一种利用AF4对EVs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法及装置
一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法及装置
技术领域
1.本发明属于evs及其异质性亚分离及富集技术领域，具体涉及一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法及装置。
背景技术：
2.细胞外囊泡(extracellular vesicles，evs)是指从细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，广泛存在于体液当中，evs携带着丰富的生物学信息，并参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
3.研究表明，evs具有异质性，即在一个evs体内部，各异质性亚在生物发生、物理特征(如大小、密度、形态、颗粒数)和内容物(如蛋白质、脂质、核酸)各不相同。evs负载的内容物既是细胞对不同生理和病理条件的反应，又会对其受体细胞产生多种生物学效应。因此，明确界定evs异质性亚的生物物理特性、功能、成因和调控机制，不仅有助于了解其在生理病理过程中的确切作用，还将有助于识别病理状态下的潜在诊断/预后生物标志物。为加速evs应用于临床诊断和提供理论依据。
4.国际细胞外囊泡协会(international society for extracellular vesicles，isev)于2018年发布最新指南：《misev2018》，建议用以下操作性术语来对evs进行定义：
①
物理特性：尺寸“small evs”(sevs：《100nm or《200nm)和“medium/large evs”(m/levs：》200nm)、密度；
②
生化成分(cd63
+
/cd81
+-evs、annexin a5-stained evs)；
③
利用evs的产生条件或细胞来源来描述(如：肿瘤细胞exos，低氧产生的exos)。
5.目前有研究通过rna测序和定量蛋白质组学分析了连续过滤分离的小鼠胶质母细胞瘤细胞的sevs、mevs、levs异质性亚的细胞外rna(exrnas)和细胞外蛋白(exptns)，发现mevs亚的mrna最紧密地反映了细胞的转录组，而sevs亚的exrnas富集在小的非编码rna中，cd9主要是sevs亚标记物，而levs亚上始终有cd81，nono蛋白主要存在于levs亚中。
6.evs异质性亚的分离是深入开展evs研究的基础。目前的分离方法主要是离心法，如常用的差速超速离心法(differential ultracentrifugation，duc)，即通过对样品施加不同的离心力达到分离的目的，可通过低速(2000g)、中速(10000g)、高速(100000g)离心实现对evs异质性亚的分离。但duc法存在以下缺点：
①
即使在离心力较低的情况下也会导致evs发生团聚，不能实现对同一粒径范围evs亚的绝对分离；
②
duc分离会对evs施加破坏力导致其活性降低，不利于后续对其进行深入的生物学活性研究；
③
分离时间长，成本较高，只能通过不同转速的多次离心得到不同evs亚；
④
分离过程中无法对evs异质性亚进行分析和定量。
⑤
难以将蛋白质和细胞碎片与evs分离开来；
7.在实际研究中，生物基质中的蛋白杂质或细胞碎片会严重影响evs研究的可靠性，蛋白杂质或细胞碎片会导致难以对evs样品进行准确的蛋白浓度定量，进而显著影响下游分析结果，使数据难以比较、重现以及对各分组间的结果进行分析，且无法排除蛋白质杂质
和细胞碎片的作用，最终影响evs生物活性研究的真实性。而目前的研究多是将evs进行提取后，直接进行研究，缺少合适的纯化方法，深入研究evs的生物活性需要开发一种有效的纯化方案，迫切解决这一问题成为evs界的一个普遍的共识。因此，开发一种成本低、条件温和、保留evs样品生物特性的分离、纯化富集方法成为evs异质性亚研究领域亟待解决的问题。
8.非对称场流分离技术(af4)是基于样品的分子扩散和与样品分子扩散反方向的交叉流的作用的分离方法，af4没有固定相和填料，在流体环境中完成分离过程，因此具有低剪切力、分离条件温和、适合生物大分子分离表征的特点，在分离过程中，小粒径样品由于扩散系数小，更接近池道抛物线层流的中心位置，会先洗脱出来，大粒径样品会更远离抛物线层流中心位置，被后洗脱出来，实现样品的分离。此外，af4可与多角度激光检测器(mals)耦合，同时提供样品的粒径分布、颗粒数量等信息。可通过优化af4分离条件，将蛋白质杂质与evs样品进行分离，蛋白质杂质由于粒径小，在分离过程中被先洗脱出来，囊泡被后洗脱出来，可同时实现对evs样品的纯化和evs异质性亚样品的分离。
