用非岩藻糖基化抗CD70抗体癌症的方法与流程

用非岩藻糖基化抗CD70抗体癌症的方法与流程

用非岩藻糖基化抗cd70抗体癌症的方法
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年12月30日提交的美国临时申请号62/954,904和2020年4月17日提交的美国临时申请号63/011,906的优先权，将所述申请的每一个的内容通过引用以其整体并入本文。ascii文本文件序列表的提交
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技术领域
3.本发明涉及使用非岩藻糖基化抗cd70抗体诸如包括骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓系白血病(aml)在内的髓系恶性肿瘤等癌症的方法。

背景技术：

4.cd70是由多种正常和恶性细胞类型表达的细胞膜结合且分泌的分子的肿瘤坏死因子(tnf)家族的成员。cd70的一级氨基酸(aa)序列预测跨膜ii型蛋白其羧基末端暴露于细胞外部且其氨基末端位于质膜的胞质侧内(bowman等人,1994,j.immunol.152:1756-61；goodwin等人,1993,cell 73:447-56)。人cd70由20个aa的细胞质结构域、18个aa的跨膜结构域和155个aa的细胞质外结构域构成，具有两个潜在的n连接糖基化位点(bowman等人,同上；goodwin等人,同上)。放射性同位素标记的表达cd70的细胞用抗cd70抗体特异性免疫沉淀产生29和50kda的多肽(goodwin等人,同上；hintzen等人,1994,j.immunol.152:1762-73)。基于其与tnf-α和tnf-β尤其是在结构链c、d、h和1中的同源性，预测cd70的三聚体结构(petsch等人,1995,mol.immunol.32:761-72)。
5.最初的免疫组织学研究揭示cd70在扁桃体、皮肤和肠道中的生发中心b细胞和罕见t细胞上表达(hintzen等人,1994,int.immunol.6:477-80)。随后，据报道cd70在最近被抗原激活的t和b淋巴细胞的细胞表面上表达，并且其表达在去除抗原刺激后减弱(lens等人,1996,eur.j.immunol.26:2964-71；lens等人,1997,immunology 90:38-45)。在淋巴系统中，激活的自然杀伤细胞(orengo等人,1997,clin.exp.immunol.107:608-13)和小鼠成熟外周树突细胞(akiba等人,2000,j.exp.med.191:375-80)也表达cd70。在非淋巴谱系中，已经在胸腺髓质上皮细胞上检测到cd70(hintzen等人,1994,同上；hishima等人,2000,am.j.surg pathol.24:742-46)。
6.cd70在正常的非造血细胞上不表达。cd70表达主要限于生理条件下新近被抗原激活的t和b细胞，并且当抗原刺激停止时其表达下调。来自动物模型的证据表明，cd70可促成免疫障碍，如类风湿性关节炎(brugnoni等人,1997,immunol.lett.55:99-104)、银屑病关节炎(brugnoni等人,1997,immunol.lett.55:99-104)、和狼疮(oelke等人,2004,arthritis rheum.50:1850-60)。除了其在炎症反应中的潜在作用外，cd70还在多种转化细
胞上表达，包括淋巴瘤b细胞、霍奇金细胞和里-施细胞(reed-sternberg cell)、神经起源的恶性细胞和多种癌。研究表明，来自急性髓系白血病(aml)和骨髓增生异常疾病(mds)患者的干细胞表达cd70及其受体cd27二者。这种配体-受体对之间的相互作用可以促进白血病原始细胞存活和增殖。
7.在哺乳动物宿主细胞中产生的单克隆抗体可以具有多种翻译后修饰，包括糖基化。单克隆抗体(如igg1)在每条重链(每个完整抗体有两条)的天冬酰胺297(asn297)处具有n连接的糖基化位点。与抗体上的asn297附接的聚糖典型地是复合双触角结构，其具有非常低或没有二分型n-乙酰葡糖胺(二分型glcnac)，具有少量的末端唾液酸和不同量的半乳糖。所述聚糖通常也具有高水平的核心岩藻糖基化。已显示抗体中核心岩藻糖基化的减少会改变fc效应子功能，特别是fcγ受体结合和adcc活性。这一观察结果引起了工程化细胞系的兴趣，因此它们产生了核心岩藻糖基化减少的抗体。
8.用于工程化细胞系以减少核心岩藻糖基化的方法包括基因敲除、基因敲入和rna干扰(rnai)。在基因敲除中，使编码fut8(α1,6-岩藻糖基转移酶)的基因失活。fut8催化岩藻糖残基从gdp-岩藻糖转移到n-聚糖的asn-连接的(n-连接的)glcnac的6位。据报道，fut8是唯一负责在asn297处将岩藻糖添加到n-连接的双触角碳水化合物的酶。基因敲入添加编码酶(如gntiii或高尔基体α甘露糖苷酶ii)的基因。细胞中此类酶水平的增加使单克隆抗体从岩藻糖基化途径转移(导致核心岩藻糖基化减少)，并且二分型n-乙酰葡糖胺的量增加。rnai典型地还靶向fut8基因表达，导致降低mrna转录物水平或完全敲除基因表达。
9.工程化细胞系的替代方案包括使用作用于糖基化途径中的酶的小分子抑制剂。抑制剂如栗精胺(catanospermine)在糖基化途径早期起作用，产生具有未成熟聚糖(例如，高水平的甘露糖)和低岩藻糖基化水平的抗体。通过此类方法产生的抗体通常缺乏与成熟抗体相关的复杂n连接聚糖结构。小分子岩藻糖类似物也可用于产生具有复杂n连接聚糖但具有降低的核心岩藻糖基化的重组抗体。
10.需要抗cd70抗体，如具有降低的核心岩藻糖基化的抗cd70抗体，其可以对cd70表达细胞发挥临床上有用的细胞毒性、细胞抑制或免疫调节作用，特别是对非cd70表达细胞不发挥不期望的作用。此类化合物将是针对表达cd70的癌症的有用剂。
11.髓系恶性肿瘤包括急性髓系白血病(aml)、骨髓增殖性障碍(mpds)、骨髓增生异常综合征(mds)和骨髓增生异常/骨髓增殖性综合征，它们都是克隆性干细胞(hsc)或祖细胞恶性障碍(tiu等人,leukemia,第21(8)卷,第1648-57页,2007)。
12.mds涵盖多种亚型，包括伴有单系发育异常的mds、伴有环形铁粒幼细胞的mds、伴有多系发育异常的mds、伴有过量原始细胞的mds、伴有分离的del(5q)的mds和不可分类的mds(arber等人,blood,第127卷,第2391-405页,2016)。mds的特征在于一种或多种骨髓谱系中的无效造血作用。早期mds主要展现出过度细胞凋亡和造血细胞发育异常(claessens等人,blood,第99卷,第1594-601页,2002；clasessens等人,blood,第105卷,第4035-42页,2005)。在约三分之一的mds患者中，这种无效的造血作用之后进展为继发性aml(saml)。尽管已经鉴定了与特定mds亚型(elbert等人,nature,第451(7176)卷,第335-9页,2008)或疾病转化(braun等人,blood,第107(3)卷,第1156-65页,2006)相关的一些分子事件，但是对潜在的分子缺陷仍然知之甚少。除形态学特征外，目前没有生物标记物可用于早期诊断和预后。
13.急性髓系白血病(aml)是白细胞髓系的恶性肿瘤。如果不的话，这种血瘀形成通常在数周至数月内是致命的血液和骨髓疾病。美国有30,000例aml，并且欧盟估计有47,000例aml(由mattson-jack确认的2010年患病率数据,2010)。aml是成人急性白血病的最普遍形式(约90％)并且含有约33％的新白血病病例。诊断为aml的患者的中位年龄为67岁。在美国，aml占癌症死亡的大约1.2％。
14.aml引起非特异性症状，如体重减轻、疲劳、发烧和盗汗。aml通过血液检查、骨髓检查和实验室检查来诊断以确定aml亚型并确定决策。
15.本文中引用的所有参考文献(包括专利申请、专利公开案和科学文献)都通过引用以其整体并入本文，如同每个单独的参考文献被明确地且单独地指示通过引用并入。

