8g/l、蔗糖22～30g/l，tdz 0.3～0.6mg/l、2,4-d 0.4～0.8mg/l；再进一步优选包括以下浓度的组分：琼脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.4mg/l、2,4-d 0.6mg/l。
61.在本发明中，所述再分化诱导培养基以mbp培养基为基础培养基时，优选包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l；进一步优选包括以下浓度的组分：琼脂6～8g/l、蔗糖22～30g/l，tdz 0.4～0.8mg/l、2,4-d 0.4～0.6mg/l；再进一步优选包括以下浓度的组分：琼脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.6mg/l、2,4-d 0.5mg/l。
62.在本发明中，所述再分化诱导培养基的ph值优选为5.8～6.0，进一步优选为5.9。
63.在本发明中，所述诱导培养的条件优选为先进行暗培养，再进行光照培养。
64.在本发明中，所述诱导培养的温度优选为24～25℃，进一步优选为25℃。
65.在本发明中，所述诱导培养的相对湿度优选为85％～95％，进一步优选为90％。
66.在本发明中，所述诱导培养的总时间优选为3～4周，进一步优选为4周；
67.在本发明中，所述暗培养的时间优选为5～10d，进一步优选为7d。
68.在本发明中，所述光照培养的强度优选为2000～3000lx，进一步优选为2500lx。
69.在本发明中，所述光照培养的光照周期优选为14～18h/d，进一步优选为16h/d。
70.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
71.实施例1
72.本发明提供了一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法，具体操作如下：
73.选取当年8月份新收取的经过后熟后的
‘
凤丹’牡丹种子，将颗粒饱满的健康成熟种子剥去种皮，蒸馏水浸泡36h，备用。将浸泡后的去皮种子带进超净工作台，用紫外灯照射30min，通风10min，再使用75％医用酒精浸泡20s后无菌水涮洗3次，然后用0.1％的浸
泡8min后再以无菌水涮洗6次，备用。取消毒后的种子切取种胚，接种于无菌苗诱导培养基。无菌苗诱导培养基以ms培养基为基础培养基，其中包括：蔗糖30g/l，琼脂6.8g/l，naa 0.8mg/l，6-ba 1.4mg/l和活性炭1.0mg/l，ph值调整至5.9。
74.将接种后的无菌苗诱导培养基转移至组培室，设置组培室的温度为25℃，相对湿度控制为90％。先进行7d的暗培养，暗培养结束后，调整光照强度为2500lx，光照周期为16h/d，继续培养至4周，得到无菌苗。
75.将无菌苗的子叶为外植体进行体细胞胚发生的诱导，将无菌苗和体细胞胚诱导培养基带入超净工作台，紫外灯照射30min，通风10min，将转接工具用酒精灯灼烧等待降温后，将无菌苗子叶切取2/3部分，在其背部划3处切口，转接至体细胞胚诱导培养基。体细胞胚诱导培养基以msb培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖30g/l、琼脂6.8g/l、tdz 0.3mg/l、2,4-d 0.7mg/l，ph值调整至5.9。
76.将接种后的体细胞胚诱导培养基转移至组培室，设置组培室的温度为25℃，相对湿度控制为90％。先进行7d的暗培养，暗培养结束后，调整光照强度为2500lx，光照周期为16h/d，继续培养至3周，得到体细胞胚。
77.将体细胞胚和再分化诱导培养基带入超净工作台，紫外灯照射30min，通风10min，将体细胞胚转接至再分化诱导培养基。再分化诱导培养基以wpm培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：琼脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.4mg/l、2,4-d 0.6mg/l，ph值调整至5.9。
78.将接种后的再分化诱导培养基转移至组培室，设置组培室的温度为25℃，相对湿度控制为90％。先进行7d的暗培养，暗培养结束后，调整光照强度为2500lx，光照周期为16h/d，继续培养至4周，得到不定芽。诱导培养得到的不定芽如图1所示。
79.实施例2
80.取实施例1诱导培养得到的体细胞胚，与再分化诱导培养基一起带入超净工作台，紫外灯照射30min，通风10min，将体细胞胚转接至再分化诱导培养基。再分化诱导培养基以mbp培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：琼脂6.8g/l、蔗糖30g/l，tdz 0.6mg/l、2,4-d 0.5mg/l，ph值调整至5.9。
81.将接种后的再分化诱导培养基转移至组培室，设置组培室的温度为25℃，相对湿度控制为90％。先进行7d的暗培养，暗培养结束后，调整光照强度为2500lx，光照周期为16h/d，继续培养至4周，得到不定芽。诱导培养得到的不定芽如图2所示。
82.实施例3
83.取实施例1诱导培养得到的体细胞胚，与再分化诱导培养基一起带入超净工作台，紫外灯照射30min，通风10min，将体细胞胚转接至再分化诱导培养基。再分化诱导培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖30g/l、琼脂6.8g/l，ph值调整至5.9。
84.将接种后的再分化诱导培养基转移至组培室，设置组培室的温度为25℃，相对湿度控制为90％。先进行7d的暗培养，暗培养结束后，调整光照强度为2500lx，光照周期为16h/d，继续培养至4周，得到不定芽。诱导培养得到的不定芽如图3所示。
85.将实施例1～3的不定芽分化结果进行对比，如图4所示。从图4可以看出，实施例1～3的不定芽分化率均达15％以上。其中，实施例2的不定芽分化率可达30％以上，实施例3的不定芽分化率更是高达44.75％。
86.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人
员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
技术特征：
1.一种
‘
凤丹’牡丹体细胞胚再分化生成不定芽的诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)取经浸泡、去皮、消毒处理后的
‘
凤丹’牡丹种子的种胚，接种于无菌苗诱导培养基，诱导培养，得到无菌苗；(2)取所述无菌苗的子叶接入体细胞胚诱导培养基，诱导培养，得到体细胞胚；(3)将所述体细胞胚接入再分化诱导培养基，诱导培养，得到不定芽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述无菌苗诱导培养基以ms培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l，琼脂5～8g/l，naa0.5～1.0mg/l，6-ba 0.8～2.0mg/l和活性炭0.5～2.0mg/l，所述无菌苗诱导培养基的ph值为5.8～6.0。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述体细胞胚诱导培养基以msb培养基为基础培养基，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l、tdz 0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.4～1.0mg/l，所述体细胞胚诱导培养基的ph值为5.8～6.0。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述再分化诱导培养基为以ms培养基、wpm培养基或mbp培养基为基础培养基。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述以ms培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：蔗糖20～30g/l、琼脂5～8g/l，ph值为5.8～6.0。6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以wpm培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz0.1～0.8mg/l、2,4-d 0.2～1.0mg/l，ph值为5.8～6.0。7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以mbp培养基为基础培养基时，包括以下浓度的组分：琼脂5～8g/l、蔗糖20～30g/l，tdz0.2～1.0mg/l、2,4-d 0.2～0.8mg/l，ph值为5.8～6.0。8.根据权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于，步骤(1)～(3)中所述诱导培养的条件为：先进行暗培养，再进行光照培养；所述诱导培养的温度独立为24～25℃，相对湿度独立为85％～95％；所述光照培养的强度独立为2000～3000lx，光照周期独立为14～18h/d。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述诱导培养的总时间为4～5周；步骤(2)中所述诱导培养的总时间为3～4周；步骤(3)中所述诱导培养的总时间为3～4周；其中，步骤(1)～(3)的暗培养时间独立为5～10d。
技术总结
本发明提供了一种