9.在采用af4及其它谱技术(如尺寸排阻谱法)对evs异质性亚进行分离时，流动相会稀释evs导致样本浓度降低，以往的研究多采用超滤法对evs异质性亚样品进行富集，超滤法同离心法一样会施加离心力，同样会遇到离心导致的evs样品发生团聚及生物受损等问题，需要一种温和、低损伤的evs异质性亚样品富集方法。可以利用af4技术优势解决这一问题。
10.但由于获得的evs异质性亚样品通常浓度低、体积大，因此需要大体积进样，而af4进样环最大进样体积为100μl，无法直接达到富集目的。且目前尚无商品化大体积进样环，定制大体积进样环成本很高并且耗时，很难实现。并且由于af4流动相单向过滤器(＜100nm)的限制，大于100nm的样品无法通过加在流动相中泵入到池道中。因此可通过改装af4管路，实现大体积样本进样，且目前尚无低成本、低损伤evs生物活性的富集方法，因此基于af4温和、低损伤的技术特性，可通过在原有af4仪器基础上，进行管路改造，开发低成本、低损伤富集evs异质性亚的方法不仅有助于对evs异质性亚样品进行高效富集，还可根据需要富集后连接检测器，进行在线富集与检测，对evs功能研究具有重要意义。且还可进一步应用于环境中微量的纳米尺寸颗粒物的富集研究，为环境中微量的纳米尺寸颗粒物的研究提供新方法。
技术实现要素：
11.本发明的目的是提供一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化富集的方法，该方法实现了对实验中实际提取的尺寸分布在30-400nm的广泛粒径分布的血小板来源细胞外囊泡(pevs)亚混合体进行分离表征，且可以实现对evs异质性亚的高效富集，解决了目前evs研究中由于存在蛋白质杂质可能造成的结果偏差以及异质性亚富集过程中所造成的生物特性改变等问题。
12.本发明的另一个目的是提供一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法的装置。
13.为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
14.一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，包
括以下步骤：
15.1)分离、纯化：利用af4对广泛粒径分布的evs样品按照粒径大小进行分离，蛋白质杂质与evs进行分离，同时evs按照粒径由小至大被洗脱出来，实现分离纯化evs；
16.2)富集：将分离后得到的不同的evs异质性亚样品通过进行af4富集，在原有的af4的进样器和af4系统eclipse dualtec仪器间连接大体积进样管路以替代原有管路，并重新设定进样程序通过聚集模式和聚集进样模式来回切换实现不同体积evs样品的富集。
17.进一步地，步骤1)中所述的分离、纯化，梯度洗脱为交叉流流速5min内由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min。
18.进一步地，步骤1)中所述的分离、纯化，进样量为100μl；检测器流速为1ml/min；膜的类型为10kda rc膜，流动相为10mm pbs溶液。
19.进一步地，步骤1)中所述的分离、纯化，根据保留时间不同，将蛋白质杂质与evs样品进行分离，达到evs样品纯化目的。
20.进一步地，步骤2)中所述的富集，在af4的进样器和af4系统eclipse dualtec仪器之间连接大体积进样管路以替代原有管路。所述大体积进样管路的规格为10ml，也可以选用其他规格大体积进样管路。
21.进一步地，步骤2)中所述的富集，富集时，更改进样程序设定，先进行聚集模式，之后进行聚集进样模式，然后根据需要富集的样本量在聚集模式和聚集进样模式两种模式间来回切换。
22.进一步地，步骤2)所述富集时，交叉流流速为恒定的2ml/min，膜的类型为10kda rc膜，流动相为10mm pbs溶液。洗脱模式为聚集模式和聚集进样模式。
23.进一步地，在所述聚集模式下，流动相带不经过进样器，从流动相瓶经液相泵进入af4系统eclipse dualtec仪器，后经池道进口端和出口端也泵入池道，在池道进样口附近形成对流。
24.进一步地，在所述聚集进样模式下，流动相经过进样器，将大体积管路中样品经池道进样口带入池道，此时在池道内部，溶剂和任何小于半透膜孔径的物质可穿过半透膜进入废液管，大于半透膜孔径的囊泡可被保留在池道内部。
25.利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法的装置，包括af4分离纯化模块、af4富集模块，af4富集模块是在进样器和af4系统eclipse dualtec仪器间连接大体积进样管路以替代原有管路。
26.本发明的有益效果：