技术实现要素：

16.本文提供了一种受试者的表达cd70的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的非岩藻糖基化抗cd70抗体，其中所述方法导致所述受试者中癌细胞的耗竭，其中所述方法不导致所述受试者中cd70+t调节性细胞(cd70+treg)的耗竭，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，并且其中所述癌症选自骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓系白血病(aml)。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含含有与seq id no:1的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no:2的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，fc结构域是介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和补体依赖性细胞毒性(cdc)中的一种或多种的抗体效应子结构域。在一些实施方案中，fc结构域是介导adcc的抗体效应子结构域。在一些实施方案中，fc结构域是人fc结构域。在一些实施方案中，抗cd70抗体是沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)。在一些实施方案中，抗体与剂缀合。在一些实施方案中，剂是化疗剂或免疫调节剂。在一些实施方案中，剂是化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是一甲基澳瑞他汀e(mmae)或一甲基澳瑞他汀f(mmaf)。在一些实施方案中，所述方法包括施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中的每种抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，其中所述抗cd70抗体体中至少50％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少70％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少90％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，癌症是mds。在一些实施方案中，mds是复发性或难治性mds。在一些实施方案中，受试者在先前的针对mds的低甲基化剂(hma)疗法后经历了失败。在一些实施方案中，癌症是aml。在一些实施方案中，aml是复发性或难治性aml。在一些实施方案中，受试者接受了2种先前方案以aml。在一些实施方案中，受试者接受了3种先前方案以aml。在一些实施方案中，至少约0.1％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、
至少约60％、至少约70％或至少约80％的所述癌细胞表达cd70。在一些实施方案中，与向受试者施用非岩藻糖基化抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，向受试者施用非岩藻糖基化抗cd70抗体导致癌细胞耗竭至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些实施方案中，与向受试者施用无岩藻糖基化抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，向受试者施用非岩藻糖基化抗cd70抗体导致cd70+treg耗竭不超过约20％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或约0.1％。在一些实施方案中，在施用非岩藻糖基化抗cd70抗体之后，受试者中的一种或多种效果相对于基线得到改善。在一些实施方案中，所述一种或多种效果选自：客观反应率、反应持续时间、达到反应的时间、无进展存活期和总存活期。在一些实施方案中，客观反应率是至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。在一些实施方案中，在施用非岩藻糖基化抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用非岩藻糖基化抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的总存活期。在一些实施方案中，在施用非岩藻糖基化抗cd70抗体后，对抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年。在一些实施方案中，抗cd70抗体的施用途径是静脉内。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与阿扎胞苷组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与维奈妥拉组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与阿扎胞苷和维奈妥拉组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与氟喹诺酮组合施用。
17.本文还提供了一种用于表达cd70的癌症的药物组合物，所述组合物包含非岩藻糖基化抗cd70抗体和至少一种药学上相容的成分，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，其中所述组合物用于本文任何实施方案的方法中。
18.本文还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含非岩藻糖基化抗cd70抗体和在本文任何实施方案的方法中使用所述抗cd70抗体的说明书，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义。
19.应当理解，本文中所描述的各种实施方案的一种、一些或全部特性都可以组合以形成本发明的其他实施方案。本发明的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得清楚。
本发明的这些和其他实施方案由随后的具体实施方式进行进一步描述。
附图说明
20.本专利或申请文件包含至少一幅彩附图。在请求并支付必要的费用后，官方将会提供带有一幅或多幅彩附图的本专利或专利申请公开案的副本。
21.图1是sgn-70(岩藻糖基化h1f6)和sea-cd70(非岩藻糖基化h1f6)与各种fcγ受体结合的一系列感测图。图1中sgn-70标记为h1f6 wt，sea-cd70标记为h1f6 sea。使用生物层干涉测量法(bli)评估sgn-70和sea-cd70与fcγr i、iia、iiia、iib和fcrn的结合动力学和亲和力。
22.图2a-图2b是使用流式细胞术评估sgn-70和sea-cd70(在图2a-图2b中标记为sea-70)对高亲和力人fcγriiia受体(158v)(图2a)或食蟹猴fcγriiia受体(图2b)的结合的一系列图。
23.图3a-图3b是示出sgn-70和sea-cd70在两种cd70+aml细胞系molm-13(图3a)和nomo-1(图3b)中的adcc活性的一系列图。
24.图4a-图4d是评估sgn-70(在图4a-图4d中标记为sgn-cd70)和sea-cd70对来自高亲和力fcγriiia受体纯合型(v/v 158)或低亲和力fcγriiia受体纯合型(f/f 158)供体的细胞中的cd70+treg和cd8 t细胞的影响的一系列图。
25.图4e-图4h是评估岩藻糖基化(wt克隆13igg1)或非岩藻糖基化(sea克隆13igg1)抗tigit抗体对来自高亲和力fcγriiia受体纯合型(v/v158)或低亲和力fcγriiia受体纯合型(f/f158)供体的细胞中的treg和cd8 t细胞的影响的一系列图。
26.图5是在raji nhl伯基特淋巴瘤模型中评估用sea-cd70对随时间的动物存活百分比的影响的卡普兰-迈耶(kaplan-meyer)图。sea-cd70被标记为h1f6sea。
27.图6是评估h1f6sea、h1f6g1v1、h00sea和阿扎胞苷在mv-411急性髓系白血病模型中的抗肿瘤功效的图。sea-cd70被标记为h1f6sea。包含与sea-cd70相同的cdr但包含失活骨架突变的抗体被标记为h1f6g1v1。无岩藻糖基化人igg1同种型对照抗体被标记为h00sea。
28.图7a-图7d是评估h1f6sea、h00sea(无岩藻糖基化人igg1同种型对照抗体)、h1f6g1v1(包含与sea-cd70相同的cdr但包含失活骨架突变的抗体)和阿扎胞苷在mv-411急性髓系白血病模型中的抗肿瘤功效的一系列蜘蛛图。绘制每种条件的个体动物的肿瘤体积，并覆加于未组的中值肿瘤体积上。
29.图8a-图8b是评价sea-cd70和sgn-cd70介导的对aml细胞系的adcp活性的一系列图。所示数据表示阳性巨噬细胞相对于背景对照的百分比。
30.图9a-图9b是评价sea-cd70和sgn-cd70 cdc介导的对aml细胞系的cdc活性的一系列图。
31.图10是在mv411 aml异种移植小鼠模型中评价sea-cd70与阿扎胞苷的组合对肿瘤生长的影响的图。报告每个组的平均肿瘤体积(
±
sem)。对于每个组，绘制数据，直到每组中的第一只动物被处死以达到》1000mm3的肿瘤大小。
32.图11a-图11b是在mv411 aml异种移植小鼠模型中评价sea-cd70与阿扎胞苷
维奈妥拉(abt-199)或两者(阿扎胞苷+维奈妥拉)的组合对肿瘤生长的影响的一系列图。图11a：报告每个组的平均肿瘤体积(
±
sem)。对于每个组，绘制数据，直到每组中的第一只动物被处死以达到》1000mm3的肿瘤大小。图11b：对照、阿扎胞苷+维奈妥拉、和sea-cd70+阿扎胞苷+维奈妥拉组合(三重组合)的单个动物生长曲线。
具体实施方式
i.定义
33.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与所述方法和组合物所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。当本文使用商品名时，申请人意图独立地包括商品名产品配制品、仿制药品和商品名产品的一种或多种活物成分。如本文所用，除非另外说明，否则以下术语和短语具有赋予它们的含义。
34.术语“和/或”在用于本文的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语如“a和/或b”使用的术语“和/或”旨在包括“a和b”、“a或b”、“a”(单独)和“b”(单独)。同样地，如以短语如“a、b和/或c”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：a、b和c；a、b或c；a或c；a或b；b或c；a和c；a和b；b和c；a(单独)；b(单独)；以及c(单独)。
35.应理解，本文所述的本发明的方面和实施方案包括“包含多个方面和实施方案”、“由多个方面和实施方案组成”和“基本上由多个方面和实施方案组成”。
36.单位、前缀和符号以其国际单位制(si)认可的形式表示。数值范围包括定义所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考说明书作为整体而获得。因此，通过从整体上参考说明书，可以更全面地定义下面紧接着定义的术语。
37.如本文所用，术语“cd70结合剂”和“抗cd70结合剂”是指抗cd70抗体、抗cd70抗体的衍生物或片段、或结合cd70并包含cd70结合抗体或其衍生物的至少一个cdr或可变区的其他药剂。
38.术语“特异性结合”是指结合剂以高度选择性的方式与其相应的抗原反应，而不与多种其他抗原(例如，非cd70分子)反应。
39.如本文所用，在cd70结合剂的上下文中，术语“功能性”表示结合剂能够结合cd70。
40.如文中所用，术语“抑制(inhibit)”或“抑制(inhibition of)”意指减少可测量的量或完全防止。
41.在cd70结合剂对表达cd70的细胞的作用的上下文中，术语“耗竭”是指表达cd70的细胞的数量减少或消除。
[0042]“完整抗体”和“完整免疫球蛋白”在本文中定义为典型地约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两条相同的轻(l)链和两条相同的重(h)链构成。每条轻链通过二硫键与重链共价连接以形成异二聚体。异四聚体通过这样的异二聚体的两条相同重链之间的共价二硫连键形成。尽管轻链和重链通过二硫键连接在一起，但两条重链之间的二硫键数量随免疫球蛋白(ig)同种型而变化。每条重链和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在氨基末端具有可变结构域(vh)，随后是三个或四个恒定结构域(ch1、ch2、ch3和/或ch4)，以
及ch1和ch2之间的铰链(j)区。每条轻链具有两个结构域，氨基末端可变结构域(v
l
)和羧基末端恒定结构域(c
l
)。v
l
结构域与vh结构域非共价缔合，而c
l
结构域通常通过二硫键与ch1结构域共价连接。认为特定的氨基酸残基在轻链与重链可变结构域之间形成界面(chothia等人,1985,j.mol.biol.186:651-663)。
[0043]
术语“高变”是指可变结构域内的如下某些序列，它们在抗体之间在序列上有很大不同，并且含有直接参与每种特定抗体对其特异性抗原决定簇的结合和特异性的残基。轻链和重链可变结构域二者中的高变性集中在称为互补决定区(cdr)或高变环(hvl)的三个区段中。cdr由kabat等人,1991,于:sequences of proteins of immunological interest,第5版public health service,national institutes of health,bethesda,m.d.中的序列比较来定义；而hvl根据可变结构域的三维结构进行结构定义，如由chothia和lesk,1987,j.mol.biol.196:901-917所述。当这两种方法导致cdr的略微不同的鉴定时，优选结构定义。如kabat所定义(参见kabat等人,"sequences of proteins of immunological interest,第5版,出版号91-3242,u.s.dept.health&human services,nih,bethesda,m.d.,1991)，轻链可变结构域中cdr-l1位于约残基24-34处，cdr-l2位于约残基50-56处，cdr-l3位于约残基89-97处，并且重链可变结构域中cdr-h1位于约残基31-35处，cdr-h2位于约残基50-65处，cdr-h3位于约残基95-102处。
[0044]
每条重链和轻链中的三个cdr由框架区(fr)隔开，所述框架区含有倾向于变化较小的序列。从重链和轻链可变结构域的氨基末端到羧基末端，fr和cdr按以下顺序排列：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、和fr4。fr的大部分β折叠构型使每条链中的cdr彼此紧密接近以及与来自另一条链的cdr紧密接近。所得构型促成抗原结合位点(参见kabat等人,1991,nih出版号91-3242,第i卷,第647-669页)，但不是所有的cdr残基都必需直接参与抗原结合。
[0045]
fr残基和ig恒定结构域典型地不直接参与抗原结合，但可促成抗原结合或介导抗体效应子功能。一些fr残基可以以至少三种方式对抗原结合具有显著影响：通过非共价地直接结合表位，通过与一个或多个cdr残基相互作用，以及通过影响重链与轻链之间的界面。恒定结构域介导各种ig效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(adcc)、补体依赖性细胞毒性(cdc)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。
[0046]
基于恒定结构域的氨基酸序列，脊椎动物免疫球蛋白的轻链被指定为两个明显不同的类别(kappa(κ)和lambda(λ))中的一种。通过比较，根据恒定结构域的序列，哺乳动物免疫球蛋白的重链被指定为五个主要类别iga、igd、ige、igg和igm中的一种。igg和iga进一步分为亚类(同种型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。天然免疫球蛋白类别的亚基结构和三维构型是熟知的。
[0047]
术语“抗体”、“抗cd70抗体”、“人源化抗cd70抗体”和“变体人源化抗cd70抗体”在本文中以最广泛的意义使用，并且具体地涵盖全长和天然抗体、单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、以及抗体或其抗原结合片段，如展现出所需生物活性(例如cd70结合)的抗体的可变结构域和其他部分。
[0048]
术语“单克隆抗体”(mab)是指从基本上同质的抗体体获得的抗体；即，除了可能少量存在的天然存在的突变之外，构成体的单独抗体是相同的。单克隆抗体对单个抗原
决定簇(也称为表位)具有高度特异性。修饰语“单克隆”表示针对相同表位的基本上同质的抗体体，且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。单克隆抗体可以通过本领域已知的任何技术或方法制备；例如，等人,1975,nature 256:495首次描述的杂交瘤方法，或本领域已知的重组dna方法(参见，例如，美国专利号4,816,567)。在另一个例子中，单克隆抗体也可以使用clackson等人,1991,nature 352:624-628和marks等人,1991,j.mol.biol.222:581-597中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。
[0049]
相比之下，多克隆抗体制剂中的抗体典型地是免疫球蛋白同种型和/或类别的异质体，并且还展现出多种表位特异性。
[0050]
如本文所用，术语“嵌合”抗体是如下一类型的单克隆抗体，其中重链和/或轻链的一个或多个区域或结构域中的部分或完整氨基酸序列与来自另一物种或属于另一免疫球蛋白类别或同种型的单克隆抗体中的相应序列或来自共有序列的相应序列相同、同源，或前者是后者的变体。嵌合抗体包括此类抗体的片段，条件是该抗体片段展现出其亲本抗体的所需生物活性，例如与相同表位结合(参见例如美国专利号4,816,567；和morrison等人,1984,proc.natl.acad sci.usa 81:6851-6855)。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。(参见，例如，morrison,1985.science 229:1202；oi等人,1986,biotechniques4:214；gillies等人,1989,j.immunol.methods 125:191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816,397。)
[0051]
术语“抗体片段”、“抗cd70抗体片段”、“人源化抗cd70抗体片段”和“变体人源化抗cd70抗体片段”是指全长抗cd70抗体的一部分，其中保留了可变区或功能能力，例如特异性cd70表位结合。抗体片段的例子包括但不限于fab、fab’、f(ab’)2、fd、fv、scfv和scfv-fc片段、双抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体和由抗体片段形成的其他多特异性抗体。(参见holliger和hudson,2005,nat.biotechnol.23:1126-1136。)
[0052]“单链fv”或“scfv”抗体片段是包含抗体的vh和v
l
结构域的单链fv变体，其中这些结构域存在于单个多肽链中并且能够识别和结合抗原。scfv多肽任选地含有位于vh与v
l
结构域之间的多肽接头，其使得scfv形成抗原结合所需的三维结构(参见，例如，pluckthun,1994,the pharmacology of monoclonal antibodies,第113卷,rosenburg和moore编,springer-verlag,纽约,第269-315页)。
[0053]
术语“双抗体”是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段。每个片段含有与轻链可变结构域(v
l
)连接的重链可变结构域(vh)，以形成v
h-v
l
或v
l-vh多肽。通过使用太短而不能使得在同一链上的两个结构域之间配对的接头，连接的v
h-v
l
结构域被迫与另一条链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点。双抗体更全面地描述于例如ep 404097；wo 93/11161；和hollinger等人,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448中。
[0054]
术语“线性抗体”是指包含形成一对抗原结合区的一对串联fd区段(v
h-ch1-v
h-ch1)的抗体。线性抗体可以是双特异性或单特异性的，如zapata等人,1995,protein eng.8(10):1057-1062中所述。
[0055]“人源化抗体”是指免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其能够结合预定抗原并包含可变区多肽链，所述可变区多肽链具有基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的框架区和基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列的一个或多个cdr。
[0056]
总体上，人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非
人氨基酸残基在本文中称为“输入”残基，其典型地取自“输入”抗体结构域，特别是可变结构域。如本文所讨论，输入残基、序列或抗体具有所需的亲和力和/或特异性、或其他期望的抗体生物活性。
[0057]
通常，人源化抗体将基本上包含至少一个并且典型地两个可变结构域的全部，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白的那些cdr区，并且全部或基本上全部框架区是人免疫球蛋白序列(如来自例如共有序列或种系序列)的那些框架区。人源化抗体任选地还将包含(典型地是人免疫球蛋白的)免疫球蛋白fc结构域的至少一部分。例如，抗体可以含有轻链以及至少重链的可变结构域。适当时，抗体还可以包括重链的ch1、铰链(j)、ch2、ch3和/或ch4区。
[0058]
人源化抗体可选自任何类别的免疫球蛋白，包括igm、igg、igd、iga和ige，以及任何同种型，包括igg1、igg2、igg3和lgg4。恒定区或结构域可以包括例如补体结合恒定结构域，其中希望人源化抗体展现出细胞毒性活性(例如igg1)。当不需要这种细胞毒性活性时，恒定结构域可以是另一类别(例如igg2)。人源化抗体可以包含来自多于一种类别或同种型的序列，并且选择特定的恒定结构域以优化期望的效应子功能在本领域的普通技术范围内。
[0059]
人源化抗体的fr和cdr区不需要精确地对应于亲本序列，例如，可以通过取代、插入或缺失至少一个残基来改变输入cdr或共有fr，使得该位点的cdr或fr残基不对应于共有或输入抗体。此类突变通常不是广泛的。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本fr和cdr序列的那些残基，更通常至少90％，最通常大于95％。
[0060]
如本文所用，术语“一种或多种抗体效应子功能”是指由ig的一个或多个fc结构域贡献的功能。此类功能可以是例如抗体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞吞噬作用或补体依赖性细胞毒性。这种功能可通过例如一个或多个fc效应子结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的fc受体结合或通过一个或多个fc效应子结构域与补体系统的组分结合来实现。典型地，由fc结合细胞或补体组分介导的一种或多种作用导致cd70靶向细胞的抑制和/或耗竭。不预期受任何特定理论的束缚，抗体的fc区可以募集fc受体(fcr)表达细胞并将它们与抗体包被的靶细胞并列。表达针对igg的表面fcr(包括fcγriii(cd16)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd64))的细胞可以充当效应细胞以破坏igg包被的细胞。此类效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。fcγr由igg的接合激活抗体依赖性细胞毒性(adcc)或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。adcc由cd16
+
效应细胞通过膜孔形成蛋白和蛋白酶的分泌介导，而吞噬作用由cd32
+
和cd64
+
效应细胞介导(参见fundamental immunology,第4版,paul编,lippincott-raven,n.y.,1997,第3、17和30章；uchida等人,2004,j.exp.med.199:1659-69；akewanlop等人,2001,cancer res.61:4061-65；watanabe等人,1999,breast cancer res.treat.53:199-207)。除了adcc和adcp之外，细胞结合的抗体的fc区还可以激活补体经典途径来引发补体依赖性细胞毒性(cdc)。当抗体与抗原复合时，补体系统的c1q与抗体的fc区结合。c1q与细胞结合的抗体的结合可以引发涉及c4和c2的蛋白水解激活从而产生c3转化酶的一连串事件。c3转化酶将c3切割为c3b使得能够激活包括c5b、c6、c7、c8和c9在内的末端补体组分。总的来说，这些蛋白质在抗体包被的细胞上形成膜攻击复合物孔。这些孔破坏细胞膜完整性，从而杀伤靶细胞(参见immunobiology,第6版,janeway等人,garland science,n.y.,2005,第2章)。
[0061]
术语“抗体依赖性细胞毒性”或adcc是诱导细胞死亡的机制，其依赖于抗体包被的靶细胞与具有裂解活性的免疫细胞(也称为效应细胞)的相互作用。此类效应细胞包括自然杀伤细胞、单核细胞/巨噬细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞附接至ig的一个或多个fc效应子结构域，ig经由其抗原结合位点与靶细胞结合。抗体包被的靶细胞的死亡作为效应细胞活性的结果而发生。
[0062]
术语“抗体依赖性细胞吞噬作用”或adcp是指抗体包被的细胞被与ig的一个或多个fc效应子结构域结合的吞噬免疫细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)以整体或部分内化的过程。
[0063]
术语“补体依赖性细胞毒性”或cdc是指诱导细胞死亡的机制，其中靶标结合抗体的一个或多个fc效应子结构域激活一系列酶促反应，最终导致在靶细胞膜上形成孔。典型地，抗原-抗体复合物(如抗体包被的靶细胞上的那些)结合并激活补体组分c1q，其转而激活补体级联，从而导致靶细胞死亡。补体的激活还可导致补体组分沉积在靶细胞表面上，所述补体组分通过结合白细胞上的补体受体(例如cr3)来促进adcc。
[0064]
如本文所用，“免疫细胞”是指参与调节免疫应答的造血谱系细胞。在典型的实施方案中，免疫细胞是t淋巴细胞、b淋巴细胞、nk细胞、单核细胞/巨噬细胞或树突细胞。
[0065]
如本文所用，“效应细胞”是指表达免疫球蛋白的fc结构域的表面受体(fcr)的细胞。例如，表达包括fcγriii(cd16)、fcγrii(cd32)和fcγriii(cd64)在内的igg的表面fcr的细胞可作为效应细胞。此类效应细胞包括单核细胞、巨噬细胞、自然杀伤(nk)细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
[0066]“剂”是对癌细胞、激活的免疫细胞或其他靶细胞体发挥细胞毒性、细胞抑制和/或免疫调节作用的药剂。剂的例子包括细胞毒性剂、化疗剂、细胞抑制剂和免疫调节剂。
[0067]“细胞毒性作用”是指对靶细胞的耗竭、消除和/或杀伤。“细胞毒性剂”是指对细胞具有细胞毒性作用的药剂。该术语旨在包括放射性同位素(如i
131
、i
125
、y
90
和re
186
)、化疗剂和毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素)及其片段。此类细胞毒性剂可与抗体(例如人源化抗cd70抗体)偶联，且用于例如被指示用所述抗体进行的患者。在一个实施方案中，“细胞毒性剂”包括单克隆抗体，例如与本文所述的人源化抗体组合使用的抗体。
[0068]“化疗剂”是可用于癌症的化合物。化疗剂的例子包括烷基化剂，如噻替派和环磷酰胺(cytoxan
tm
)；烷基磺酸酯，如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮杂环丙烷，如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替哌(meturedopa)和乌瑞替哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物拓扑替康)；苔藓抑素；海洋抑素(callystatin)；cc-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)和其衍生物；念珠藻素(特别是念珠藻素1和念珠藻素8)；多拉司他汀；澳瑞他汀类(包括类似物一甲基澳瑞他汀e和一甲基澳瑞他汀f(参见例如，2005年10月27日公开的美国公开申请号2005-0238649，其全部内容并入本文)；倍癌霉素(包括合成类似物、kw-2189和cbi-tmi)；艾榴塞
洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、盐酸氧化氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇(phenesterine)、松龙苯芥、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚，如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，如烯二炔抗生素(例如，卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γ1i和卡奇霉素参见例如，agnew,chem.intl.ed.engl.,33:183-186；达尼霉素(dynemicin)，包括达尼霉素a；双磷酸盐，如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素发团和相关的蛋白烯二炔抗生素发团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素d(actinomycin)、土霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c(cactinomycin)、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素(carzinophilin)、霉素(chromomycin)、更生霉素、道诺霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-l-正亮氨酸、多柔比星(adriamycin
tm
)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(如丝裂霉素c)、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培洛霉素(peplomycin)、泛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-fu)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷；雄激素，如卡普睾酮、丙酸甲雄烷酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺素，如氨鲁米特、米托坦、曲络司坦；叶酸补充剂，如叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶；安吖啶；贝斯布西(bestrabucil)；比生；依达曲酯(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌(diaziquone)；依法磷酸(elfornithine)；依利醋氨；埃博霉素；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(lonidamine)；类美登素，如美登素(maytansine)和安丝菌素；米托胍腙、米托蒽醌；莫哌达醇(mopidamol)；尼曲吖啶(nitracrine)；喷司他丁；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙酰肼；丙卡巴肼；丙亚胺；根霉素；西佐喃；锗螺胺(spirogermanium)；替奴佐酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；单端孢霉烯(trichothecenes)(尤其是t-2毒素、维拉库林a(verracurin a)、漆斑菌素a(roridin a)和胺癸叮(anguidine)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加息托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“ara-c”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(bristol-myers squibb oncology,普林斯顿，新泽西州)和多西他赛(-poulenc rorer,安东尼,法国)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemzar
tm
)；6-硫代鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(vp-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(navelbine
tm
)；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt-11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸(dmfo)；类视黄醇如视黄酸；卡培他
滨；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。该定义还包括用以调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，如抗雌激素剂和选择性雌激素受体调节剂(serm)，包括例如他莫昔芬(包括nolvadex
tm
)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、雷洛昔芬(keoxifene)、ly117018、奥那斯酮和托瑞米芬(fareston
tm
)；抑制调节肾上腺中雌激素产生的芳香酶的芳香酶抑制剂，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(megace
tm
)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(rivisor
tm
)、来曲唑(femara
tm
)和阿那曲唑(arimidex
tm
)；和抗雄激素如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
[0069]
如本文所用，术语“前药”是指药物活性物质的前体或衍生物形式，其与母体药物相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小，并且能够被酶促激活或转化为更具活性的母体形式。参见，例如，wilman,1986,"prodrugs in cancer chemotherapy",biochemical society transactions,14,第375-382页,615th meeting belfast；和stella等人,1985,"prodrugs:achemical approach to targeted drug delivery,"directed drug delivery,borchardt等人,(编),第247-267页,humana press。有用的前药包括但不限于含磷酸盐的前药、含硫代磷酸盐的前药、含硫酸盐的前药、含肽的前药、d-氨基酸修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含任选经取代的苯氧基乙酰胺的前药和含任选经取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其他5-氟尿苷前药(其可转化为更具活性的细胞毒性游离药物)。可以衍生为前药形式的细胞毒物的例子包括但不限于上述那些化疗剂。
[0070]“细胞抑制作用”是指细胞增殖的抑制。“细胞抑制剂(cytostatic agent)”是指对细胞具有细胞抑制作用，从而抑制特定细胞亚的生长和/或扩增的药剂。
[0071]
如本文所用，术语“免疫调节作用”是指对免疫学应答的发展或维持的刺激(免疫刺激)或抑制(免疫抑制)。抑制可通过例如以下来实现：消除免疫细胞(例如t或b淋巴细胞)；诱导或产生可以调节(例如，下调)其他细胞的功能能力的免疫细胞；在免疫细胞中诱导无应答状态(例如，免疫失能)；或增加、降低或改变免疫细胞的活性或功能，包括例如改变由这些细胞表达的蛋白质的模式(例如，改变某些类别的分子如细胞因子、趋化因子、生长因子、转录因子、激酶、共刺激分子或其他细胞表面受体等的产生和/或分泌)。“免疫调节剂”是指对细胞具有免疫调节作用的药剂。在一些实施方案中，免疫调节剂对促进免疫应答的免疫细胞具有细胞毒性或细胞抑制作用。
[0072]
术语“标记”是指直接或间接与抗体缀合的可检测化合物或组合物。标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或者在酶标记的情况下，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。可制备标记的抗cd70抗体并用于各种应用，包括体外和体内诊断。
[0073]“分离的”核酸分子是从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离的核酸分子，所述核酸分子在核酸的天然来源中通常与所述污染核酸分子缔合。分离的核酸分子不同于其在自然界中发现的形式或配置。因此，分离的核酸分子不同于天然细胞中存在的核酸分子。然而，分离的核酸分子包括在通常表达抗体的细胞中包含的核酸分子，其中例如所述核酸分子位于与天然细胞中相比不同的染体位置。
[0074]
术语“控制序列”是指在特定宿主生物体中表达可操作连接的编码序列所必需的多核苷酸序列。适用于原核细胞的控制序列包括例如启动子、操纵子和核糖体结合位点序
列。真核控制序列包括但不限于启动子、多腺苷酸化信号和增强子。这些控制序列可用于在原核和真核宿主细胞中表达和生产抗cd70结合剂。
[0075]
当核酸序列被放置成与另一核酸序列有功能关系时，其为“可操作地连接”。例如，如果核酸前序列或分泌前导序列表达为参与多肽分泌的前蛋白，则它与编码多肽的核酸可操作地连接；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它与编码序列可操作地连接；或者如果核糖体结合位点被定位为便于翻译，则它与编码序列可操作地连接。通常，“可操作地连接”意味着所连接的dna序列是连续的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且在阅读框中。然而，增强子任选地是连续的。连接可通过在便利的限制位点进行连接来完成。如果不存在这样的位点，合成的寡核苷酸衔接子或接头可用于连接dna序列。
[0076]
术语“多肽”是指氨基酸及其等同物的聚合物，而不是指特定长度的产物；因此，“肽”和“蛋白质”包括在多肽的定义中。本文定义的“抗体”也包括在多肽的定义中。“多肽区”是指多肽的区段，所述区段可以含有例如一个或多个结构域或基序(例如，抗体的多肽区可以含有例如一个或多个互补决定区(cdr))。术语“片段”是指典型地具有多肽的至少20个连续或至少50个连续氨基酸的多肽的一部分。“衍生物”是相对于第二多肽具有一个或多个非保守或保守氨基酸取代的多肽或其片段；或通过共价附接第二分子(例如通过附接异源多肽)或通过糖基化、乙酰化、磷酸化等而修饰的多肽或其片段。“衍生物”的定义中还包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(例如，非天然氨基酸等)的多肽、具有未取代连接以及本领域已知的天然和非天然存在的其他修饰的多肽。
[0077]“分离的”多肽是已从其自然环境的组分鉴定出并分离和/或回收的多肽。其自然环境的污染物组分是会干扰多肽的诊断或用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。分离的多肽包括分离的抗体、或其片段或衍生物。“抗体”包括重组细胞内原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组分将不存在。
[0078]
在某些实施方案中，将抗体纯化至：(1)如通过劳里法(lowry method)所确定的按重量计大于95％的抗体，并且在其他方面按重量计大于99％，(2)足以获得通过使用旋杯式序列分析仪所测的至少15个残基的n末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选银染通过sds-page测得的同质性。
[0079]
在多肽的上下文中，术语“异源的”意指与另一多肽相比来自不同来源(例如，细胞、组织、生物体或物种)，使得这两种多肽是不同的。典型地，异源多肽来自不同物种。
[0080]
在免疫球蛋白多肽或其片段的上下文中，“保守取代”意指基本上不降低免疫球蛋白多肽或其片段与抗原的特异性结合(例如，通过kd所测量)的一个或多个氨基酸取代(即，增加结合亲和力，不显著改变结合亲和力，或使结合亲和力降低不超过约40％、典型地不超过约30％、更典型地不超过约20％、甚至更典型地不超过约10％或最典型地不超过约5％的取代，如通过标准结合测定如elisa所测定)。
[0081]
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性百分比”是指在针对最大一致性(maximum correspondence)进行比较或比对时，两个或更多个序列或子序列相同，或者具有指定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基。为了确定同一性百分比，出于最佳比较目的比对所述序列(例如，可在第一氨基酸或核酸序列的序列中引入空位，以实现与第二氨基酸或核酸序列的最佳比对)。然后比较在相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。在第一序列中的位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸残基或
核苷酸占据时，那么分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同一性百分比是所述序列共有的同一性位置数的函数(即，同一性％＝同一性位置数/位置总数(例如，重叠位置)x100)。在一些实施方案中，两个序列具有相同长度。
[0082]
在两个核酸或多肽的上下文中，术语“基本相同”是指两个或更多个序列或子序列具有至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％同一性；典型地，至少70％或至少75％同一性；更典型地，至少80％或至少85％同一性；并且甚至更典型地，至少90％、至少95％或至少98％同一性(例如，如使用下文列出的其中一种方法所确定的)。
[0083]
在两个或更多个多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“相似性百分比”是指在针对最大一致性进行比较和比对时，两个或更多个序列或子序列具有指定百分比的相同的或保守取代的氨基酸残基，如使用下文列出的其中一种方法所测量的。举例来说，当与第一序列中所含数量相等的数量的氨基酸相比时，或当与已经通过例如下文列出的其中一种方法比对的多肽比对相比时，第一氨基酸序列相对于第二氨基酸序列是至少50％、60％、70％、75％、80％、90％或95％相同或保守取代的情况下，可以认为第一氨基酸序列与第二氨基酸序列相似。
[0084]
在多肽序列的上下文中，术语“基本相似性”或“基本相似”表示多肽区具有与参考序列具有至少70％、典型地至少80％、更典型地至少85％或至少90％或至少95％序列相似性的序列。例如，多肽基本上类似于第二多肽，例如，在两种肽的不同之处在于一个或多个保守取代时。
[0085]
在抗cd70抗体或其衍生物的上下文中，具有与抗cd70抗体的一个或多个抗原结合区(例如，重链或轻链可变区，或重链或轻链cdr)基本相同或基本相似的一个或多个多肽区的蛋白质保留了与由抗cd70抗体识别的cd70表位的特异性结合，如使用本领域已知或本文提及的各种标准免疫测定中的任一种测定的。
[0086]
两个序列之间的同一性百分比或相似性百分比的确定可以使用数学算法来完成。用于比较两个序列的数学算法的优选非限制性例子是karlin和altschul,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:2264-2268的算法，如karlin和altschul,1993,proc.natl.acad.sci.usa 90:5873-5877中修改。这种算法被并入altschul等人,1990,j.mol.biol.215:403-410的nblast和xblast程序中。blast核苷酸搜索可用nblast程序来进行，得分＝100，字长＝12，以获得与编码目的蛋白质的核酸同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可用xblast程序来进行，得分＝50，字长＝3，以获得与目的蛋白质同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschul等人,1997，nucleic acids res.25:3389-3402中所述的使用空位blast(gapped blast)。可替代地，可使用psi-blast来进行迭代搜索，其检测分子之间的远距离关系(同上)。当使用blast、空位blast和psi-blast程序时，可以使用各程序(例如，xblast和nblast)的默认参数。用于比较序列的数学算法的另一个非限制性例子是myers和miller,cabios(1989)的算法。这种算法已并入到align程序(2.0版)中，所述程序是gcg序列比对软件包的一部分。当利用align程序比较氨基酸序列时，可以使用pam120权重残基表，空位长度罚分为12，空位罚分为4。用于序列分析的其他算法是本领域已知的，并且包括如torellis和robotti,1994,comput.appl.biosci.10:3-5中所述的advance和adam；和pearson和lipman,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:2444-8中所述的fasta。在fasta内，ktup是设置搜索灵敏度
和速度的控制选项。如果ktup＝2，通过查看比对残基对，发现所比较的两个序列中的相似区域；如果ktup＝1，检查单个比对的氨基酸。对于蛋白质序列，ktup可以设置为2或1，或者对于dna序列，可以设置为1至6。如果ktup未指定，则对于蛋白质，默认值为2，对于dna，默认值为6。可替代地，可使用higgins等人,1996,methods enzymol.266:383-402中描述的clustal w算法进行蛋白质序列比对。
[0087]
如本文所用，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这些名称都包括其后代。因此，“转化体”和“转化的细胞”包括原代主题细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移的数量。还应理解，由于故意或天然发生的突变，所有后代的dna含量可能不完全相同。包括具有与原始转化的细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的突变体后代。在意指不同的名称的情况下，根据上下文将是清楚的。
[0088]
用于目的的术语“受试者”是指任何动物，特别是归类为哺乳动物的动物，包括人、驯养动物和农场动物以及动物园动物、运动动物或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选地，受试者是人。
[0089]
如本文所用，“障碍”和术语“cd70相关障碍”和“cd70相关疾病”是指将受益于用如本文所述的抗cd70结合剂的任何病症。“cd70相关障碍”和“cd70相关疾病”典型地在细胞表面上表达cd70或其片段。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的障碍的那些病理状态。本文待的障碍的非限制性例子包括癌症、髓系恶性肿瘤、血液恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、白血病和淋巴恶性肿瘤、癌以及炎性、血管生成性和免疫性障碍。下文公开了障碍的具体例子。
[0090]
如本文所用，术语“”和“疗法”等意指包括导致任何临床期望或有益效果的对疾病或障碍的性和预防性或抑制性措施，所述临床期望或有益效果包括但不限于减轻或缓解疾病或障碍的一种或多种症状，消退、减缓或停止疾病或障碍的进展。因此，例如，术语包括在疾病或障碍的症状发作之前或之后施用药剂，从而预防或消除疾病或障碍的所有体征。作为另一个例子，该术语包括在疾病的临床表现之后施用药剂以对抗疾病的症状。此外，在发作后和出现临床症状后施用药剂(其中施用影响疾病或障碍的临床参数，如组织损伤的程度或转移的量或程度，无论是否导致疾病的改善)构成如本文所用的“”或“疗法”。
[0091]
如本文所用，术语“预防”(“prevention”或“prevent”)是指在表达cd70的癌症或免疫障碍的临床或诊断症状发作之前向受试者施用抗cd70结合剂(例如向具有获得表达cd70的癌症或免疫障碍的倾向或高风险的个体施用)，从而(a)阻断表达cd70的癌症或免疫障碍或其一种或多种临床或诊断症状的发生或发作，(b)抑制表达cd70的癌症或免疫障碍发作的严重性，或(c)降低表达cd70的癌症或免疫障碍发作的可能性。
[0092]
术语“静脉内输注”是指在大于大约15分钟，通常在大约30至90分钟的时间段内将药剂(例如剂)引入动物或人患者的静脉中。
[0093]
术语“静脉内推注”(“intravenous bolus”或“intravenous push”)是指将药物施用于动物或人的静脉中，使得身体在大约15分钟或更短，通常5分钟或更短的时间内接受药物。
[0094]
术语“皮下施用”是指在动物或人患者的皮肤下，通常在皮肤和下面的组织之间的口袋内，通过从药物容器相对缓慢持续的递送引入药剂(例如剂)。将皮肤捏住或牵拉
向上且离开下面的组织可产生口袋。
[0095]
术语“药品说明书”用于指通常包括在产品的商业包装中的说明书，该说明书包含关于使用此类产品的适应症、用法、施用、禁忌症和/或警告的信息。
[0096]“脂质体”是由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的小囊泡，其可用于将药物(例如抗体)递送至哺乳动物。脂质体的组分通常以双层形式排列，类似于生物膜的脂质排列。
[0097]
术语“皮下输注”是指在动物或人患者的皮肤下，优选地在皮肤和下面的组织之间的口袋内，通过从药物容器相对缓慢持续的递送一个时间段引入药物，所述时间段包括但不限于30分钟或更短、或90分钟或更短。任选地，输注可以通过皮下植入被植入在动物或人患者的皮肤下的药物递送泵来进行，其中泵递送预定量的药物持续一个预定时间段，如30分钟、90分钟或跨越方案的长度的时间段。
[0098]
术语“皮下推注”是指在动物或人患者的皮肤下的药物施用，其中推注药物递送少于约15分钟；在另一方面，少于5分钟，并且在再另一方面，少于60秒。在甚至又另一方面，施用在皮肤和下面的组织之间的口袋内，其中口袋可以通过将皮肤捏住或牵拉向上且离开下面的组织来产生。
[0099]
术语“有效量”是指足以抑制受试者中表达cd70的癌症或免疫障碍的发生或改善其一种或多种临床或诊断症状的抗cd70结合剂(例如，抗体或衍生物或其他结合剂)的量。根据本文所述的方法以“有效方案”施用有效量的药剂。术语“有效方案”是指足以实现或预防表达cd70的癌症或免疫障碍的药剂的量和给药频率的组合。
[0100]
术语“有效量”用于指具有有益患者结局(例如生长停滞作用或细胞缺失)的剂的量。在一方面，有效量具有凋亡活性，或能够诱导细胞死亡。在另一方面，有效量是指已显示在例如减缓疾病进展中有效的目标血清浓度。功效可以以常规方式测量，这取决于待的病症。例如，在以表达cd70的细胞为特征的肿瘤性疾病或障碍中，可以通过评估疾病进展时间(ttp)或确定反应率(rr)来测量功效。
[0101]
如本文所用，“完全反应”或“cr”是指所有靶病灶的消失；“部分反应”或“pr”是指靶病灶的最长直径之和(sld)降低至少30％，以基线sld为参考；并且“疾病稳定”或“sd”是指以自开始以来的最小sld为参考，靶病灶既没有足够缩小以符合pr，也没有足够增加以符合pd。
[0102]
如本文所用，“无进展存活期”或“pfs”是指在期间和之后，所的疾病(例如，癌症)没有恶化的时间长度。无进展存活期可以包括患者经历完全反应或部分反应的时间量以及患者经历疾病稳定的时间量。
[0103]
如本文所用，“总反应率”或“orr”是指完全反应(cr)率和部分反应(pr)率的总和。
[0104]
如本文所用，“总存活率”或“os”是指组中在特定持续时间后可能存活的个体的百分比。
[0105]
如本文所用的“不良事件”(ae)是与使用药物相关的任何不利且通常是无意或不希望的体征(包括异常的实验室发现)、症状或疾病。药物可能具有一种或多种相关的ae，并且每种ae可能具有相同或不同分级的严重程度。提及能够“改变不良事件”的方法意指降低与使用不同方案相关的一种或多种ae的发生率和/或严重程度的方案。
[0106]
如本文所用的“严重不良事件”或“sae”是满足以下标准之一的不良事件：
·
致命或危及生命(如在严重不良事件的定义中所用，“危及生命”是指患者在事件发生时有死亡风险的事件；它不是指假设其在更严重时可能会导致死亡的事件。
·
导致持续性或显著的残疾/无能
·
构成先天性异常/出生缺陷
·
具有医学显著性，即定义为危害患者或可能需要医疗或手术干预以防止以上列出的结局之一的事件。在决定ae是否“具有医学显著性”时，必须进行医学和科学判断
·
需要住院或延长现有住院，不包括以下情况：1)常规或监测潜在疾病，与病症的任何恶化无关；2)对与研究中适应症无关且自签署知情同意书以来未恶化过的预先存在的病症进行选择性或预先计划的；以及3)在患者总体状况没有任何恶化的情况下的社会原因和临时看护。
[0107]
替代方案(例如，“或”)的使用应理解为意指替代方案中的一个、两者或它们的任何组合。如本文中所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应被理解为是指“一个/一种或多个/多种”任何所述或列举的组分。
[0108]
术语“约”或“基本上由
……
构成”是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由
……
构成”可以意指在1个或超过1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由
……
构成”可以意指高达20％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指值的多达一个数量级或多达5倍。当在本技术和权利要求中提供特定值或组成时，除非另有说明，否则应当假定“约”或“基本上由
……
构成”的含义在该特定值或组成的可接受的误差范围内。
[0109]
如文中所用，术语“药学上可接受的”意指由联邦政府或州政府的监管机构批准的或在美国药典或其他普遍认可的药典中列出的用于在动物体内，更特别地在人体内使用。术语“药学上相容的成分”是指与抗cd70结合剂一起施用的药学上可接受的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。
[0110]
如本文所用，短语“药学上可接受的盐”是指抗cd70结合剂或剂的药学上可接受的有机或无机盐。抗cd70结合剂或剂含有至少一个氨基，因此可用该氨基或其他合适的基团形成酸加成盐。示例性盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、丹宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲基磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基3-萘甲酸))盐。药学上可接受的盐可以涉及包含另一种分子，如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他反离子。反离子可以是使母体化合物上的电荷稳定的任何有机或无机部分。此外，药学上可接受的盐在其结构中可以具有多于一个带电荷的原子。多个带电荷的原子是药学上可接受的盐的一部分的例子可以具有多个反离子。因此，药学上可接受的盐可以具有一个或多个带电荷的原子和/或一个或多个反离子。
[0111]“药学上可接受的溶剂化物”或“溶剂化物”是指一种或多种溶剂分子与抗cd70结合剂和/或剂的缔合。形成药学上可接受的溶剂化物的溶剂的例子包括但不限于水、异
丙醇、乙醇、甲醇、dmso、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
[0112]
缩写“afp”是指二甲基缬氨酸-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleuine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸-对苯二胺。
[0113]
缩写“mmae”是指一甲基澳瑞他汀e。
[0114]
缩写“aeb”是指通过使澳瑞他汀e与对乙酰基苯甲酸反应产生的酯。
[0115]
缩写“aevb”是指通过使澳瑞他汀e与苯甲酰基戊酸反应产生的酯。
[0116]
缩写“mmaf”是指海兔缬氨酸(dovaline)-缬氨酸-海兔异亮氨酸(dolaisoleunine)-海兔脯氨酸(dolaproine)-苯丙氨酸。
[0117]
缩写“fk”和“phe-lys”是指接头苯丙氨酸-赖氨酸。
[0118]
术语“treg”或“调节性t细胞”是指抑制cd4+cd25
+
和cd8
+
t细胞增殖和/或效应子功能，或以其他方式下调免疫应答的cd4
+
t细胞。值得注意的是，treg可下调由自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞以及其他免疫细胞介导的免疫应答。
[0119]
术语“调节性t细胞功能”或“treg的功能”可互换使用，是指treg的导致cd4+cd25
+
或cd8
+
t细胞增殖的减少或效应t细胞介导的免疫应答的减少的任何生物学功能。treg功能可以经由本领域建立的技术来测量。用于测量treg功能的体外测定中的非限制性例子包括transwell抑制测定以及体外测定，在所述体外测定中从人外周血或脐带血(或鼠脾脏或淋巴结)纯化的靶常规t细胞(tconv)和treg任选地通过抗cd3
+
抗cd28包被珠粒(或抗原呈递细胞(apc)，例如辐照的脾细胞或纯化的树突细胞(dc)或辐照的pbmc)激活，然后在体外检测常规t细胞增殖(例如，通过测量放射性核苷酸(例如，[h]-胸苷)或荧光核苷酸的掺入，或通过cayman chemical mtt细胞增殖测定试剂盒，或通过用流式细胞仪监测绿荧光染料酯cfse或半萘荧光素(snarf-1)染料的稀释度)。其他常见测定测量t细胞细胞因子反应。treg功能的可用体内测定包括treg在其中发挥重要作用的动物疾病模型中的测定，所述动物疾病模型包括例如，(1)稳态模型(使用幼稚稳态扩增cd4
+
t作为主要受treg抑制的靶细胞)、(2)炎性肠病(ibd)恢复模型(使用thl t细胞(thl7)作为主要受treg抑制的靶细胞)、(3)实验性自身免疫性脑脊髓炎(eae)模型(使用thl 7和thl t细胞作为主要受treg抑制的靶细胞)、(4)b16黑素瘤模型(抗肿瘤免疫的抑制)(使用cd8
+
t细胞作为主要受treg抑制的靶细胞)、(5)在过继转移结肠炎中抑制结肠炎症，其中幼稚cd4
+
cd45rb
m tconv细胞被转移到ragv小鼠中，以及(6)foxp3挽救模型(使用淋巴细胞作为主要受treg抑制的靶细胞)。根据一种方案，所有模型都需要小鼠以得到供体t细胞体以及ragl-/-或foxp3小鼠以得到受体。有关各种可用测定的更多详细信息，参见例如collison和vignali,in vitro treg suppression assays,chapter2in regulatory t cells:methods and protocols,methods in molecular biology,kassiotis和liston编,springer,2011,707:21-37；workman等人,in vivo treg suppression assays,chapter 9in regulatory t cells:methods and protocols,methods in molecular biology,kassiotis和liston编,springer,2011,119-156；takahashi等人,int.immunol,1998,10:1969-1980；thornton等人,j.exp.med.,1998,188:287-296；collison等人,j.immunol,2009,182:6121-6128；thornton和shevach,j.exp.med.,1998,188:287-296；asseman等人,j.exp.med.,1999,190:995-1004；dieckmann等人,j.exp.med.,2001,193:1303-1310；belkaid,nature reviews,2007,7:875-888；tang和bluestone,nature immunology,2008,9:239-244；
bettini和vignali,curr.opin.immunol,2009,21:612-618；dannull等人,j clin invest,2005,115(12):3623-33；tsaknaridis,等人,j neurosci res.,2003,74:296-308。
[0120]
如本文所述，任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时包括它们的分数(如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指示。
[0121]
在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。ii.抗cd70抗体
[0122]
本发明提供了源自小鼠抗体1f6的抗cd70抗体，如人源化抗体。1f6是针对cd70的鼠免疫球蛋白g1(igg1)单克隆抗体。1f6和人源化1f6变体描述于美国专利号8,067,546和国际专利公开案wo 2006/113909中。在一些实施方案中，抗cd70抗体是非岩藻糖基化的。
[0123]
小鼠1f6抗体的人源化形式的结合亲和力(即，解离常数kd)优选地在小鼠抗体1f6对于人cd70的结合亲和力的五倍或两倍之内。人源化1f6抗体特异性结合天然形式的人cd70和/或由中国仓鼠卵巢(cho)细胞重组表达的人cd70，如同衍生它们的小鼠抗体一样。优选的人源化1f6抗体对于人cd70的亲和力等于或大于(即，大于测量的误差界限之外)1f6对于人cd70的亲和力(例如，1f6的亲和力的1.1至5倍、1.1至3倍、1.5至3倍、1.7至2.3倍或1.7至2.1倍或所述亲和力的约两倍)。优选的人源化1f6抗体与1f6结合相同的表位和/或竞争结合人cd70。
[0124]
在一些实施方案中，在动物模型或临床试验中，本发明的抗体抑制癌症(例如，细胞的生长、转移和/或对生物体的致死性)，如在培养物中繁殖的癌细胞上所示。动物模型可以通过将表达cd70的人肿瘤细胞系植入适当的免疫缺陷型啮齿动物品系(例如无胸腺裸鼠或scid小鼠)中而形成。这些肿瘤细胞系可以在免疫缺陷型啮齿动物宿主中通过皮下注射建立为实体瘤，或者通过静脉内注射建立为播散性肿瘤。
[0125]
一旦在宿主内建立，这些肿瘤模型就可以用于如实施例中所述评价抗cd70抗体或其缀合形式的功效。
[0126]
通常，本公开文本的抗cd70抗体结合cd70，例如人cd70，并对恶性细胞(如癌细胞)发挥细胞抑制和细胞毒性作用。本公开文本的抗cd70抗体优选地是单克隆的，并且可以是多特异性抗体、人抗体、人源化抗体或嵌合抗体、单链抗体、fab片段、f(ab')片段、由fab表达文库产生的片段以及上述任一者的cd70结合片段。在一些实施方案中，本公开文本的抗cd70抗体特异性地结合cd70。本公开文本的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)或子类。
[0127]
在本公开文本的某些实施方案中，所述抗cd70抗体是如本文所述的抗原结合片段(例如，人抗原结合片段)，并且包括但不限于fab、fab'和f(ab')2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)和包含v
l
或vh结构域的片段。包含单链抗体的抗原结合片段可以包含单独的或与以下全部或一部分组合的一个或多个可变区：铰链区、ch1、ch2、ch3和cl结构域。本公开文本还包括抗原结合片段，所述抗原结合片段包含一个或多个可变区与铰链区、ch1、ch2、ch3和cl结构域的任何组合。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体或其抗原结合片段是人、鼠(例如，小鼠和大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡的抗体。