27.本发明利用af4，实现对实验中实际提取的30-400nm的广泛粒径分布的evs亚混合体进行分离、纯化、表征。通过af4分离，可同时实现对evs样品中蛋白质杂质的去除及evs异质性亚样品的分离，解决了目前evs研究中由于存在蛋白质杂质导致evs功能研究的准确性受质疑的问题。
28.且通过改造af4管路与重新设定进样程序，可以实现对evs异质性亚样品的高效富集，解决了evs异质性亚分离富集过程中损伤其生物特性的问题。本方法具有成本低、灵活性高、易操作等特点。对比常用的超滤法富集细胞外囊泡，超滤法富集倍数为80到100倍；此方法富集倍数可高达160倍甚至更高，在富集效果上有更高优势。采用af4法富集，在电镜下观察到的evs数量更多且形态更加良好，更利于后续针对evs异质性亚的深入研
究。
附图说明
29.图1为实施例1中血小板来源细胞外囊泡(pevs)的af4分离、纯化结果图；
30.图2为实施例1中pevs的af4分离富集原理图谱示意图；
31.图3为实施例1中改造af4管路富集evs原理示意图；
32.图4为实施例1中af4浓缩与超滤法浓缩后spevs、mpevs、lpevs亚的tem成像分析示意图。
具体实施方式
33.下面将结合本发明实施例以及附图对本发明作进一步说明。
34.实施例1
35.本实施例的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法包括以下步骤：
36.1)evs异质性亚的分离、纯化：
37.采用以下方法制备pevs样品：取10ml大鼠全血于枸橼酸钠抗凝管中，随后使用低速离心机，在22℃，800rpm/min条件下，离心10min，取上清液(血浆)于15ml离心管中，在22℃，3000rpm/min条件下，离心10min，弃去1/2上清，将剩余上清与沉淀重悬，得到富血小板血浆。随后将生物素化tim4-fc蛋白与链霉亲和素磁珠偶联，从富血小板血浆中提取pevs，用0.8μm的水相过滤膜过滤，置于液相进样瓶中(因样品体积小，进样瓶中需辅助内插管)。
38.利用af4对pevs进行分离、纯化、表征。分离、纯化条件为：梯度洗脱为交叉流流速5min内由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min；进样量为100μl；检测器流速为1ml/min；膜的类型为10kda rc膜，流动相为10mm pbs溶液，分离程序如表1所示。所得结果如图1所示。利用af4-mals对pevs样品进行分离、纯化、表征，pevs的粒径分布范围为30nm-400nm，蛋白质杂质出峰时间为8-11min，pevs样品出峰时间为11-40minn，建立的pevs分析方法具有较好的重现性。
39.表1：af4分离pevs程序
[0040][0041]
本发明根据《misev2018》将pevs按尺寸分为small(＜100nm)、medium(100-200nm)、large(＞200nm)三个亚，即spevs、mpevs、lpevs三个亚。异质性亚的af4分离、表征结果如表2所示，由表2可见af4-mals检测pevs异质性亚的s亚平均旋转半径为38.17nm；m亚平均旋转半径为63.6nm；l亚平均旋转半径为123.1nm，具有良好的重现性。同时可对pevs异质性亚的颗粒浓度进行测定。
[0042]
表2 af4-mals分离、检测pevs异质性亚粒径及颗粒数结果
[0043][0044]
af4-mals分离检测evs异质性亚，一次进样，分离、纯化、检测同时进行，且可收集分离馏分进行异质性亚的深入研究。如表3所示。af4分离表征全程耗时1h，相对于离心法分离需要6-7h，af4具有耗时短的优点；且分离所用流动相为pbs，成本低；同时可以提供异质性亚的粒径分布和平均半径信息，并且可以最大程度减少evs样品的聚集，最大程度保留样品的生物特性，更利于后续的异质性亚的深入研究。
[0045]
表3离心法与af4分离evs方法的对比
[0046][0047]
2)pevs异质性亚的富集
[0048]
如图3为af4富集evs原理图，在进样器和af4系统eclipse dualtec仪器间连接10ml大体积进样管路，替代原有管路。通过聚集模式(focus mode)和聚集进样模式(focus inject mode)实现evs的富集，通过两种模式的切换，可根据自身实际evs样品体积，实现不同体积evs样品的富集，灵活易操作。
[0049]
具体操作如下：
[0050]
首先更改af4程序设定，先设定af4在focus模式下持续1min，cross flow为恒定的2ml/min。在此focus模式下，流动相从流动相瓶经液相泵进入af4系统eclipse dualtec仪器，后通过af4系统eclipse dualtec仪器进入池道的in let口和out let口，在池道进样口附近形成对流，此时流动相带不经过进样器。
[0051]
将步骤1)中分离收集好的pevs异质性亚样品中的spevs亚样品，涡旋混匀，在10ml注射器一端连接peek普鲁尔接头，准备10ml etef管，两端连接peek整体式高压接头，将10ml etef管一端连接在10ml注射器的普鲁尔接头上，一端放入收集的spevs亚样品管中，利用注射器吸力将spevs亚样品吸入10ml etef管，此过程可最大程度减少etef管中含有气泡，以防气泡泵入af4池道导致spevs亚样品回收率降低。
[0052]
后将af4系统eclipse dualtec仪器out let口与进样器出口位置管路卸下，将承装spevs亚样品的etef管连接在af4系统eclipse dualtec仪器out let口与进样器出口位置，同时在液相进样瓶中加满流动相pbs，放置在进样器中设定位置。随后通过计算af4管路实际流速和样品途径管路的时间，计算出etef管路中全部体积spevs亚样品进入池道并且达到平衡所需时间。当以2.0ml/min为聚焦流流速时，进样口端实际进样速度约为0.4ml/min，样品聚焦松弛平衡时间需3-5min。因此，10ml样品在线富集时长为25min，为确保样品在池道中充分平衡，增加5min样品平衡时间。设置af4为聚集模式下持续1min，交叉
流为恒定的2ml/min；聚集进样模式下持续30min，交叉流为恒定的2ml/min。
[0053]
在聚集进样模式下，流动相从流动相瓶经液相泵进入af4系统eclipse dualtec仪器，后经过进样器，可以将etef管路中样品经池道in let口带入池道，同时，流动相经out let口进入池道，在池道进样口处达到平衡。此时在池道内部，spevs亚样品在纵向受到向下的横流的作用和样品自身向上的扩散力的作用，两种力的作用方向相反，样品在这两种相反的力的作用下逐渐达到平衡，此平衡位置会与池道膜存在一定距离，可以最大程度降低样品的吸附。溶剂和任何小于半透膜孔径的物质可穿过半透膜进入废液管，大于半透膜孔径的囊泡可被保留在池道内部，可将大体积spevs亚样品富集在进样口附近，pbs作为流动相可最大程度保护样品生物特性。收集重复进样5次的pevs异质性亚馏分，共计得到spevs样品30ml，收集得到mpevs样品45ml，lpevs样品60ml。当需要富集的样品体积超过etef管路体积时，可换更大体积的管路(20ml/30ml)或在af4程序设置时重复增加focus、focus inject程序，在focus模式下更换etef管路，重新装载样品，实现不同体积的样品富集。因af4腔体体积在微升级别，当泵入大体积样品溶液(几毫升甚至几百毫升)时，保留在分离腔室中的颗粒物的溶液体积可以实现从大体积至af4池道容量体积(约380μl)的转变，进而达到富集的目的。通过两种模式的切换，实现不同体积evs样品的富集，实现不同体积evs样品的富集，也可根据自身实际evs样品或其他环境中微量颗粒物样品体积选择更换etef管路，实现不同体积的evs样品的富集，成本低、灵活易操作。
[0054]
样品富集完成后，停止液相泵运行。在5ml注射器口处连接peek普鲁尔接头、在含15cm hplc 1/16管路连接线的peek翻边管接头另一端连接peek整体式高压接头，与连接在注射器的peek普鲁尔接头连接，接下来将peek翻边管接头连接在池道out let口处；将另一段含15cm hplc 1/16管路连接线的peek翻边管接头连接在池道in let口处，管路另一端接入1.5ml ep管。为最大程度减少对样品的稀释，用注射器泵入1ml空气，此时注射器内空气压力将富集完成的spevs样品推出，收集样品约380μl于ep管中，-80℃储存。
[0055]
经af4法浓缩后，各亚样品体积可减小至腔室体积。
[0056]
evs异质性亚富集程序如表4所示。
[0057]
表4 evs异质性亚富集程序
[0058][0059]
管路改造后af4法浓缩spevs、mpevs、lpevs异质性亚样品的富集倍数如表5所示。
[0060]
表5管路改造后af4法浓缩5次分离收集的spevs、mpevs、lpevs异质性亚样品的富集倍数
[0061][0062]
为验证af4浓缩的准确性与可行性，实验同时对比了常用的用来浓缩evs异质性亚的超滤法，采用乙酸双氧铀染料对超滤法及af4法浓缩的spevs、mpevs、lpevs亚样品进行负染，利用tem进行透射电镜成像分析，结果如图4所示，可见在电镜下，超滤法浓缩后evs异质性亚数量少于af4法，且观察到的evs亚均存在膜结构破损的情况，可能是由于超滤法对样品施加较大离心力导致样品沉淀或吸附在超滤柱上。而af4是通过在流体环境中进行富集，且未施加高转速外力，样品颗粒自身的扩散力会使样品与膜存在距离，最大程度降低样品的吸附，富集后evs样品形态良好，膜结构完整，保留样品的生物特性，更利于后续对evs异质性亚进行深入研究。证明af4可以对evs的富集效果优于超滤法。