[0128]
本公开文本的抗cd70抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或具有更大的多
特异性。多特异性抗体可以对cd70的不同表位具有特异性，或者可以对cd70以及异源蛋白二者均具有特异性。参见例如pct公开案wo 93/17715；wo 92/08802；wo91/00360；wo 92/05793；tutt,等人,1991,j.immunol.147:60 69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；5,601,819；kostelny等人,1992,j.immunol.148:1547 1553。
[0129]
本公开文本的抗cd70抗体可以是人源化抗体。在一些实施方案中，本公开文本的抗cd70抗体是小鼠抗体1f6的人源化抗体。1f6的人源化形式描述于美国专利号8,067,546中。人源化抗体是基因工程化抗体，其中来自非人“供体”抗体的cdr被移植到人“受体”抗体序列中(参见例如，queen,us 5,530,101和5,585,089；winter,us5,225,539；carter,us 6,407,213；adair,us 5,859,205；和foote,us 6,881,557)。所述受体抗体序列可以是例如成熟的人抗体序列、此类序列的复合物、人抗体序列的共有序列或种系区序列。对于重链，优选的受体序列是种系vh外显子vhl-2(在文献中也称为hv1-2)(shin等人,1991,embo j.10:3641-3645)，并且对于铰链区(jh)，优选的受体序列是外显子j
h-6(mattila等人,1995,eur.j.immunol.25:2578-2582)。对于轻链，优选的受体序列是外显子vk2-30(在文献中也称为kv2-30)，并且对于铰链区，优选的受体序列是外显子jk-4(hieter等人,1982,j.biol.chem.257:1516-1522)。因此，人源化抗体是具有完全或基本上来自供体抗体的一些或所有cdr以及全部或基本上来自人抗体序列的可变区框架序列和恒定区(如果存在的话)的抗体。类似地，人源化重链具有完全或基本上来自供体抗体重链的至少一个、两个和通常所有三个cdr以及基本上来自人重链可变区框架和恒定区序列的重链可变区框架序列和重链恒定区(如果存在的话)。类似地，人源化轻链具有完全或基本上来自供体抗体轻链的至少一个、两个和通常所有三个cdr以及基本上来自人轻链可变区框架和恒定区序列的轻链可变区框架序列和轻链恒定区(如果存在的话)。不同于纳米抗体和dab，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。当各自cdr之间至少60％、85％、90％、95％或100％的相应残基(如kabat定义)相同时，人源化抗体中的cdr基本上来自非人抗体中的相应cdr。当由kabat定义的相应残基的至少85％、90％、95％或100％相同时，抗体链的可变区框架序列或抗体链的恒定区分别基本上来自人可变区框架序列或人恒定区。
[0130]
尽管人源化抗体通常掺入来自小鼠抗体的所有六个cdr(优选地如kabat所定义)，但它们也可制备成具有来自小鼠抗体的少于所有cdr(例如，至少3、4或5个)的cdr(例如，pascalis等人,j.immunol.169:3076,2002；vajdos等人,journal of molecular biology,320:415-428,2002；iwahashi等人,mol.immunol.36:1079-1091,1999；tamura等人,journal of immunology,164:1432-1441,2000)。
[0131]
基于对cdr构象和/或与抗原结合的可能存在的影响，可以选择来自人可变区框架残基的某些氨基酸进行取代。对此类可能存在的影响的研究是通过建模、检查特定位置处氨基酸的特征或对特定氨基酸的取代或诱变作用的经验观察进行的。
[0132]
例如，当鼠可变区框架残基与选择的人可变区框架残基之间的氨基酸不同时，可以将人框架氨基酸取代为来自小鼠抗体的等效框架氨基酸，条件是合理地预期所述氨基酸：(1)直接非共价结合抗原，(2)与cdr区相邻，(3)以其他方式与cdr区相互作用(例如，在cdr区的约6a内)；或者
(4)介导重链与轻链之间的相互作用。
[0133]
本公开文本的抗cd70抗体可以根据它们所包含的特定cdr来描述或详细说明。给定cdr或fr的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下中所述的那些：kabat等人(1991),“sequences of proteins of immunological interest,”第5版public health service,national institutes of health,贝塞斯达,马里兰州(“kabat”编号方案)；al-lazikani等人,(1997)jmb 273,927-948(“chothia”编号方案)；maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996),“antibody-antigen interactions:contact analysis and binding site topography,”j.mol.biol.262,732-745.”(“contact”编号方案)；lefranc mp等人,“imgt unique numbering for immunoglobulin and t cell receptor variable domains and ig superfamily v-like domains,”dev comp immunol,2003年1月；27(1):55-77(“imgt”编号方案)；honegger a和pl
ü
ckthun a,“yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”j mol biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“aho”编号方案)；以及martin等人,“modeling antibody hypervariable loops:a combined algorithm,”pnas,1989,86(23):9268-9272(“abm”编号方案)。给定cdr的边界可以根据用于鉴定的方案而变化。在一些实施方案中，给定抗体或其区域(例如，其可变区)的“cdr”或“互补决定区”或单独指定的cdr(例如，cdr-h1、cdr-h2、cdr-h3)应理解为涵盖如由任何上述方案所定义的一个(或特定)cdr。例如，在声明特定的cdr(例如，cdr-h3)含有给定vh或v
l
区氨基酸序列中的相应cdr的氨基酸序列的情况下，应理解，这种cdr具有在可变区内的相应cdr(例如，cdr-h3)的序列，如由任何上述方案所定义的。可以指定用于鉴定特定的一个或多个cdr(如由kabat、chothia、abm或imgt方法定义的cdr)的方案。
[0134]
本文所述的抗cd70抗体和抗cd70抗体-药物缀合物的cdr序列是根据kabat等人(1991),“sequences of proteins of immunological interest,”第5版public health service,national institutes of health,bethesda,md中所述的kabat编号方案，除非另有说明。
[0135]
在一方面，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区和含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义。在一些实施方案中，抗cd70抗体还包含fc结构域。在一些实施方案中，抗cd70抗体是非岩藻糖基化的。
[0136]
本文所述的抗cd70抗体可以包含任何合适的框架可变结构域序列，前提是所述抗体保留结合cd70(例如，人cd70)的能力。如本文所用，重链框架区称为“hc-fr1-fr4”，而轻链框架区称为“lc-fr1-fr4”。
[0137]
在本文所述的抗cd70抗体的一些实施方案中，重链可变结构域包含qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglkwmgwinty tgeptyadafkgrvtmtrdtsistaymelsrlrsddtavyycardygdygmdywgq gttvtvss(seq id no:1)的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含divmtqspdslavslgeratincrasksvstsgysfmhwyqqkpgqppklliylasnl es gvpdrfsgsg sgtdftltisslqaedvavyycqhsrevpwtfgqgtkveik(seq id no:2)的氨基酸序列。
[0138]
在本文所述的抗cd70抗体的一些实施方案中，重链可变结构域包含qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgytftnygmnwvrqapgqglkwmgwinty tgeptyadafkgrvtmtrdtsistaymelsrl
rsddtavyycardygdygmdywgq gttvtvss(seq id no:1)的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含divmtqspdslavslgeratincrasksvstsgysfmhwyqqkpgqppklliylasnl es gvpdrfsgsg sgtdftltisslqaedvavyycqhsrevpwtfgqgtkveikr(seq id no:7)的氨基酸序列。
[0139]
在一个方面，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变结构域或包含含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在一个方面，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变结构域和包含含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
[0140]
在一个方面，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变结构域或包含含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在一个方面，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变结构域和包含含有seq id no:7的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
[0141]
在一些实施方案中，本文提供了抗cd70抗体，其包含含有与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。在某些实施方案中，包含与seq id no:1的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链可变结构域含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与cd70(例如，人cd70)结合的能力。在某些实施方案中，在seq id no:1中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在cdr之外的区域中(即在fr中)。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体包含seq id no:1的重链可变结构域序列，其包括该序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
[0142]
在一些实施方案中，本文提供了包含轻链可变结构域的抗cd70抗体，所述轻链可变结构域包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含与seq id no:2的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与cd70(例如，人cd70)结合的能力。在某些实施方案中，在seq id no:2中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在cdr之外的区域中(即在fr中)。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体包含seq id no:2的轻链可变结构域序列，其包括该序列的翻译后修饰。
[0143]
在一些实施方案中，本文提供了包含轻链可变结构域的抗cd70抗体，所述轻链可变结构域包含与seq id no:7的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含与seq id no:5的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与cd70(例如，人cd70)结合的能力。在某些实施方案中，在seq id no:7中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在cdr之外的区域中(即在fr中)。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体包含seq id no:7的轻链可变结构域序列，其包括该序列的翻译后修饰。
[0144]
在一些实施方案中，本文提供了包含如下重链的抗cd70抗体，所述重链包含与氨基酸序列qvqlvqsgae vkkpgasvkv sckasgytft nygmnwvrqa pgqglkwmgw intytgepty adafkgrvtm trdtsistay melsrlrsdd tavyycardy gdygmdywgq gttvtvssas tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk(seq id no:3)具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含与seq id no:3的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的重链含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与cd70(例如，人cd70)结合的能力。在某些实施方案中，在seq id no:3中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在cdr之外的区域中(即在fr中)。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体包含seq id no:3的重链序列，其包括该序列的翻译后修饰。
[0145]
在一些实施方案中，本文提供了包含如下轻链的抗cd70抗体，所述轻链包含与divmtqspds lavslgerat incrasksvs tsgysfmhwy qqkpgqppkl liylasnles gvpdrfsgsg sgtdftltis slqaedvavy ycqhsrevpw tfgqgtkvei krtvaapsvf ifppsdeqlk sgtasvvcll nnfypreakv qwkvdnalqs gnsqesvteq dskdstysls stltlskady ekhkvyacev thqglsspvt ksfnrgec(seq id no:4)的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，包含与seq id no:4的氨基酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的氨基酸序列的轻链含有相对于参考序列的取代(例如，保守取代)、插入或缺失，并保留与cd70(例如，人cd70)结合的能力。在某些实施方案中，在seq id no:4中总共1至10个氨基酸被取代、插入和/或缺失。在某些实施方案中，取代、插入或缺失(例如，1、2、3、4或5个氨基酸)发生在cdr之外的区域中(即在fr中)。在一些实施方案中，所述抗cd70抗体包含seq id no:4的轻链序列，其包括该序列的翻译后修饰。
[0146]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含如上文提供的任何实施方案中的重链可变结构域和如上文提供的任何实施方案中的轻链可变结构域。在一个实施方案中，所述抗体包
含seq id no:1的重链可变结构域序列和seq id no:2的轻链可变结构域序列，其包括那些序列的翻译后修饰。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
[0147]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含：i)与包含seq id no:1的氨基酸序列的重链可变区具有至少85％序列同一性的氨基酸序列，和ii)与包含seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变区具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述重链可变结构域的n末端谷氨酰胺被环化以形成焦谷氨酸。
[0148]
在一些实施方案中，所述抗cd70抗体是单克隆抗体。
[0149]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含重链可变区或轻链可变区，所述重链可变区包含美国专利号8,067,546、美国专利号8,562,987、美国专利号9,428,585、美国专利号9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或国际专利公开案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗体的三个cdr，所述轻链可变区包含以上文献中所述的抗cd70抗体的三个cdr。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含美国专利号8,067,546、美国专利号8,562,987、美国专利号9,428,585、美国专利号9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us2014/0178936、us 2017/0022282或国际专利公开案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗体的三个cdr，所述轻链可变区包含以上文献中所述的抗cd70抗体的三个cdr。在一些实施方案中，cdr由kabat编号方案定义。
[0150]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含美国专利号8,067,546、美国专利号8,562,987、美国专利号9,428,585、美国专利号9,701,752、us 2009/0148942、us2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或国际专利公开案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗体的重链可变区或轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含美国专利号8,067,546、美国专利号8,562,987、美国专利号9,428,585、美国专利号9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或国际专利公开案wo 2006/113909中所述的抗cd70抗体的重链可变区和轻链可变区。
[0151]
在一些实施方案中，抗cd70抗体是抗cd70抗体，如人源化1f6变体，如美国专利号8,067,546、美国专利号8,562,987、美国专利号9,428,585、美国专利号9,701,752、us 2009/0148942、us 2012/0045436、us 2014/0178936、us 2017/0022282或国际专利公开案wo 2006/113909中所述。
[0152]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含含有抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的三个cdr的重链可变区或含有抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的三个cdr的轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含含有抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的三个cdr的重链可变区和含有抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的三个cdr的轻链可变区。在一些实施方案中，cdr由kabat编号方案定义。
[0153]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的重链可变区或轻链可变区。在一些实施方案中，抗cd70抗体包含抗cd70抗体沃瑟妥珠单抗的重链可变区和轻链可变区。
[0154]
在一些实施方案中，抗cd70抗体是沃瑟妥珠单抗(vorsetuzumab)。
[0155]
本发明的抗cd70抗体也可以根据其与cd70(例如人cd70)的结合亲和力来进行描述或指定。优选的结合亲和力包括解离常数或kd小于5x10-2
m、10-2
m、5x10-3
m、10-3
m、5x10-4
m、
10-4
m、5x10-5
m、10-5
m、5x10-6
m、10-6
m、5x10-7
m、10-7
m、5x10-8
m、10-8
m、5x10-9
m、10-9
m、5x10-10
m、10-10
m、5x10-11
m、10-11
m、5x10-12
m、10-12
m、5x10-13
m、10-13
m、5x10-14
m、10-14
m、5x10-15
m、或10-15
m的那些。
[0156]
存在五类免疫球蛋白：iga、igd、ige、igg和igm，具有分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链。γ和α类别被进一步分为多个亚类，例如，人表达以下亚类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。igg1抗体可以以多种称为同种异型的多态变体(综述于jefferis和lefranc 2009.mabs第1卷第4期1-7中)存在，其中的任一种适用于本文的一些实施方案中。人体中的常见同种异型变体是通过字母a、f、n、z或其组合命名的那些。在本文的任一个实施方案中，抗体可以包含含有人igg fc区的重链fc区。在另外的实施方案中，所述人igg fc区包含人igg1。
[0157]
在一些实施方案中，抗cd70抗体包含如上文提供的任何实施方案中的重链可变结构域和如上文提供的任何实施方案中的轻链可变结构域。在一个实施方案中，抗体包含重链恒定区和轻链恒定区，所述重链恒定区包含as tkgpsvfpla psskstsggt aalgclvkdy fpepvtvswn sgaltsgvht fpavlqssgl yslssvvtvp ssslgtqtyi cnvnhkpsnt kvdkkvepks cdkthtcppc papellggps vflfppkpkd tlmisrtpev tcvvvdvshe dpevkfnwyv dgvevhnakt kpreeqynst yrvvsvltvl hqdwlngkey kckvsnkalp apiektiska kgqprepqvy tlppsrdelt knqvsltclv kgfypsdiav ewesngqpen nykttppvld sdgsfflysk ltvdksrwqq gnvfscsvmh ealhnhytqk slslspgk(seq id no:5)的氨基酸序列，所述轻链恒定区包含tvaapsvf ifppsdeqlk sgtasvvcll nnfypreakv qwkvdnalqs gnsqesvteq dskdstysls stltlskady ekhkvyacev thqglsspvt ksfnrgec(seq id no:6)的氨基酸序列，包括那些序列的翻译后修饰。
[0158]
抗体还包括经修饰的衍生物，所述修饰即通过任何类型的分子与抗体共价附接，使得共价附接不会阻止抗体与cd70结合或对细胞发挥细胞抑制或细胞毒性作用。例如但非限制性地，抗体衍生物包括已经例如通过以下方式修饰的抗体：糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体或其他蛋白质连接等。可以通过已知技术进行多种化学修饰中的任何一种，所述已知技术包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
[0159]
cd70结合剂可任选地包括介导或刺激针对表达cd70的靶细胞的adcc、adcp和/或cdc反应的抗体效应子结构域。一个或多个效应子结构域可以是例如ig分子的一个或多个fc结构域。例如在表达cd70的癌症或免疫障碍中，这样的cd70结合剂可以对应地对表达cd70的癌细胞发挥细胞毒性或细胞抑制作用，或对激活的淋巴细胞或树突细胞发挥细胞毒性、细胞抑制或免疫调节作用。典型地，cd70结合剂募集和/或激活细胞毒性白细胞(例如自然杀伤(nk)细胞、吞噬细胞(例如巨噬细胞)和/或血清补体组分)。
[0160]
抗cd70抗体可以是人源化抗体、单链抗体、scfv、双抗体、fab、微型抗体、scfv-fc、fv等。在一些实施方案中，cd70抗原结合区可以连接到一个或多个效应子结构域(例如免疫球蛋白的铰链-ch2-ch3结构域)，或具有效应子功能的一个或多个效应子结构域的部分或片段。抗原结合抗体片段(包括单链抗体)可包含例如与效应子结构域(例如单独的或与ch1、铰链和/或c
l
结构域组合的ch2和/或ch3结构域)的全部或部分组合的一个或多个可变区。此
外，抗原结合片段可包含效应子结构域的任何组合。在一些实施方案中，抗cd70抗体可以是包含连接到铰链-ch2-ch3结构域的cd70结合可变区的单链抗体。
[0161]
抗cd70抗体的效应子结构域可以来自任何合适的人免疫球蛋白同种型。例如，人免疫球蛋白介导cdc和adcc/adcp的能力通常分别依序为igm≈igg1≈igg3》igg2》igg4和igg1≈igg3》igg2/igm/igg4。cd70结合多肽可表达为包含适当恒定结构域的重组融合蛋白，以产生一种或多种所需效应子功能。当与靶细胞结合时，抗cd70抗体或衍生物可通过抗体效应子功能如adcc、cdc和adcp在体外和体内触发靶细胞破坏。
[0162]
cd70结合剂可任选地缀合至剂，如细胞毒性剂、细胞抑制剂或免疫调节剂。有用类别的细胞毒性剂或免疫调节剂包括例如抗微管蛋白剂、澳瑞他汀、dna小沟结合剂、dna复制抑制剂、烷基化剂(例如，铂络合物，如顺铂、单(铂)、双(铂)和三核铂络合物和卡铂)、蒽环类、抗生素、抗叶酸、抗代谢物、化学疗法增敏剂、倍癌霉素、依托泊苷、氟化嘧啶、离子载体、莱克西菌素、亚、顺氯氨铂、预形成化合物、嘌呤抗代谢物、嘌呤霉素、放射增敏剂、类固醇、紫杉烷、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。在一些典型的实施方案中，剂是细胞毒性剂。合适的细胞毒性剂包括例如多拉司他汀(例如，澳瑞他汀e、afp、mmaf、mmae)、dna小沟结合剂(例如，烯二炔类和莱克西菌素)、倍癌霉素、紫杉烷(例如，紫杉醇和多西紫杉醇)、嘌呤霉素、长春花生物碱、cc-1065、sn-38、拓扑替康、吗啉代-多柔比星、根霉素、氰基吗啉代-多柔比星、棘霉素、考布他汀、纺锤菌素、埃博霉素a和b、雌莫司汀、隐藻素、西马多汀、类美登素、盘皮海绵内酯、艾榴塞洛素和米托蒽醌。在具体的实施方案中，细胞毒性剂或细胞抑制剂是澳瑞他汀e(在本领域中也称为多拉司他汀-10)或其衍生物。典型地，澳瑞他汀e衍生物是例如在澳瑞他汀e和酮酸之间形成的酯。例如，澳瑞他汀e可以与对乙酰基苯甲酸或苯甲酰基戊酸反应，从而分别产生aeb和aevb。其他典型的澳瑞他汀衍生物包括afp、mmaf和mmae。澳瑞他汀e及其衍生物的合成和结构描述于美国专利申请公开号20030083263和20050009751、国际专利申请号pct/us03/24209、国际专利申请号pct/us02/13435和美国专利号6,323,315；6,239,104；6,034,065；5,780,588；5,665,860；5,663,149；5,635,483；5,599,902；5,554,725；5,530,097；5,521,284；5,504,191；5,410,024；5,138,036；5,076,973；4,986,988；4,978,744；4,879,278；4,816,444；和4,486,414中。在具体的实施方案中，细胞毒性剂是dna小沟结合剂。(例如参见美国专利号6,130,237。)例如，在一些实施方案中，小沟结合剂是cbi化合物。在其他实施方案中，小沟结合剂是烯二炔(例如卡奇霉素)。抗微管蛋白剂的例子包括但不限于紫杉烷(例如，(紫杉醇))、(多西紫杉醇)、t67(tularik)、长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛和长春瑞滨)和多拉司他汀(例如，澳瑞他汀e、afp、mmaf、mmae、aeb、aevb)。其他抗微管蛋白剂包括例如巴卡丁衍生物、紫杉烷类似物(例如，埃博霉素a和b)、诺考达唑、秋水仙碱和秋水仙胺、雌莫司汀、隐藻素(cryptophysin)、西马多汀、类美登素、康普瑞汀、盘皮海绵内酯和艾榴塞洛素。在一些实施方案中，细胞毒性剂是类美登素，另一组抗微管蛋白剂。例如，在具体的实施方案中，类美登素是美登素或dm-1(immunogen,inc.；也参见chari等人,1992,cancer res.52:127-131)。
[0163]
在一些实施方案中，抗cd70抗体可以是嵌合的，包含人或非人fc区或其部分。例如，抗体可以包括非人来源的fc结构域或部分，例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼科动物、马、鸡或猴(例如猕猴、恒河猴等)。
[0164]
抗cd70结合剂(如抗体)可以是单特异性的、双特异性的、三特异性的或具有更多特异性。多特异性抗体可以对cd70的不同表位具有特异性，和/或可以对cd70以及异源蛋白二者均具有特异性。(参见例如，pct公开案wo 93/17715、wo 92/08802、wo 91/00360和wo 92/05793；tutt等人,1991,j.immunol.147:60-69；美国专利号4,474,893；4,714,681；4,925,648；5,573,920；和5,601,819；kostelny等人,1992,j.immunol.148:1547-1553。)可用于实践本文所述方法的多特异性抗体(包括双特异性和三特异性抗体)是免疫特异性地结合cd70(包括但不限于具有单克隆抗体1f6的cdr的抗体)和介导adcc、adcp和/或cdc的第二细胞表面受体或受体复合物(如cd16/fcγriii、cd64/fcγri、杀伤抑制或激活受体或补体控制蛋白cd59)的抗体。在一些实施方案中，多特异性抗体的部分与第二细胞表面分子或受体复合物的结合可增强抗cd70抗体或其他cd70结合剂的效应子功能。
[0165]
抗体可通过本领域中已知的方法来生成。例如，可以使用本领域中已知的各种技术来制备单克隆抗体，所述各种技术包括例如使用杂交瘤、重组体及噬菌体展示技术或其组合。杂交瘤技术一般论述于例如harlow等人,antibodies:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,第2版,1988)；和hammerling等人,monoclonal antibodies and t-cell hybridomas,第563-681页(elsevier,n.y.,1981)中。可用于制备抗cd70抗体的噬菌体展示方法的例子包括例如以下中披露的那些：hoogenboom和winter,1991,j.mol.biol.227:381；marks等人,1991,j.mol.biol.222:581；quan和carter,2002,the rise of monoclonal antibodies as therapeutics in anti-ige and allergic disease,jardieu和fick jr.,编,marcel dekker,new york,ny,第20章,第427-469页；brinkman等人,1995,j.immunol.methods 182:41-50；ames等人,1995,j.immunol.methods 184:177-186；kettleborough等人,1994,eur.j.immunol.24:952-958；persic等人,1997,gene 187:9-18；burton等人,1994,advances in immunology 57:191-280；pct申请号pct/gb91/01134；pct公开案wo90/02809、wo 91/10737、wo 92/01047、wo 92/18619、wo 93/11236、wo 95/15982、wo 95/20401和美国专利号5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743和5,969,108(其披露内容通过引用并入本文)。
[0166]
可用于产生单链抗体的技术的例子包括美国专利4,946,778和5,258,498；huston等人,1991,methods in enzymology 203:46-88；shu等人,1993,proc.natl.acad.sci.usa90:7995-7999；和skerra等人,1988,science 240:1038-1040中所述的那些。
[0167]
制备双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统产生基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达来进行，其中所述两条链具有不同的特异性(参见例如，milstein等人,1983,nature 305:537-39)。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))产生10种不同的抗体分子的潜在混合物，其中一些具有正确的双特异性结构。在国际公开号wo 93/08829和traunecker等人,1991,embo j.10:3655-59中披露了相似的程序。
[0168]
根据不同的方法，将具有所需结合特异性的抗体可变结构域(抗体-抗原结合位点)与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合物典型地具有免疫球蛋白重链恒定结构域，其包含铰链区、ch2区和ch3区的至少一部分。在一些实施方案中，融合物包括存在于至少一种
融合物中的含有轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(ch1)。将具有编码免疫球蛋白重链融合物和(如果需要的话)免疫球蛋白轻链的序列的核酸插入单独的表达载体中，并且共转染到合适的宿主生物体中。当构建中所使用的不等比率的三条多肽链提供最佳产率时，这在实施方案中为调整三个多肽片段的相互比例提供极大的灵活性。然而，当相等比率的至少两条多肽链的表达产生高产率时或当比率不是特别重要时，可能将两条或全部三条多肽链的编码序列插入一个表达载体中。
[0169]
在此方法的一个实施方案中，双特异性抗体具有一条臂中的具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一条臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)。这种不对称结构促进了所需双特异性化合物从不需要的免疫球蛋白链组合中的分离，因为仅在双特异性分子的一半中存在免疫球蛋白轻链提供了容易的分离方式(参见例如，国际公开号wo 94/04690，其通过引用以其整体并入本文)。
[0170]
对于双特异性抗体的进一步讨论，参见例如，suresh等人,1986,methods in enzymology 121:210；rodrigues等人,1993,j.immunology 151:6954-61；carter等人,1992,bio/technology 10:163-67；carter等人,1995,j.hematotherapy 4:463-70；merchant等人,1998,nature biotechnology 16:677-81。使用此类技术，可以制备双特异性抗体用于或预防本文定义的疾病。
[0171]
双功能抗体也描述于欧洲专利公开号epa 0 105 360中。如该参考文献中公开的，杂合或双功能抗体可以通过生物学方式(即通过细胞融合技术)或化学方式(尤其是使用交联剂或二硫桥形成试剂)获得，并且可以包含完整抗体或其片段。获得此类杂合抗体的方法披露于例如国际公开案wo 83/03679和欧洲专利公开号epa 0 217 577中，两者均通过引用并入本文。
[0172]
在一些实施方案中，人框架区中的框架残基将被来自cdr供体抗体的对应残基取代以改变或优选改善抗原结合。这些框架取代是通过本领域中熟知的方法来鉴定的，例如，通过对cdr和框架残基的相互作用建模以鉴定对于抗原结合而言重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定在特定位置的不寻常的框架残基。(参见例如，美国专利号5,585,089；riechmann等人,1988,nature 332:323)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如cdr-移植(参见例如，ep 0 239 400；pct公开案wo 91/09967；美国专利号5,225,539；5,530,101；和5,585,089)、饰面或表面重修(参见例如，ep 0 592106；ep 0 519 596；padlan,1991,molecular immunology 28(4/5):489-498；studnicka等人,1994,protein engineering 7(6):805-814；roguska等人,1994,proc.natl.acad.sci.usa91:969-973)、和链改组(参见例如，美国专利号5,565,332)(所有这些参考文献通过引用并入本文)。
[0173]
人源化单克隆抗体可以通过本领域已知的重组dna技术产生，例如使用以下中所述的方法：国际公开号wo 87/02671；欧洲专利公开号0 184 187；欧洲专利公开号0171 496；欧洲专利公开号0 173 494；国际公开号wo 86/01533；美国专利号4,816,567；欧洲专利公开号0 012 023；berter等人,1988,science 240:1041-43；liu等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:3439-43；liu等人,1987,j.immunol.139:3521-26；sun等人,1987,proc.natl.acad.sci.usa 84:214-18；nishimura等人,1987,cancer.res.47:999-1005；wood等人,1985,nature 314:446-449；shaw等人,1988,j.natl.cancer inst.80:1553-59；morrison,1985,science 229:1202-07；oi等人,1986,biotechniques 4:214；美
国专利号5,225,539；jones等人,1986,nature 321:552-25；verhoeyan等人,1988,science 239:1534；和beidler等人,1988,j.immunol.141:4053-60，其中的每一个都通过引用以其整体并入本文。
[0174]
如上所述，cd70结合剂可以是抗cd70抗体的衍生物。通常，抗cd70抗体衍生物包含抗cd70抗体(包括例如抗原结合片段或保守取代的多肽)和至少一个与抗cd70抗体异源的多肽区或其他部分。例如，可以修饰抗cd70抗体，例如通过共价附接任何类型的分子。典型的修饰包括例如糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/封闭基团进行衍生化、蛋白水解切割、与细胞配体(例如白蛋白结合分子)或其他蛋白质连接等。许多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于特异性化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。
[0175]
在一些实施方案中，共价附接不干扰效应子功能，例如不防止抗体衍生物通过抗原结合区或其衍生区域特异性结合cd70，或不防止一个或多个效应子结构域特异性结合fc受体。
[0176]
在一些实施方案中，抗体衍生物是包含一个或多个单体的多聚体，例如二聚体，其中每个单体包括(i)抗cd70抗体的抗原结合区，或由其衍生的多肽区(例如通过一个或多个氨基酸的保守取代)，和(ii)多聚化(例如二聚化)多肽区，使得抗体衍生物形成特异性结合cd70的多聚体(例如同二聚体)。在典型的实施方案中，抗cd70抗体的抗原结合区或由其衍生的多肽区与异源蛋白以重组或化学方式融合，其中所述异源蛋白包含二聚化或多聚化结构域。在出于或预防免疫障碍或表达cd70的癌症的目的而将抗体衍生物施用于受试者之前，使衍生物经受允许形成同二聚体或异二聚体的条件。如本文所用，异二聚体可包含相同的二聚化结构域但不同的cd70抗原结合区，相同的cd70抗原结合区但不同的二聚化结构域，或不同的cd70抗原结合区和二聚化结构域。
[0177]
典型的二聚化结构域是源自转录因子的那些。在一个实施方案中，二聚化结构域是碱性区亮氨酸拉链(“bzip”)的二聚化结构域(参见vinson等人,1989,science246:911-916)。有用的亮氨酸拉链结构域包括例如酵母转录因子gcn4、哺乳动物转录因子ccaat/增强子结合蛋白c/ebp、和癌基因核转化产物fos和jun的那些。(参见例如，landschultz等人,1988,science 240:1759-64；baxevanis和vinson,1993,curr.op.gen.devel.3:278-285；o’shea等人,1989,science 243:538-542。)在另一个实施方案中，二聚化结构域是碱性区螺旋-环-螺旋(“bhlh”)蛋白的二聚化结构域。(参见例如，murre等人,1989,cell 56:777-783。还参见davis等人,1990,cell 60:733-746；voronova和baltimore,1990,proc.natl.acad.sci.usa 87:4722-26。)特别有用的hhlh蛋白是myc、max和mac。
[0178]
在又其他实施方案中，二聚化结构域是免疫球蛋白恒定区，例如重链恒定区或其结构域(例如ch1结构域、ch2结构域和/或ch3结构域)。(参见例如，美国专利号5,155,027；5,336,603；5,359,046；和5,349,053；ep 0 367 166；和wo 96/04388。)
[0179]
已知异二聚体在fos与jun之间形成(bohmann等人,1987,science238:1386-1392)，在atf/creb家族的成员中形成(hai等人,1989,genes dev.3:2083-2090)，在c/ebp家族的成员中形成(cao等人,1991,genes dev.5:1538-52；williams等人,1991,genes dev.5:1553-67；roman等人,1990,genes dev.4:1404-15)，和在atf/creb与fos/jun家族的成员之间形成(hai和curran,1991,proc.natl.acad.sci.usa88:3720-24)。因此，当将cd70
结合蛋白作为包含不同二聚化结构域的异二聚体施用于受试者时，可以使用前述的任何组合。
[0180]
在其他实施方案中，抗cd70抗体衍生物是与第二抗体缀合的抗cd70抗体(“抗体异源缀合物”)(参见例如，美国专利号4,676,980)。可用于实践本发明方法的异源缀合物包含结合cd70的抗体(例如，具有单克隆抗体1f6的cdr和/或重链的抗体)和结合介导adcc、吞噬作用和/或cdc的表面受体或受体复合物(如cd16/fcgriii、cd64/fcgri、杀伤细胞激活或抑制受体、或补体控制蛋白cd59)的抗体。在一个典型的实施方案中，多特异性抗体的部分与第二细胞表面分子或受体复合物的结合增强抗cd70抗体的效应子功能。在其他实施方案中，抗体可以是剂。本文描述了合适的抗体剂。
[0181]
在一些实施方案中，本文所述的任何抗cd70抗体是非岩藻糖基化的。
[0182]
在一些实施方案中，本文提供了包含多种如本文所述的抗cd70抗体的抗cd70抗体体，其中抗cd70抗体体中的抗cd70抗体具有降低的核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少20％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少30％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少40％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少50％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少60％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少70％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少80％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少90％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少95％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少98％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少99％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中至少99.5％的抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中基本上没有(即小于0.5％)抗体具有核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗cd70抗体体中的所有抗体缺乏核心岩藻糖基化。
[0183]
如美国专利号10,196,445中所述，抗体糖基化的修饰可以通过例如在具有改变的糖基化机制的宿主细胞中表达抗体来实现。已经描述了具有改变的糖基化机制的细胞，并且可以将其用作表达本公开文本的重组抗体的宿主细胞，从而产生具有改变的糖基化的抗体。例如，细胞系ms704、ms705和ms709缺乏岩藻糖基转移酶基因，fut8(α-(1,6)岩藻糖基转移酶(参见美国专利申请公开号20040110704；yamane-ohnuki等人(2004)biotechnol.bioeng.87:614)，使得在这些细胞系中表达的抗体在其碳水化合物上缺乏岩藻糖。作为另一个例子，ep 1176195还描述了具有功能性破坏的fut8基因的细胞系以及将岩藻糖添加到结合抗体fc区的n-乙酰葡糖胺的活性很小或没有的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系yb2/0(atcc crl 1662)。pct公开案wo 03/035835描述了变体cho细胞系lec13，其具有降低的将岩藻糖附接至asn(297)连接的碳水化合物的能力，还导致了在该宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖基化。还参见shields等人(2002)j.biol.chem.277:26733。具有修饰的糖基化谱的抗体也可以在鸡蛋中产生，如pct公开号wo2006/089231中所述。可替代地，可以在植物细胞如浮萍属(lemna)中产生具有修饰的糖基化谱的抗体。参见例如美国公开号2012/0276086。pct公开号wo 99/54342描述了如下细胞系，其被工程化为表达修饰糖蛋白
的糖基转移酶(例如，β(1,4)-n-乙酰葡糖胺转移酶iii(gntiii))，使得在工程化细胞系中表达的抗体展现出增加的二分型glcnac结构，这导致抗体的adcc活性增加。还参见等人(1999)nat.biotech.17:176。可替代地，抗体的岩藻糖残基可使用岩藻糖苷酶切割掉。例如，酶α-l-岩藻糖苷酶从抗体中除去岩藻糖基残基。tarentino等人(1975)biochem.14:5516。具有降低的核心岩藻糖基化的抗体可通过在已经使用基因敲除、基因敲入或rnai经工程化以降低核心岩藻糖基化的细胞系中产生抗体来制备。作用于糖基化途径中的酶的小分子抑制剂也可用于产生具有降低的核心岩藻糖基化的抗体。在美国专利号8,163,551中描述了此类方法。在一些实施方案中，如本文所述的具有降低的核心岩藻糖基化的抗cd70抗体通过在包含有效量的岩藻糖类似物的培养基中培养表达所述抗体的宿主细胞来产生，所述岩藻糖类似物降低了岩藻糖向由宿主细胞产生的抗体或抗体衍生物的复合n-糖苷连接糖链中的掺入。参见美国专利号8,163,551。pereira等人(2018)mabs 10(5):693-711也描述了产生非岩藻糖基化抗体的方法。
[0184]
在一些实施方案中，抗cd70抗体或其衍生物竞争性抑制mab 1f6与cd70的结合，如通过本领域已知的用于测定竞争性结合的任何方法(例如本文所述的免疫测定)所测定。在典型的实施方案中，抗体竞争性抑制1f6与cd70的结合至少50％、至少60％、至少70％或至少75％。在其他实施方案中，抗体竞争性抑制1f6与cd70的结合至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。
[0185]
可通过各种已知方法中的任一种测定抗体与cd70的特异性结合。可以使用的免疫测定包括例如，使用诸如蛋白质印迹等技术的竞争性和非竞争性测定系统、放射免疫测定、elisa(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定和蛋白a免疫测定。此类测定是常规的并且是本领域熟知的。(参见例如，ausubel等人编,short protocols in molecular biology(john wiley and sons,inc.,纽约,第4版1999)；harlow和lane,using antibodies:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,纽约州,1999)。
[0186]
此外，抗体与cd70的结合亲和力以及抗体cd70相互作用的解离速率可以通过竞争性结合测定来确定。竞争性结合测定的一个例子是放射免疫测定，其包括在渐增量的未经标记的cd70的存在下，将经标记的cd70(例如3h或
125
i)与目的抗体一起孵育，并且检测与经标记的cd70结合的抗体。然后，抗体与cd70的亲和力和结合解离速率可以通过scatchard图分析的数据来测定。与第二抗体(例如mab 1f6)的竞争也可以使用放射免疫测定来测定。在这种情况下，在渐增量的未经标记的第二抗体的存在下，将cd70与目的抗体一起孵育，所述目的抗体与经标记的化合物(例如，3h或
125
i)缀合。可替代地，抗体与cd70的结合亲和力以及抗体-cd70相互作用的结合和解离速率可以通过表面等离子体共振来测定。在一些实施方案中，抗cd70抗体或其衍生物可以靶向并积聚在表达cd70的细胞的膜上。
[0187]
抗cd70抗体及其衍生物可通过本领域已知的用于合成蛋白质的方法来产生，典型地例如通过重组表达技术来产生。与cd70结合的抗体或其衍生物的重组表达典型地包括构建含有编码抗体或其衍生物的核酸的表达载体。可以使用本领域已知的技术通过重组dna技术来产生用于产生蛋白质分子的载体。标准技术例如在sambrook和russell,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,纽约
州,第3版,2001)；sambrook等人,molecular cloning:a laboratory manual(cold spring harbor laboratory press,冷泉港,纽约州,第2版,1989)；short protocols in molecular biology(ausubel等人,john wiley and sons,纽约,第4版,1999)；以及glick和pasternak,molecular biotechnology:principles and applications of recombinant dna(asm press,华盛顿,第2版,1998)中描述的那些可以用于重组核酸方法、核酸合成、细胞培养、转基因掺入和重组蛋白表达。
[0188]
例如，对于抗cd70抗体的重组表达，表达载体可以编码所述抗体的重链或轻链，或重链或轻链可变结构域，其可操作地连接至启动子。表达载体可以包括例如编码抗体分子的恒定区的核苷酸序列(参见例如，pct公开案wo 86/05807；pct公开案wo89/01036；和美国专利号5,122,464)，并且可以将抗体的可变结构域克隆到这种载体中以表达整个重链或轻链。通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后通过常规技术培养转染的细胞以产生抗cd70抗体。在用于表达双链抗体的典型实施方案中，可以在宿主细胞中共表达编码重链和轻链的载体以表达整个免疫球蛋白分子。
[0189]
多种原核和真核宿主表达载体系统可用于表达抗cd70抗体或其衍生物。典型地，真核细胞用于表达重组蛋白，特别是对于完整重组抗cd70抗体分子。例如，与载体(如来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件)结合使用的哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(cho)是用于产生抗cd70抗体及其衍生物的有效表达系统(参见例如，foecking等人,1986,gene 45:101；cockett等人,1990,bio/technology 8:2)。
[0190]
其他宿主表达系统包括例如细菌细胞中基于质粒的表达系统(参见例如，ruther等人,1983,embo 1,2:1791；inouye和inouye,1985,nucleic acids res.13:3101-3109；van heeke和schuster,1989,j.biol.chem.24:5503-5509)；昆虫系统，例如在草地贪夜蛾细胞中使用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(acnpv)表达载体；和哺乳动物细胞中基于病毒的表达系统，例如基于腺病毒的系统(参见例如，logan和shenk,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:355-359；bittner等人,1987,methods in enzymol.153:51-544)。
[0191]
此外，可以选择调节插入序列的表达或以所需具体方式修饰并加工基因产物的宿主细胞株。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保对表达的蛋白质的正确修饰和加工(例如，糖基化、磷酸化和切割)。为此，可以使用具有用于适当加工初级转录物和基因产物的细胞机制的真核宿主细胞。这样的哺乳动物宿主细胞包括例如cho、vero、bhk、hela、cos、mdck、293、3t3和w138。
[0192]
稳定的表达系统典型地用于重组抗cd70抗体或其衍生物或其他cd70结合剂的长期高产率生产。例如，稳定表达抗cd70抗体或其衍生物的细胞系可通过用由适当的表达控制元件(例如，启动子和增强子序列、转录终止子、多腺苷酸化位点)和选择性标记物控制的dna转化宿主细胞、然后使转化的细胞在选择性培养基中生长来工程化。选择性标记物赋予对选择的抗性，并允许细胞将dna稳定地整合到它们的染体中并生长以形成集落，进而可以克隆并扩增成细胞系。可以使用许多选择系统，包括例如单纯疱疹病毒胸苷激酶、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶基因，它们可以分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可用作以下基因的选择基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性；neo，其赋予对氨基糖苷g-418的抗性；和hygro，
其赋予对潮霉素的抗性。重组dna技术领域中通常已知的方法可常规地用于选择所需的重组克隆，并且此类方法描述于例如current protocols in molecular biology(ausubel等人编,john wiley and sons,纽约州,1993)；kriegler,gene transfer and expression,a laboratory manual(stockton press,纽约州,1990)；current protocols in human genetics(dracopoli等人编,john wiley and sons,纽约州,1994,第12和13章)；以及colberre-garapin等人,1981,j.mol.biol.150:1中。
[0193]
可以通过载体扩增来增加抗体或衍生物的表达水平。(一般参见，例如，bebbington和hentschel,the use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in dna cloning,第3卷(academic press,纽约,1987)。)当表达抗cd70抗体或其衍生物的载体系统中的标记物是可扩增的时，宿主细胞培养基中存在的抑制剂水平的增加将选择具有增加拷贝数的赋予对抑制剂的抗性的标记基因的宿主细胞。相关抗体基因的拷贝数也将增加，从而增加抗体或其衍生物的表达(参见crouse等人,1983,mol.cell.biol.3:257)。
[0194]
当抗cd70抗体包含重链和轻链或其衍生物时，可将宿主细胞用两种表达载体共转染，第一种载体编码重链蛋白，第二种载体编码轻链蛋白。这两种载体可以含有相同的选择性标记物，其使得重链和轻链蛋白的表达相同。可替代地，可以使用编码并能够表达重链和轻链蛋白二者的单一载体。在这种情况下，通常将轻链置于重链之前以避免过量的毒性游离重链(参见proudfoot,1986,nature 322:52；kohler,1980,proc.natl.acad.sci.usa 77:2197)。重链和轻链的编码序列可以包含cdna或基因组dna。
[0195]
一旦产生了抗cd70抗体或其衍生物(例如，通过动物、化学合成或重组表达)，可以通过用于纯化蛋白质的任何合适的方法纯化，包括，例如，通过谱(例如，离子交换或亲和谱(例如，用于纯化具有完整fc区的抗体的蛋白a谱))、离心、差异溶解度、或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术进行纯化。抗cd70抗体或其衍生物可例如与标记序列如肽融合，以促进通过亲和谱进行纯化。合适的标记氨基酸序列包括例如，六组氨酸肽，如pqe载体(qiagen,inc.，查茨沃思(chatsworth)，加利福尼亚州，91311)中提供的标签；和“ha”标签，其对应于衍生自流感血凝素蛋白的表位(wilson等人,1984,cell 37:767)；和“flag”标签。
[0196]
一旦产生抗cd70抗体或其衍生物，其对表达cd70的癌细胞发挥细胞抑制或细胞毒性作用或对表达cd70的免疫细胞发挥免疫调节作用的能力通过下文所述或本领域已知的方法来测定。
[0197]
为了使激活的免疫细胞或表达cd70的癌细胞外的抗cd70抗体的活性最小化，可使用特异性结合细胞膜结合的cd70但不结合可溶性cd70的抗体，使得抗cd70抗体集中在激活的免疫细胞或表达cd70的癌细胞的细胞表面。
[0198]
典型地，抗cd70抗体或衍生物是基本上纯化的(例如，基本上不含限制其作用或产生不期望的副作用的物质)。在一些实施方案中，抗cd70抗体或衍生物的纯度为至少约40％、至少约50％或至少约60％。在一些实施方案中，抗cd70抗体或衍生物的纯度为至少约60％-65％、65％-70％、70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-98％。在一些实施方案中，抗cd70抗体或衍生物的纯度为大约99％。iii.方法
[0199]
本发明提供了受试者中表达cd70的癌症如髓系恶性肿瘤的方法，其包括向所述受试者施用有效量的抗cd70抗体，如本文所述的非岩藻糖基化抗cd70抗体。髓系恶性肿瘤包括急性髓系白血病(aml)、骨髓增殖性障碍(mpds)、骨髓增生异常综合征(mds)和骨髓增生异常/骨髓增殖性综合征，它们都是克隆性干细胞(hsc)或祖细胞恶性障碍。在一些实施方案中，癌症是mds。在一些实施方案中，癌症是aml。mds涵盖多种亚型，包括伴有单系发育异常的mds、伴有环形铁粒幼细胞的mds、伴有多系发育异常的mds、伴有过量原始细胞的mds、伴有分离的del(5q)的mds和不可分类的mds。mds的特征在于一种或多种骨髓谱系中的无效造血作用。早期mds主要展现出过度细胞凋亡和造血细胞发育异常。在约三分之一的mds患者中，这种无效的造血作用之后进展为继发性aml(saml)。aml是白细胞髓系的恶性肿瘤。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用有效量的非岩藻糖基化抗cd70抗体，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少30％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少40％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少50％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少60％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少70％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少80％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少90％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少95％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少98％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少99％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，所述方法包括向受试者施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中至少99.5％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与低甲基化剂(hma)组合施用。在一些实施方案中，hma是阿扎胞苷。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与bh3-模拟物组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与维奈妥拉组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与hma和bh3-模拟物组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与hma和维奈妥拉组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与阿扎胞苷和bh3-模拟物组合施用。在一些实施方案中，将抗cd70抗体与阿扎胞苷和维奈妥拉组合施用。
[0200]
在一些实施方案中，本文提供了一种受试者中表达cd70的mds的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗cd70抗体。在一些实施方案中，抗cd70抗体是非岩藻糖基化的。在一些实施方案中，mds是复发性或难治性mds。在一些实施方案中，mds是复发性mds。在一些实施方案中，mds是难治性mds。在一些实施方案中，受试者在先前的针对mds的低甲
基化剂(hma)疗法后经历了失败。hma(也称为去甲基化剂)是抑制dna甲基化的药物。在一些实施方案中，hma是dna甲基转移酶抑制剂。在一些实施方案中，hma是阿扎胞苷。在一些实施方案中，hma是地西他滨。
[0201]
在一些实施方案中，本文提供了一种受试者中表达cd70的aml的方法，其包括施用有效量的本文所述的抗cd70抗体。在一些实施方案中，抗cd70抗体是非岩藻糖基化的。在一些实施方案中，aml是复发性或难治性aml。在一些实施方案中，aml是复发性aml。在一些实施方案中，aml是难治性aml。在一些实施方案中，受试者接受了1种先前方案以aml。在一些实施方案中，受试者接受了2种先前方案以aml。在一些实施方案中，受试者接受了3种先前方案以aml。
[0202]
在一些实施方案中，至少约0.1％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的来自受试者的癌细胞表达cd70。在一些实施方案中，至少0.1％、至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的来自受试者的癌细胞表达cd70。在一些实施方案中，使用免疫组织化学(ihc)测定表达cd70的细胞的百分比。在一些实施方案中，使用流式细胞术测定表达cd70的细胞的百分比。在一些实施方案中，使用酶联免疫吸附测定(elisa)来测定表达cd70的细胞的百分比。
[0203]
在一方面，用本文所述的抗cd70抗体癌症的方法导致在施用抗体后所述受试者中一种或多种效果相对于基线的改善。在一些实施方案中，所述一种或多种效果是客观反应率、反应持续时间、达到反应的时间、无进展存活期、总存活期或其任何组合。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是疾病稳定。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是部分反应。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是完全反应。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是客观反应率。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是反应持续时间。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是达到反应的时间。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是无进展存活期。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是总存活期。在一个实施方案中，所述一种或多种效果是癌症消退。
[0204]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，对用如本文所述的抗cd70抗体的反应可以包括以下标准(cheson标准)：
oncol 21(24):4642-9)进行修改。
[0205]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，对用如本文所述的抗cd70抗体的反应可以包括以下标准(cheson标准)：
没有示出iwg反应标准的删除。为了将血红蛋白从克/分升转换为克/升，将克/分升乘以10。mds表示骨髓增生异常综合征；hgb，血红蛋白；cr，完全缓解；hi，血液学改善；pr，部分缓解；fab，法国-美国-英国；pfs，无进展存活期；dfs，无病存活期。*发育异常变化应考虑发育异常变化的正常范围(修改)。(ramos f,fernandez-ferrero s,suarez d,等人myelodysplastic syndrome:a search for minimal diagnostic criteria.leuk res.1999；23:283-290)对iwg反应标准的修改。在一些情况下，方案疗法可能需要在4-周时间段前开始进一步(例如巩固、维持)。此类受试者可包括在疗法开始时适合的反应类别中。重复化疗过程中的短暂性血细胞减少不应被认为中断反应的持久性，只要它们恢复到前一疗程的改善计数即可。(cheson bd,greenberg pl,bennett jm,lowenberg b,wijermans pw,nimer sd,pinto a,beran m,de witte tm,stone rm,mittelman m,sanz gf,gore sd,schiffer ca,kantarjian h(2006).clinical application and proposal for modification of the international working group(iwg)response criteria in myelodysplasia.blood 108(2):419-25)。
rbc＝红细胞a间隔≥1周的至少2次测量(不受输血影响)的前计数平均值(修改)。b对iwg反应标准的修改。c在没有其他解释如急性感染、重复化疗疗程(修改)、胃肠道出血、溶血等的情况下。建议总体上报告2种红系和血小板反应，并按个体反应模式报告(cheson 2006)
[0206]
在本文提供的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，用本文所述的抗cd70抗体的有效性通过测量客观反应率来评估。在一些实施方案中，客观反应率是具有预定义量的肿瘤大小减小且持续最小时间段的患者的比例。在一些实施方案中，客观反应率是基于cheson标准。在一个实施方案中，客观反应率是至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约20％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约30％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约40％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约50％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约60％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约70％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约85％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约90％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约95％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约98％。在一个实施方案中，客观反应率是至少约99％。在一个实施方案中，客观反应率是至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少20％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少30％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少40％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少50％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少60％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少70％-80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少80％。在一个实施方案中，客观反应率是至少85％。在一个实施方案中，客观反应率是至少90％。在一个实施方案中，客观反应率是至少95％。在一个实施方案中，客观反应率是至少98％。在一个实施方案中，客观反应率是至少99％。在一个实施方案中，客观反应率是100％。
[0207]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，对用本文所
述的抗cd70抗体的反应通过测量在施用本文所述的抗cd70抗体后的无进展存活期的时间来评估。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约6个月的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约一年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约两年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约三年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约四年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约五年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年或至少五年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少6个月的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少一年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少两年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少三年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少四年的无进展存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少五年的无进展存活期。
[0208]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，对用本文所述的抗cd70抗体的反应通过测量在施用本文所述的抗cd70抗体后的总存活期的时间来评估。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约6个月的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约一年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约两年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约三年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约四年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约五年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少约12个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年或至少五年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少6个月的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗
cd70抗体后，所述受试者展现出至少一年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少两年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少三年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少四年的总存活期。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少五年的总存活期。
[0209]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，对用本文所述的抗cd70抗体的反应通过测量在施用本文所述的抗cd70抗体后对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间来评估。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约6个月。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约一年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约两年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约三年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约四年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约五年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少十八个月、至少两年、至少三年、至少四年或至少五年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少6个月。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少一年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少两年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少三年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少四年。在一些实施方案中，在施用本文所述的抗cd70抗体后，对本文所述的抗cd70抗体的反应的持续时间是至少五年。
[0210]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，向受试者施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体导致受试者中癌细胞的耗竭。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体导致癌细胞耗竭至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约5％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约10％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之
前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约20％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约30％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约40％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约50％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约60％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约70％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约80％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约90％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约95％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少约99％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭约100％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体导致癌细胞耗竭至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少约15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少60％、至少70％、至少约80％、至少约90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少5％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少10％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少20％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少30％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少40％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少50％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少60％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少70％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少80％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少90％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少95％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭至少99％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，癌细胞耗竭100％。
[0211]
在本文所述的方法或用途或用于所述用途的产品的一个实施方案中，向受试者施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体不会导致受试者中cd70+t调节性细胞(cd70+treg)的耗竭。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体导致cd70+treg耗竭不超过约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或约0.1％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约50％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约40％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约30％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约20％。
在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约10％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约5％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约1％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过约0.1％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，施用本文所述的抗cd70抗体如非岩藻糖基化抗cd70抗体导致cd70+treg耗竭不超过50％、40％、30％、20％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0.1％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过50％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过40％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过30％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过20％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过10％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过5％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过1％。在一些实施方案中，与向受试者施用抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，cd70+treg耗竭不超过0.1％。
[0212]
在一些实施方案中，岩藻糖基化抗cd70抗体比包含相同重链和轻链氨基酸序列的非岩藻糖基化形式的抗cd70抗体更大程度地耗竭受试者中的cd70+treg。在一些实施方案中，当受试者为高亲和力fcγriiia受体纯合型(v/v 158)时，岩藻糖基化抗cd70抗体比包含相同重链和轻链氨基酸序列的非岩藻糖基化形式的抗cd70抗体更大程度地耗竭受试者中的cd70+treg。在一些实施方案中，当受试者为低亲和力fcγriiia受体纯合型(f/f 158)时，岩藻糖基化抗cd70抗体与包含相同重链和轻链氨基酸序列的非岩藻糖基化形式的抗cd70抗体在相同程度上耗竭受试者中的cd70+treg。在一些实施方案中，当受试者为高亲和力fcγriiia受体纯合型(v/v 158)时，岩藻糖基化抗cd70抗体和包含相同重链和轻链氨基酸序列的非岩藻糖基化形式的抗cd70抗体均不耗竭cd8 t细胞。在一些实施方案中，当受试者为低亲和力fcγriiia受体纯合型(f/f 158)时，岩藻糖基化抗cd70抗体和包含相同重链和轻链氨基酸序列的非岩藻糖基化形式的抗cd70抗体均不耗竭cd8 t细胞。iv.细胞毒性、细胞抑制和免疫调节活性的测定
[0213]
确定抗体是否介导针对靶细胞的效应子功能的方法是已知的。此类方法的说明性例子在下文中描述。
[0214]
为了确定抗cd70抗体是否介导针对激活的免疫细胞或表达cd70的癌细胞的抗体依赖性细胞毒性，可以使用在抗体和效应免疫细胞的存在下测量靶细胞死亡的测定。用于测量这类细胞毒性的测定可基于在效应细胞和靶标特异性抗体存在下孵育后从代谢标记的靶细胞释放
51
cr的测定(参见例如，perussia和loza,2000,methods in molecular biology 121:179-92；以及“51
cr release assay of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity(adcc)”current potocols in immunology,coligan等人编,wileyand sons,1993)。例如，可用不同浓度的抗cd70抗体处理用na
251
cro4标记并以5,000个细胞/孔的密度铺板在96孔板的激活的免疫细胞(例如，激活的淋巴细胞)或表达cd70的癌细胞30分
钟，然后与正常人外周血单个核细胞(pbmc)混合4小时。伴随靶细胞死亡的膜破坏将
51
cr释放到培养物上清液中，可将其收集并评估放射性作为细胞毒性活性的量度。测量adcc的其他测定可涉及非放射性标记或基于特定酶的诱导释放。例如，基于时间分辨荧光测定法的非放射性测定是可商购的(delphia，perkin elmer)。该测定基于用荧光增强配体的乙酰氧基甲酯(batda)加载靶细胞，所述荧光增强配体的乙酰氧基甲酯穿透细胞膜，然后水解形成膜不可渗透的亲水配体(tda)。当与靶标特异性抗体和pbmc效应细胞混合时，tda从裂解细胞中释放，并且当与铕混合时可用于形成高荧光螯合物。用时间分辨荧光计测量的信号与细胞裂解的量相关。
[0215]
为了确定抗cd70抗体是否介导针对激活的免疫细胞或表达cd70的癌细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用，可以使用测量效应免疫细胞(例如，新鲜培养的巨噬细胞或建立的巨噬细胞样细胞系)进行的靶细胞内化的测定(参见例如，munn和cheung,1990,j.exp.med.172:231-37；keler等人,2000,j.immunol.164:5746-52；akewanlop等人,2001,cancer res.61:4061-65)。例如，可将靶细胞用亲脂性膜染料如pkh67(sigma)标记，用靶标特异性抗体包被，并与效应免疫细胞混合4-24小时。然后可以通过用对吞噬细胞表面标记物(例如cd14)特异的荧光染料标记的抗体复染来鉴定效应细胞，并通过双流式细胞术或荧光显微术分析细胞。双阳性细胞代表具有内化靶细胞的效应细胞。对于这些测定，效应细胞可以是衍生自pbmc的单核细胞，其已经通过用m-csf或gm-csf培养5-10天而分化成巨噬细胞(参见例如，munn和cheung,同上)。可从atcc获得的人巨噬细胞样细胞系u937(larrick等人,1980,j.immunology 125:6-12)或thp-1(tsuchiya等人,1980,int.j.cancer 26:171-76)可用作替代的吞噬细胞来源。
[0216]
确定抗体在与靶细胞结合后是否介导补体依赖性细胞毒性的方法也是已知的。相同的方法可用于确定抗cd70抗体是否介导对激活的免疫细胞或表达cd70的癌细胞的cdc。此类方法的说明性例子在下文中描述。
[0217]
活性补体的来源可以是正常人血清或从包括兔在内的实验动物中纯化。在标准测定中，在补体的存在下将抗cd70抗体与表达cd70的激活的免疫细胞(例如激活的淋巴细胞)或表达cd70的癌细胞一起孵育。这种抗cd70抗体介导细胞裂解的能力可通过若干读出测定。在一个例子中，使用na
51
cro4释放测定。在该测定中，用na
51
cro4标记靶细胞。洗去未掺入的na
51
cro4，并将细胞以合适的密度，通常为5,000至50,000个细胞/孔铺板在96孔板中。在正常血清或纯化的补体的存在下与抗cd70抗体的孵育典型地是在37℃下在5％co2气氛中持续2-6小时。通过γ射线计数测定培养上清液的等分试样中指示细胞裂解的所释放的放射性。通过去污剂(0.5％-1％np-40或triton x-100)处理释放掺入的na
51
cro4来测定最大细胞裂解。在仅存在补体而没有任何抗cd70抗体的孔中测定自发背景细胞裂解。细胞裂解百分比计算为(抗cd70抗体诱导的裂解-自发裂解)/最大细胞裂解)。第二个读出是活细胞对代谢染料例如阿尔玛蓝的还原。在该测定中，将靶细胞与抗cd70抗体和补体一起孵育，并如上所述孵育。在孵育结束时，添加1/10体积的阿尔玛蓝(biosource international，卡马里奥(camarillo)，加利福尼亚州)。在37℃下在5％co2气氛中继续孵育长达16小时。通过在530nm激发和590nm发射的荧光分析测定作为代谢活性活细胞指示物的阿尔玛蓝还原。第三个读出是细胞膜对碘化丙啶(pi)的渗透性。由于补体激活而在质膜中形成孔有助于pi进入细胞，在那里它将扩散到细胞核中并结合dna。与dna结合后，600nm的pi荧光显著增加。用抗
cd70抗体和补体处理靶细胞如上所述进行。孵育结束时，添加pi至终浓度为5μg/ml。然后使用用于激发的488nm氩激光通过流式细胞术检查细胞悬浮液。通过在600nm的荧光发射检测裂解的细胞。v.包含抗cd70抗体的药物组合物及其施用
[0218]
可以将包含抗cd70抗体的组合物施用于患有或有风险患上表达cd70的癌症的受试者。本发明还提供了抗cd70抗体在制造用于预防或表达cd70的癌症的药物中的用途。如本文所用，术语“受试者”是指可以被施用cd70结合剂的任何哺乳动物患者，包括例如人和非人哺乳动物，如灵长类动物、啮齿动物和狗。专门用于使用本文所述方法进行的受试者包括人。在预防或表达cd70的癌症中，可以将抗体单独施用或与其他组合物组合施用。
[0219]
各种递送系统是已知的并且可用于施用抗cd70抗体。引入方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。抗cd70抗体可例如通过输注或推注(例如静脉内或皮下)、通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并且可与其他生物活性剂如化疗剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。在一个实施方案中，本文所述的抗cd70抗体经肠胃外施用。肠胃外施用是指除肠内和外用施用以外的施用方式，通常是通过注射施用，并且包括表皮、静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心脏内、真皮内、腹膜内、腱内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、颅内、胸腔内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在一些实施方案中，本文所述的抗cd70抗体的施用途径是静脉内注射或输注。在一些实施方案中，本文所述的抗cd70抗体的施用途径是静脉内输注。
[0220]
在具体实施方案中，抗cd70抗体组合物通过注射、通过导管、通过栓剂或通过植入物来施用，所述植入物为多孔、无孔或凝胶状材料，包括膜(如sialastic膜)或纤维。通常，当施用组合物时，使用抗cd70抗体不吸收的材料。
[0221]
可将抗cd70抗体作为包含有效量的抗体和一种或多种药学上相容的成分的药物组合物施用。例如，药物组合物典型地包含一种或多种药物载体(例如，无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)。当静脉内施用药物组合物时，水是更典型的载体。盐水溶液和水性右旋糖和甘油溶液也可以用作液体载体，特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括例如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果希望，组合物还可以含有少量的润湿剂或乳化剂、或ph缓冲剂。这些组合物可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释配制品等形式。所述组合物可以用传统的粘合剂和载体(如甘油三酯)配制成栓剂。口服配制品可包括标准载体如药物级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的例子描述于e.w.martin的“remington’s pharmaceutical sciences”中。此类组合物将含有有效量的典型地呈纯化形式的蛋白质连同合适量的载体，以便提供用于适当施用于患者的形式。配制品与施用方式相对应。
[0222]
在典型的实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制为适于静脉内施用于人的药物组合物。典型地，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述药物组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂(如利多卡因)以缓解注射部位的疼痛。通常，成分分开或混合在一起以单位剂型提供，例如，作为在气密密封容器中的干燥的
冻干粉或无水浓缩物，所述气密密封容器例如是指明活性剂的量的安瓿瓶或小药囊。在通过输注施用药物时，可以用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶进行分配。在通过注射施用药物时，可以提供一安瓿瓶的无菌注射用水或盐水，使得可以在施用前将成分混合。
[0223]
此外，药物组合物可以作为药物试剂盒提供，所述药物试剂盒包含(a)含有冻干形式的抗cd70抗体的容器和(b)含有药学上可接受的注射用稀释剂(例如无菌水)的第二容器。药学上可接受的稀释剂可用于重构或稀释冻干的抗cd70抗体。任选地，与一个或多个此类容器相关的可以是由管理药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定的形式的通告，所述通告反映了制造、使用或销售机构批准用于人施用。
[0224]
可通过标准临床技术确定有效或预防表达cd70的癌症的抗cd70抗体的量。另外，可以任选地采用体外测定来帮助鉴定最佳剂量范围。待用于配制品中的确切剂量还将取决于施用途径以及表达cd70的癌症的阶段，并且应当根据从业者的判断和每名患者的情况决定。可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量-反应曲线外推有效剂量。
[0225]
例如，抗cd70抗体的毒性和功效可在细胞培养物或实验动物中通过用于测定ld
50
(使50％体致死的剂量)和ed
50
(在50％体中有效的剂量)的标准药学程序来测定。毒性效应与效果之间的剂量比率是指数，并且其可以被表示为比率ld
50
/ed
50
。展现出大指数的抗cd70抗体是优选的。当抗cd70抗体展现出毒副作用时，可使用将抗cd70抗体靶向受累组织部位的递送系统，以最小化对非cd70表达细胞的潜在损害，从而减少副作用。
[0226]
从细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制用于人的剂量范围。抗cd70抗体的剂量通常在包括ed50在内的循环浓度范围内，伴随毒性很小或没有毒性。剂量可取决于所采用的剂型和所利用的施用途径而在这个范围内变化。对于在该方法中使用的抗cd70抗体，有效剂量最初可以根据细胞培养测定估计。可以在动物模型中配制剂量，以达到包括如在细胞培养中确定的ic
50
(即，测试化合物实现症状的半最大抑制的浓度)在内的循环血浆浓度范围。这样的信息可以用于更准确地确定在人中的有用剂量。可以例如通过高效液相谱测量血浆中的水平。
[0227]
通常，施用于患有表达cd70的癌症的患者的抗cd70抗体的剂量为约0.1mg/kg至100mg/kg受试者体重。更典型地，施用于受试者的剂量为0.1mg/kg至50mg/kg受试者体重，甚至更典型地为1mg/kg至30mg/kg、1mg/kg至20mg/kg、1mg/kg至15mg/kg、1mg/kg至12mg/kg、1mg/kg至10mg/kg或1mg/kg至7.5mg/kg受试者体重。在一些实施方案中，抗cd70抗体的剂量为1.5mg/kg。在一些实施方案中，剂量为5mg/kg。在一些实施方案中，剂量为10mg/kg。在一些实施方案中，剂量为20mg/kg。通常，由于对外来蛋白的免疫应答，在人体内人抗体的半衰期比来自其他物种的抗体的半衰期长。因此，较低剂量的包含抗cd70抗体的人源化或嵌合抗体和较低频率的施用通常是可能的。
[0228]
可以将抗cd70抗体的剂量例如每天、每周一次(每周)、每周两次、每周三次、每周四次、每周五次、每两周、每月或根据需要以其他方式施用。
[0229]
在一些实施方案中，抗cd70抗体的剂量对应于次优剂量(即，低于抗cd70抗体的ec
50
)。例如，抗cd70抗体的剂量可包括选自窗的最低25％、最低15％、最低10％或最低5％的剂量。如本文所用，术语“窗”是指提供安全和有效疗法的药物剂量范围或其在身体系统中的浓度范围。
[0230]
在一些实施方案中，抗cd70抗体的剂量为约0.05mg/kg至约1mg/kg、或约0.1mg/kg至约0.9mg/kg、或约0.15至约0.75mg/kg受试者体重。这样的剂量可以每周施用1至约15次。各剂量可以相同或不同。例如，约0.15mg/kg剂量的抗cd70抗体可以按每四天、五天、六天或七天时间段施用1至10次。
[0231]
在一些实施方案中，包含抗cd70抗体的药物组合物还可包含剂(例如，非缀合的细胞毒性剂或免疫调节剂，例如本文所述的那些中的任一种)。抗cd70结合剂也可与一种或多种用于或预防表达cd70的癌症的剂组合共同施用。例如，组合疗法可包括剂(例如，细胞抑制剂、细胞毒性剂或免疫调节剂，如未缀合的细胞抑制剂、细胞毒性剂或免疫调节剂，如常规用于癌症的那些)。组合疗法还可包括例如施用靶向激活的淋巴细胞、树突细胞或表达cd70的癌细胞的表面上除cd70以外的受体或受体复合物的药剂。这种药剂的例子包括与激活的淋巴细胞、树突细胞或表达cd70的癌细胞的表面处的分子结合的第二非cd70抗体。另一个例子包括靶向这种受体或受体复合物的配体。通常，这样的抗体或配体与激活的淋巴细胞、树突细胞或表达cd70的癌细胞上的细胞表面受体结合，并通过向激活的淋巴细胞、树突细胞或表达cd70的癌细胞递送细胞抑制或细胞毒性信号来增强抗cd70抗体的细胞毒性或细胞抑制作用。这种组合施用可对疾病参数(例如，症状的严重性、症状的数量或复发的频率)具有累加或协同作用。另一个例子包括低甲基化剂(hma)。在一些实施方案中，hma是阿扎胞苷另一个例子包括bh3-模拟物。另一个例子包括维奈妥拉在一些实施方案中，药物组合物包含抗cd70抗体、hma和bh3-模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含抗cd70抗体、hma和维奈妥拉。在一些实施方案中，药物组合物包含抗cd70抗体、阿扎胞苷和bh3-模拟物。在一些实施方案中，药物组合物包含抗cd70抗体、阿扎胞苷和维奈妥拉。
[0232]
关于用于组合施用的方案，在一个具体的实施方案中，将抗cd70抗体与剂同时施用。在另一个具体的实施方案中，将剂在施用抗cd70抗体之前或之后施用，在施用抗cd70抗体之前或之后至少一小时且多达数月，例如至少一小时、五小时、12小时、一天、一周、一个月或三个月施用。在一些实施方案中，在施用抗cd70抗体和任选地剂后监测受试者。vi.制品和试剂盒
[0233]
在另一方面，提供了一种制品或试剂盒，所述制品或试剂盒包含本文所述的抗cd70抗体。制品或试剂盒还可以包含本文所述的抗cd70抗体在本发明的方法中的使用说明书。因此，在某些实施方案中，制品或试剂盒包含本文所述的抗cd70抗体在受试者的癌症(例如髓系恶性肿瘤)的方法中的使用说明书，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的抗cd70抗体。在一些实施方案中，癌症是mds。在一些实施方案中，癌症是aml。在一些实施方案中，癌症是复发性或难治性癌症。在一些实施方案中，所述受试者是人。
[0234]
所述制品或试剂盒还可以包含容器。合适的容器包括例如瓶、小瓶(例如双室小瓶)、注射筒(如单室或双室注射筒)和试管。在一些实施方案中，所述容器是小瓶。所述容器可以用各种材料(如玻璃或塑料)制成。所述容器容纳配制品。
[0235]
制品或试剂盒还可以包含在容器上或与容器相关联的标签或药品说明书，所述标签或药品说明书可以指示重构和/或使用配制品的说明。所述标签或药品说明书可以进一步指示所述配制品可用于或旨在用于皮下、静脉内(例如，静脉内输注)或用于受试者
中的癌症的其他施用方式。容纳配制品的容器可以是一次性小瓶或多次使用的小瓶，其允许重复施用重构的配制品。制品或试剂盒还可以包含含有合适的稀释剂的第二容器。制品或试剂盒还可以包括从商业、和用户角度来看期望的其他材料，包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、注射筒和具有使用说明的药品说明书。
[0236]
本文的制品或试剂盒任选地还包含容器，所述容器包含第二药剂，其中所述抗cd70抗体是第一药物，并且所述制品或试剂盒还包括标签或药品说明书上的关于以有效量的第二药物所述受试者的说明书。在一些实施方案中，所述标签或药品说明书指示所述第一药物和第二药物将依序或同时施用。
[0237]
在一些实施方案中，本文所述的抗cd70抗体作为冻干粉末存在于所述容器中。在一些实施方案中，所述冻干粉末在气密密封的容器(如小瓶、安瓿瓶或小药囊)中，所述容器指示活性剂的量。在通过注射施用所述药物的情况下，注射用无菌水或生理盐水的安瓿瓶可以例如任选地作为所述试剂盒的一部分而提供，使得成分可以在施用之前混合。如果需要的话，此类试剂盒还可以包括一种或多种各种常规药物组分，例如像具有一种或多种药学上可接受的载体的容器、另外的容器等，这对于本领域技术人员来说是清楚的。所述试剂盒中还可以包含作为插页或作为标签的印刷说明书，其指示待施用的组分的量、施用指南和/或混合组分的指导。
[0238]
通过参考以下实施例将更全面地理解本发明。然而，它们不应被解读为限制本发明的范围。应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且根据它们进行的各种修改或改变将为本领域技术人员知晓，并且应包括在本技术的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。实施例实施例1：sea-cd70与fcγ受体结合的评价
[0239]
在体内，单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞和nk细胞可经由fcγri、fcγriia和fcγriiia介导adcp(抗体依赖性细胞介导的吞噬作用)和adcc(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)。虽然所有三种受体均可参与adcp，但fcγriiia被认为是参与adcc的主要fcγ受体。igg1抗体的非岩藻糖基化导致与fcγriiia和b以更高亲和力结合，并且因此可以增加adcc和adcp活性。
[0240]
sea-cd70(非岩藻糖基化hif6)是一种靶向cd70的人源化非岩藻糖基化单克隆抗体，其由seattle genetics开发用于患有目前不存在护理标准的难治性和/或复发性急性髓系白血病(aml)或骨髓增生异常综合征(mds)的患者。sea-cd70是一种结合cd70的人源化单克隆igg1抗体。sea-cd70是非岩藻糖基化抗体，其以比岩藻糖基化亲本抗体sgn-70(hif6)更高的亲和力结合fcγriiia，并通过cdc、adcp和放大的adcc引起对cd70阳性细胞的靶向杀伤增加。
[0241]
使用生物层干涉测量法(bli)评估sgn-70和sea-cd70与fcγr i、iia、iiia、iib和fcrn的结合动力学。图1示出sgn-70(标记为h1f6 wt)和sea-70(标记为h1f6 sea)与fcγri、iia、iiia、iib和fcrn结合的感测图。
[0242]
通过bli评估sgn-70和sea-cd70与人fcγri、fcγriia h131、fcγriia r131、fcγriiia f158和fcγriiia v158的结合动力学。参数列于表1中。将生物素化的avi标记的人fcγr单体fc n297a lala-pg和fc受体新生儿(fcrn)单体fc n297a ihh融合蛋白(在
seattle genetics设计和表达)加载到高精度链霉亲和素生物传感器(fortebio)上，以在缓冲液a(0.1％牛血清白蛋白[bsa]，0.02％tween20，1
×
磷酸盐缓冲盐水[pbs]ph 7.4)中进行100秒传感器检查后达到0.3与1nm之间的响应。在另一次基线测量后，对于fcγri、iia、iiia、fcrn ph 6和fcrn ph 7.4，将滴定的抗体分别在缓冲液b(1％酪蛋白，0.2％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中缔合600、10、100、50和10秒，并解离1000、50、100、500和50秒。在分析之前，在每个测定中减去参考。所有的感测图用缔合开始时的y轴对准和步间解离校正进行处理。使用1:1朗缪尔等温线全局拟合模型来拟合曲线。表1：sgn-70和sea-cd70的bli结合方案的参数cd70的bli结合方案的参数bli＝生物层干涉测量法；bsa＝牛血清白蛋白；fcrn＝fc受体新生儿；pbs＝磷酸盐缓冲盐水；s＝秒。
[0243]
使用表2中列举的参数通过bli测定人cd70亲和力。在用购自fortebio的ahc(抗fc)生物传感器固定6μg/ml抗体57秒之前和之后，在缓冲液a(0.1％bsa，0.02％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中进行基线测量。在缓冲液b(1％酪蛋白，0.2％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中获取第二基线后，使滴定的hcd70分析物在缓冲液b中缔合600秒并解离1000秒。hcd70抗原购自r&d(目录号9328-cl，批号dgsr0217071)，并使用1.5倍摩尔过量的购自thermo fisher scientific的ez连接n-羟基琥珀酰亚胺生物素(目录号20217，批号si249775)进行生物素化。
表2：人cd70的bli结合方案的参数bsa＝牛血清白蛋白；pbs＝磷酸盐缓冲盐水；s＝秒。
[0244]
sea-cd70和sgn-70具有相似的与hfcγri和iia结合和解离的速率。然而，与sgn-70相比，sea-cd70展现出对fcγriiia更高的结合亲和力。进行bli实验以观察sea-cd70和sgn-70与以下项的结合和解离速率以及与以下项的结合亲和力：fcγri、fcγriia(h/h高亲和力和r/r低亲和力等位基因)和fcγriiia(f/f低亲和力和v/v高亲和力等位基因)。还进行了与fcrn的结合动力学，并发现sea-cd70和sgn-70以相似的动力学和亲和力结合。
[0245]
使用生物层干涉测量法(bli)评估sgn-70和sea-cd70与高亲和力fcγriiia(158v)受体变体的结合动力学(表3)。sea-cd70的非岩藻糖基化骨架展现出对fcγriiia(158v)受体的结合亲和力增加8倍。将生物素化的avi标记的人fcγr单体fc n297alala-pg和fcrn单体fc n297a ihh融合蛋白(在seattle genetics设计和表达)加载到高精度链霉亲和素生物传感器(fortebio)上，以在缓冲液a(0.1％bsa，0.02％tween20，1
×
pbs ph 7.4)中进行200至300秒传感器检查后达到0.3与1nm之间的响应。在第二个基线后，滴定的sea-cd70或sgn-70抗体缔合，直到最高浓度达到平衡并解离，直到响应接近基线。在分析之前，在每个测定中减去参考。所有的感测图用缔合开始时的y轴对准和步间解离校正进行处理。使用1:1朗缪尔等温线全局拟合模型来拟合曲线。表3.通过bli得出的sgn-70和sea-cd70 fcγriiia结合的动力学参数kd＝平衡解离常数；k
off
＝解离速率常数；k
on
＝结合速率常数。实施例2：通过流式细胞术得出的sgn-70和sea-cd70与hfcγriiia和cfcγriiia的结合
[0246]
尽管bli方法用于通过监测结合动力学来评估受体亲和力，但其主要设定为监测单价结合。为了增加bli数据集，还进行了流式细胞术(图2a和图2b)。转化cho细胞以过表达高亲和力人fcγriiia受体(158v)(图2a)或食蟹猴fcγriiia受体(图2b)，并进行非岩藻糖基化抗体sea-cd70(标记为sea-70)或亲本岩藻糖基化抗体sgn-70的结合。如在bli实验中观察到的，与sgn-70相比，非岩藻糖基化抗体sea-cd70以更高的亲和力结合人和食蟹猴fcγriiia。
[0247]
如下进行cho-fcγriiia结合测定：
1.解冻细胞：将细胞于2019年6月11日解冻，并在培养基中培养1周以从冻融中恢复。数据vi-cell xr2.04,beckman coulter,inc.2.洗涤：将6千万个细胞在50ml管中在pbs中洗涤1次。将细胞再次计数并以2.2
×
106/ml重悬浮。然后每孔吸移0.1ml3.制作抗体的10
×
稀释液：制备10
×
稀释液(在稀释板中3mg/ml、1mg/ml、0.3mg/ml、0.1mg/ml、0.03mg/ml、0.01mg/ml、0.003mg/ml、0.001mg/ml和0.0003mg/ml)。pbs＝磷酸盐缓冲盐水。4.抽吸：将洗液吸入孔中，并用多通道移液管吸取100μl相应的抗体稀释液。相应浓度为300、100、30、10、3、1、0.03、0.01、0.003、0.001和0.0003μg/ml，一式三份。浓度沿96孔圆底板竖直下降。5.涡旋：在板的每一侧用力敲拍后，使用涡旋机轻轻混合。然后将板在4℃下孵育1小时。6.离心：将细胞离心、抽吸并在200μl 1
×
bd染缓冲液/孔中洗涤。抽吸最后一次洗液后，通过在涡旋器上涡旋板使细胞重悬浮。7.制备抗体：抗人igg-pe(jackson，目录号109-116-170)是通过将1mg/ml浓缩物1:50稀释以产生33μg/ml饱和浓度来制备的。通过敲拍板的侧面将抗体混合物充分混合。将混合物在冰箱(4℃)中在黑暗中孵育30分钟。8.洗涤：将混合物离心。然后吸出上清液。用200μl 2
×
bd染缓冲液洗涤各孔。9.分析样品：在attune上以高通量取样器(hts)模式通过流式细胞术分析样品。将中值荧光强度(mfi)作图(几何平均值)，并在prizm中计算每个的平衡解离常数(kd)。实施例3：sea-cd70和sgn-70在aml cd70+细胞中的adcc
[0248]
尽管sgn-70不直接诱导cd70阳性靶细胞中的细胞凋亡，但sea-cd70确实介导可能导致靶标阳性细胞消除的效应子功能。在使用pbmc作为自然杀伤(nk)细胞来源的标准adcc测定中，sea-cd70以剂量依赖性方式诱导两种cd70阳性aml细胞系的裂解，而使用非结合对照人igg未实现裂解。这些实验证明，sea-cd70具有高于sgn-cd70抗体的抗体依赖性细胞毒性活性。
[0249]
使用两种cd70+aml细胞系作为adcc靶标评价adcc活性(图3a和图3b)。标记aml细胞系molm-13(图3a)和nomo-1(图3b)，并与测试抗体或同种型对照滴定液混合。使用
easysep人nk细胞富集试剂盒(stem cell technologies)从冷冻保存的正常供体pbmc中分离效应细胞。以效应细胞与靶细胞的比率10:1按25,000:250,000添加效应细胞。孵育4小时后，计算特异性细胞裂解百分比。
[0250]
使aml细胞系在适当的生长培养基中生长，同时在37℃下在5％co2中孵育。使用vicell xr细胞计数器计数悬浮细胞。将所需体积的细胞与新鲜生长培养基混合并以0.5m/ml的接种密度铺板。
[0251]
以下方案用于评估adcc活性：1.将两小瓶hupbmc在37℃水浴中解冻并重悬浮于1％fbs-rpmi培养基中。离心细胞，然后按照制造商的方案，使用easysep人nk细胞富集试剂盒分离nk细胞。2.使用sgn-70和sea-cd70抗体制备抗体滴定液，起始浓度为2μg/ml(工作浓度6μg/ml)，并在1％fbs-rpmi培养基中从10x稀释至20pg/ml。3.将靶肿瘤细胞(molm-3或nomo-1)以50μl/孔在1％fbs-rpmi中铺板到96孔圆底板中。然后，将抗体稀释液和同种型对照以50μl/孔接种到同一板中。然后，将分离的nk效应细胞以50μl/孔以1:10比率的肿瘤:nk细胞在1％fbs-rpmi培养基中铺板到同一96孔圆底板中。4.添加对照孔并用培养基使总体积达到150μl。5.将测试板在37℃下在5％co2培养箱中孵育4小时。当孵育剩余45分钟时，将15μl/孔的裂解溶液添加至最大裂解对照孔中，并放回培养箱中进行4小时孵育的剩余时间。6.将测试板在离心机中以250xg离心4分钟，并将来自每个孔的50μl上清液转移到新的平底透明板中。7.以50μl/孔添加cytotox 96试剂，并在室温下在暗处孵育30分钟。然后，向所有孔中添加50μl/孔的终止溶液。8.使用spectramax 190板读取器在490nm下测量每孔的吸光度，并将获得的值转换为文本文件并输出到excel和graphpad prism中用于进一步数据分析。9.将细胞毒性通过减除背景并以裂解溶液处理达到的最大裂解的百分比报告。实施例4：sgn-70和sea-cd70对调节性t细胞的影响
[0252]
为了评价sea-cd70对cd70+t细胞耗竭的作用，用渐增浓度的sgn-70或sea-cd70处理含有幼稚、记忆和treg子集的pbmc 24小时。在实验结束时，将细胞用zombie aqua活力染料染并评估总的存活treg幼稚和记忆cd4和cd8 t细胞数。用低亲和力fcγriiia受体纯合型(f/f 158)(图4c和图4d)或高亲和力fcγriiia受体纯合型(v/v158)(图4a和图4b)的供体进行耗竭评估。使用靶向tigit的岩藻糖基化(wt克隆13igg1)和非岩藻糖基化(sea克隆13igg1)抗体作为阳性对照(图4e-图4h)。靶向cd70的抗体均未诱导低亲和力f/f 158供体中的t调节性细胞耗竭(图4c)。当使用v/v高亲和力供体时，岩藻糖基化抗cd70抗体(标记为sgn-cd70)导致t调节性细胞耗竭，然而，出乎意料地，非岩藻糖基化抗体sea-cd70虽然对cd70+aml细胞系具有增加的adcc活性，但不诱导treg细胞耗竭(图4a)。无论使用v/v高亲和力供体(图4b)还是低亲和力供体(图4d)，岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗cd70抗体均不耗竭cd8+细胞。
[0253]
与对于cd70靶向抗体所观察到的相比之下，当使用v/v高亲和力供体(图4e)或低亲和力供体(图4g)时，非岩藻糖基化抗tigit抗体(标记为sea克隆13igg1)比岩藻糖基化抗
tigit抗体(标记为wt克隆13igg1)更大程度地耗竭treg细胞。
[0254]
sea-cd70与sgn-70相比缺乏treg的耗竭因以下原因是出乎意料的：不仅鉴于比较岩藻糖基化和非岩藻糖基化抗tigit抗体的结果，而且鉴于报道其他非岩藻糖基化抗体的活性的出版物。例如，us 2019/0284287证明非岩藻糖基化抗cd25抗体具有比相应的岩藻糖基化抗cd25抗体更大的adcc活性，导致诱导的treg(itreg)的更多裂解和耗竭。类似地，美国专利号10,196,445证明非岩藻糖基化抗ctla4抗体导致treg的裂解和耗竭，而相应的岩藻糖基化抗ctla4抗体则不会。
[0255]
已经显示treg的耗竭可具有负面的，甚至潜在致命的后果。例如，已经证明使用白喉毒素耗竭treg在两种小鼠模型中导致严重的自身免疫性障碍。参见kim等人(2009)j.immunol.183:7631-7634。此外，treg细胞的急性消除可导致终末期自身免疫病。参见kim等人(2007)nat.immunol.8(2):191-7。实施例5：sea-cd70在髓系恶性肿瘤患者中的i期临床研究
[0256]
这是一项1期、开放标签、多中心、剂量递增和队列扩展研究，旨在评价sea-cd70在患有髓系恶性肿瘤的成人中的安全性、耐受性、药代动力学(pk)和抗肿瘤活性。本文评价了sea-cd70在患有髓系恶性肿瘤如骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓系白血病(aml)的患者中的安全性和功效。该试验评价了发生的副作用以及sea-cd70是否有效mds和aml。
[0257]
该研究具有三个部分，共入组60名受试者。a部分是剂量递增队列，旨在确定如用低甲基化剂失败(hma失败)后复发性/难治性mds受试者中sea-cd70单一疗法的最大耐受剂量(mtd)或推荐的扩展剂量。b部分是扩展队列，旨在评价如在hma失败后sea-cd70单一疗法在复发性/难治性mds受试者中的安全性和耐受性。c部分是扩展队列，旨在评价sea-cd70单一疗法在复发性/难治性aml受试者中的安全性和耐受性。入组试验的受试者为≥18岁，包括男性和女性受试者。在每个周期的第1天和第15天施用sea-cd70。静脉内施用所有组分。入组试验的受试者的纳入标准和排除标准示于表4中。表4.纳入和排除标准的列表
[0258]
结局度量如表5所述。所有组分将被静脉内施用。表5.结局度量
实施例6：在raji nhl伯基特淋巴瘤小鼠模型中h1f6sea对存活期的剂量依赖性作用。
[0259]
研究表明，急性髓系白血病(aml)和骨髓增生异常疾病(mds)表达cd70及其受体cd27。本研究的目的是测试动物响应于抗cd70单克隆抗体sea-cd70(h1f6sea)的存活期。在表达cd70的细胞异种移植小鼠模型即raji nhl伯基特模型中评估响应于施用sea-cd70的动物存活期。
[0260]
在第0天，给scid小鼠的尾静脉静脉内植入1
×
106个raji细胞。植入后一天，将动物随机分成组，每组八只小鼠。在肿瘤植入后第1天，将h1f6sea以0.3、1和3mg/kg每日一次，每四天对动物腹膜内给药，共4个周期(q4dx4)。将原液浓度的抗体稀释至适当浓度并以10μl/g体重注射至动物中。然后监测动物的疾病症状。跟踪动物直到出现疾病症状，然后安乐死。随时间对动物进行分析，并且当动物出现疾病症状时处死动物。在植入后，未组中的动物显示出20天的中位存活期，而用0.3mg/kg h1f6sea的动物进行到36.5天，而用1或3mg/kg的动物进行到68和69.5天。表6示出了研究期间每天每组中的动物总数。计算所有组中动物的存活百分比(图5)。卡普兰-迈耶图显示和未动物之间存活百分比的显著增加，以及0.3mg/kg与1或3mg/kg之间的剂量反应(图5)。对包括0.3mg/kg、1mg/kg和3mg/kg的h1f6sea剂量的所有组的实验天数的存活百分比进行定量。与未的小鼠相比，用h1f6sea小鼠增加了存活期(图5)。表6.h1f6sea在raji nhl伯基特淋巴瘤模型中的抗肿瘤活性的卡普兰-迈耶结果。
实施例7.在mv411急性髓系白血病小鼠模型中h1f6sea对肿瘤生长的剂量依赖性作用。
[0261]
在该研究中，在表达cd70的细胞异种移植小鼠模型(mv-411系，为急性髓系白血病模型)中评估响应于施用抗cd70抗体sea-cd70(h1f6sea)的肿瘤生长。将肿瘤生长报告为体积，并计算为每个组中动物的平均值(图6)以及对每个组中每个个体报告(图7a-图7d，表7)。来自不同组中的个体动物的每日肿瘤体积(mm3)总结于表7中。
[0262]
在第0天，在scid小鼠的侧腹皮下植入5
×
106个mv-411细胞。当达到平均肿瘤尺寸50mm3时(通过使用下式测量：体积(mm3)＝0.5*长度*宽度2，其中长度是较长尺寸)，将小鼠随机分到组中，每组六只小鼠。按照组来动物；接受抗体的组每4天，四个周期，接受阿扎胞苷的动物每4天，四个周期。腹膜内给予。将原液浓度的抗体和化疗稀释至适当浓度并以10μl/g体重注射至动物中。在整个研究中，每周两次测量肿瘤长度和宽度以及动物体重，并使用上述公式计算肿瘤体积。追踪动物，直至测得的肿瘤体积为约1000mm3，此时对动物实施安乐死。基于肿瘤植入后九天接受的，对动物按不同时间表给药；接受抗体的动物以q4dx4，而对阿扎胞苷的动物每四天每天一次给药，共四个周期(q4dx4)。肿瘤体积随时间变化的分析表明，与未组的动物或用非结合抗体的那些相比，有适度的肿瘤延迟(图6和图7a-图7d)。当观察每组中肿瘤达到10倍变化所需要的时间时，未组平均需要26.8天，而h1f6sea 10mg/kg组平均需要32.65天，肿瘤生长延迟18％(图6和图7a-图7d)。然而，这可能更长，因为一只动物从未达到10倍的变化。用阿扎胞苷(在图6、图7d和表7中标记为vidaza)的动物也显示出生长延
迟，需要33.68天达到10倍变化，肿瘤生长延迟20.5％(图6和图7a-图7d)。还应注意，h1f6sea 10mg/kg组中的一只小鼠显示出非常稳固的肿瘤生长延迟，其延长了研究的时间(图7a和表7)。表7.h1f6sea、h1f6g1v1、h00sea和vidaza在mv-411急性髓系白血病模型中的抗肿瘤功效。实施例8.sea-cd70和sgn-cd70介导的对aml细胞系的adcp活性的评价。
[0263]
使用加载亲脂性荧光染料并与单核细胞衍生的巨噬细胞混合过夜的cd70+靶细胞(nomo-1和molm-13)测定sea-cd70和sgn-cd70(也称为sgn-70)介导的adcp。通过流式细胞术测定荧光标记的靶细胞的吞噬作用。测量吞噬作用的双标记重合事件(荧光靶细胞)的出现和抗cd11c阳性以鉴定单核细胞/巨噬细胞。巨噬细胞以抗体剂量依赖性方式易于吞噬包被有sea-cd70或sgn-cd70的靶细胞(图8a和图8b)。sea-cd70和sgn-cd70介导的吞噬作用达到相似的水平。
[0264]
以下方案用于评估对aml细胞系的adcc活性：1.使用pkh26红荧光细胞接头微型试剂盒(sigma aldrich)并遵循制造商的说明书标记靶细胞。2.将细胞(4000个细胞/孔)与指定的测试品一起孵育30分钟，洗涤并重悬浮于加有10％超低igg fbs的rpmi中。3.将通过将pbmc衍生的单核细胞与500u/ml(50ng/ml)gm-csf一起孵育10-12天产生的pbmc衍生的巨噬细胞(100,000个细胞/孔)添加到靶细胞中，并在37℃下孵育2小时。4.将板离心并将细胞重悬浮于100μl apc-cd11抗体(巨噬细胞标记物)中并在冰
上孵育30分钟。5.将细胞洗涤，重悬浮于pbs中，并通过流式细胞术分析以确定吞噬作用的百分比。实施例9.sea-cd70和sgn-cd70介导的对aml细胞系的cdc活性的评价。
[0265]
通过补体结合进一步测试sea-cd70和sgn-cd70诱导细胞裂解的能力。将cd70阳性的aml细胞系经荧光标记并用渐增浓度的针对cd70的抗体处理。然后将细胞暴露于人补体并裂解(测定为荧光染料的释放)。当在未热灭活的正常人血清的存在下用sea-cd70或sgn-cd70包被时，cd70+aml细胞系molm-13和nomo-1以抗体特异性、剂量依赖性方式裂解(图9a和图9b)。
[0266]
以下方案用于评估对aml细胞系的cdc活性：1.将细胞与10mg/ml抗crp单克隆抗体混合物(抗hcd46、抗hcd55、抗hcd59)在冰上孵育30分钟。2.将细胞洗涤并铺板(200,000个细胞/孔)在含有未热灭活血清、sytox green(life technology)和以指定最终浓度添加的抗体的培养基中，在37℃下放置2小时。3.通过在envison板读取器(perkin elmer)上检测sitox绿荧光信号来定量细胞死亡，并相对于阳性对照(1％triton x-100处理的细胞)归一化。实施例10.在mv411 aml异种移植小鼠模型中sea-cd70和阿扎胞苷的组合对肿瘤生长的作用
[0267]
在该研究中，在表达cd70的细胞异种移植小鼠模型mv4-11系中评估响应于单独或与阿扎胞苷组合施用无岩藻糖基化抗cd70抗体sea-cd70(h1f6sea)的肿瘤生长。将肿瘤生长报告为体积并计算为每个组中动物的平均值(图10)。在第0天，在scid小鼠的侧腹皮下植入5x10e6个mv4-11细胞。当达到平均肿瘤尺寸50mm3时(通过使用下式测量：体积(mm3)＝0.5*长度*宽度2，其中长度是较长尺寸)，将小鼠随机分到组中，每组9只小鼠。腹膜内给予。将原液浓度的抗体和化疗稀释至适当浓度并以10μl/g体重注射至动物中。在整个研究中，每周两次测量肿瘤长度和宽度以及动物体重，并使用上述公式计算肿瘤体积。追踪动物，直至测得的肿瘤体积为约1000mm3，此时对动物实施安乐死。基于接受的，动物按不同时间表给药；接受抗体的动物用10mg/kg的剂量(q4dx5)，对阿扎胞苷的动物每天给药一次，持续连续五天(阿扎胞苷2mg/kg；q1dx5)，共3个周期(3周)，接受组合的动物以与单一相同的剂量和时间表接受每种。肿瘤体积随时间变化的分析表明，当与对照未动物相比时，阿扎胞苷和sea-cd70二者均减少肿瘤生长。此外，当动物用sea-cd70和阿扎胞苷的组合时，与未的动物和单一的sea-cd70或阿扎胞苷相比，观察到肿瘤延迟的进一步增加(图10)。如所预期的，用sea-cd70 g1v1抗体在减少肿瘤生长方面无效，所述抗体在fc结构域中携带减少与fcγ受体结合的突变(e233p、l234v、l235a)(参见mcearchern等人,2008,clin.cancer res.14(23):7763-72；armour等人,1999,eur.j.immunol.29:2613-2624)。出乎意料地，当sea-cd70 g1v1与阿扎胞苷组合时，观察到肿瘤生长的显著延迟(图10)。不希望受任何理论束缚，这种观察结果潜藏的机制可能与由阿扎胞苷引起的cd70或cd27表达的变化或与cd27/cd70信号传导的抑制有关。当观察每组中肿瘤达到10倍变化所需要的时间时，未动物平均需要17.82天，而sea-cd70组平均需要25.08天，肿瘤生长延迟31％(图10)。用阿扎胞苷的动
物也显示出生长延迟，需要26.59天达到10倍变化，与未的对照相比肿瘤生长延迟33％(图10)。用阿扎胞苷和sea-cd70的组合的动物平均需要33.81天达到10倍增加(肿瘤生长延迟47.3％)(图10)，表明与作为单一药剂使用的两种药剂相比，sea-cd70和阿扎胞苷的组合有效地延迟肿瘤生长。实施例11.在mv4-11 aml异种移植小鼠模型中sea-cd70与阿扎胞苷、维奈妥拉(abt-199)或两者(阿扎胞苷+维奈妥拉)的组合对肿瘤生长的作用。
[0268]
在该研究中，在表达cd70的细胞异种移植小鼠模型mv4-11系中评估响应于单独或与阿扎胞苷维奈妥拉(abt-199)、或sea-cd70+阿扎胞苷+维奈妥拉(三重组合)组合施用无岩藻糖基化抗cd70抗体sea-cd70(h1f6sea)的肿瘤生长。将肿瘤生长报告为体积并计算为每个组中动物的平均值(图11a)。在第0天，在免疫受损scid小鼠的侧腹皮下植入5x10e6个mv4-11细胞。当达到平均肿瘤尺寸50mm3时(通过使用下式测量：体积(mm3)＝0.5*长度*宽度2，其中长度是较长尺寸)，将小鼠随机分到组中，每组10只小鼠。将原液浓度的抗体和化疗稀释至适当浓度并以10μl/g体重注射至动物中。在整个研究中，每周两次测量肿瘤长度和宽度以及动物体重，并使用上述公式计算肿瘤体积。追踪动物，直至测得的肿瘤体积为约1000mm3，此时对动物实施安乐死。基于接受的，动物按不同时间表给药；接受抗体的动物用10mg/kg抗体(q4dx5)，对阿扎胞苷的动物每天给药(2mg/kg)，每周持续连续五天(q1dx5)，共3个周期(3周)；维奈妥拉以25mg/kg每天口服灌饲给药，持续连续21天(q1dx21)。接受组合的动物以与单一相同的剂量和时间表接受每种。
[0269]
如图11a所示，当作为单一药剂给药时，sea-cd70、阿扎胞苷和维奈妥拉延迟肿瘤生长。值得注意的是，与相对单组相比，向阿扎胞苷或维奈妥拉中添加sea-cd70显著降低肿瘤生长(在第39天的两个比较中p《0.05，双因素方差分析)。在与单一药剂相比时，维奈妥拉+阿扎胞苷的组合还进一步抑制肿瘤生长(在第39天分别与阿扎胞苷或维奈妥拉单组相比，p《0.01和p《0.001，双因素方差分析)。
[0270]
与两种药剂组合相比，将sea-cd70添加至维奈妥拉和阿扎胞苷(三重组合)进一步延迟肿瘤生长(第39天p＝0.0594，双因素方差分析)。第46天，阿扎胞苷+维奈妥拉组合组的平均肿瘤大小为349.9
±
141.7mm3(平均值
±
sem)，而三重组合的平均肿瘤大小为85
±
11.09mm3(平均值
±
sem)(p《0.05；单尾t检验)。如图11b所示，当观察单一动物肿瘤生长曲线时，用维奈妥拉+阿扎胞苷的组合的五只动物在第56天达到肿瘤体积增加10倍，而用重组合的仅一只动物在实验中断时达到10倍阈值。
[0271]
总之，这些结果表明，当添加至标准护理剂(阿扎胞苷、维奈妥拉、或阿扎胞苷+维奈妥拉的组合)中时，sea-cd70进一步延迟肿瘤生长。

技术特征：

1.一种受试者的表达cd70的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的非岩藻糖基化抗cd70抗体，其中所述方法导致所述受试者中癌细胞的耗竭，其中所述方法不导致所述受试者中cd70+t调节性细胞(cd70+treg)的耗竭，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，并且其中所述癌症选自骨髓增生异常综合征(mds)和急性髓系白血病(aml)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗cd70抗体包含含有与seq id no:1的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的重链可变区和含有与seq id no:2的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的轻链可变区。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的氨基酸序列的重链可变区和含有seq id no:2的氨基酸序列的轻链可变区。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述fc结构域是介导抗体依赖性细胞毒性(adcc)、抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)和补体依赖性细胞毒性(cdc)中的一种或多种的抗体效应子结构域。5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述fc结构域是介导adcc的抗体效应子结构域。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述fc结构域是人fc结构域。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述抗cd70抗体是沃瑟妥珠单抗。8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述抗体与剂缀合。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂是化疗剂或免疫调节剂。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂是化疗剂。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述化疗剂是一甲基澳瑞他汀e(mmae)或一甲基澳瑞他汀f(mmaf)。12.根据权利要求8所述的方法，其中所述剂是免疫调节剂。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用抗cd70抗体体，其中所述抗cd70抗体体中的每种抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，其中所述抗cd70抗体体中至少50％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗cd70抗体体中至少70％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。15.根据权利要求13所述的方法，其中所述抗cd70抗体体中至少90％的抗cd70抗体缺乏核心岩藻糖基化。16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述癌症是mds。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述mds是复发性或难治性mds。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者在先前的针对所述mds的低甲基化剂(hma)疗法后经历了失败。19.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述癌症是aml。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述aml是复发性或难治性aml。21.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者接受了2种先前方案以所述
aml。22.根据权利要求20所述的方法，其中所述受试者接受了3种先前方案以所述aml。23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中至少约0.1％、至少约1％、至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％的所述癌细胞表达cd70。24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中与向所述受试者施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体之前癌细胞的量相比，向所述受试者施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体导致癌细胞耗竭至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或约100％。25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中与向所述受试者施用所述无岩藻糖基化抗cd70抗体之前cd70+treg的量相比，向所述受试者施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体导致cd70+treg耗竭不超过约20％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或约0.1％。26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体之后，所述受试者中的一种或多种效果相对于基线得到改善。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种效果选自：客观反应率、反应持续时间、达到反应的时间、无进展存活期和总存活期。28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述客观反应率是至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％或至少约80％。29.根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中在施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的无进展存活期。30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中在施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体后，所述受试者展现出至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年的总存活期。31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中在施用所述非岩藻糖基化抗cd70抗体后，对所述抗cd70抗体的反应的持续时间是至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约十八个月、至少约两年、至少约三年、至少约四年或至少约五年。32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述抗cd70抗体的施用途径是静脉
内。33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述受试者是人。34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中将所述抗cd70抗体与阿扎胞苷组合施用。35.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中将所述抗cd70抗体与维奈妥拉组合施用。36.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中将所述抗cd70抗体与阿扎胞苷和维奈妥拉组合施用。37.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中将所述抗cd70抗体与氟喹诺酮组合施用。38.一种用于表达cd70的癌症的药物组合物，所述组合物包含非岩藻糖基化抗cd70抗体和至少一种药学上相容的成分，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义，其中所述组合物用于根据权利要求1-37中任一项所述的方法中。39.一种试剂盒，所述试剂盒包含非岩藻糖基化抗cd70抗体和在根据权利要求1-37中任一项所述的方法中使用所述抗cd70抗体的说明书，其中所述抗cd70抗体包含含有seq id no:1的三个cdr的重链可变区、含有seq id no:2的三个cdr的轻链可变区和fc结构域，其中所述抗cd70抗体的cdr由kabat编号方案定义。

技术总结

本公开文本提供了使用非岩藻糖基化抗CD70抗体诸如包括骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)在内的髓系恶性肿瘤等癌症的方法。肿瘤等癌症的方法。肿瘤等癌症的方法。

技术研发人员：

S

受保护的技术使用者：

思进股份有限公司

技术研发日：

2020.12.28

技术公布日：

2023/1/13