[0063]
本实施例的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法的装置，包括af4分离模块、af4富集模块，af4富集模块是在进样器和af4系统eclipse dualtec间连接10ml大体积进样管路，替代原有管路。具体使用时，针对需要富集的evs及其异质性亚的量不同，可以选用其他多种体积规格的大体积进样管路。
技术特征：
1.一种利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)分离、纯化：利用af4实现蛋白质杂质与evs分离，同时对广泛粒径分布的evs样品按照粒径大小进行分离，实现evs及其异质性亚的分离与纯化；2)富集：将分离后得到的不同粒径的evs异质性亚样品通过af4进行富集，在原有的af4的进样器和af4系统eclipse dualtec仪器之间连接大体积进样管路以替代原有管路，通过将原有聚集、进样、洗脱模式改为聚集模式和聚集进样模式来回切换实现不同体积evs样品的富集。2.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述的分离、纯化，梯度洗脱为交叉流流速5min内由2ml/min下降至0.25ml/min；后30min由0.25ml/min下降至0.09ml/min。3.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述的分离、纯化，进样量为100μl；检测器流速为1ml/min；膜的类型为10kda rc膜，流动相为10mm pbs溶液。4.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，步骤1)中所述的纯化，根据保留时间不同，将蛋白质杂质与evs样品进行分离，达到evs样品纯化目的。5.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，步骤2)所述富集时，更改进样程序设定，先进行聚集模式，之后进行聚集进样模式，然后根据需要富集的样本量在聚集模式和聚集进样模式两种模式间来回切换。6.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，步骤2)中所述的富集，交叉流流速为恒定的2ml/min，膜的类型为10kda rc膜，流动相为10mm pbs溶液；洗脱模式为聚集模式和聚集进样模式。7.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，在所述聚集模式下，通过设定进样程序，流动相不经过进样器，从流动相瓶经液相泵进入af4系统eclipse dualtec仪器，后经池道进口端和出口端也泵入池道，在池道进样口附近形成对流。8.根据权利要求1所述的利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，其特征在于，在所述聚集进样模式下，流动相经过进样器，可以将大体积管路中样品经池道进样口带入池道，此时在池道内部，溶剂和任何小于半透膜孔径的物质可穿过半透膜进入废液管，大于半透膜孔径的囊泡可被保留在池道内部。9.利用af4对evs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法的装置，其特征在于，包括af4分离模块、af4富集模块，af4富集模块是在进样器和af4系统eclipse dualtec仪器间连接大体积进样管路以替代原有管路。
技术总结
本发明涉及一种利用AF4对EVs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法及装置。该利用AF4对EVs及其异质性亚进行温和、低损伤分离、纯化、富集的方法，包括以下步骤：利用AF4对广泛粒径分布的EVs样品按照粒径大小进行分离、纯化；将分离、纯化后得到的EVs异质性亚样品通过改变AF4管路进行富集，在原有的AF4的进样器和AF4系统Eclipse DUALTEC仪器间连接大体积进样管路以替代原有管路，重新设定进样程序，通过聚集模式和聚集进样模式来回切换实现不同体积EVs样品的富集。实现对广泛粒径分布的EVs亚混合体进行分离、纯化，且可以实现对EVs异质性亚的高效富集，解决了EVs样品中由于存在过多蛋白质杂质而导致其研究结果的偏差及其异质性亚在富集过程中所造成的生物特性改变等关键问题。中所造成的生物特性改变等关键问题。中所造成的生物特性改变等关键问题。
