一种与玉米穗上叶片数紧密连锁的InDel引物组及其应用
一种与玉米穗上叶片数紧密连锁的indel引物组及其应用
技术领域
1.本发明属于分子标记辅助玉米育种技术领域，具体涉及到一种与玉米穗上叶片数紧密连锁的indel引物组及其应用。
背景技术：
2.叶片是玉米主要的光合器官，叶片数目、形态及空间分布对玉米株型及产量具有重要影响。根据叶片与最上部雌穗着生位置的相对关系，可将玉米叶片分为穗上叶片和穗下叶片。穗上叶片的光合产物是籽粒灌浆所需物质的主要来源，当去除穗上叶片后籽粒干物质积累减少84％-94％。普通玉米的穗上叶片只有5-6张，而多叶型玉米穗上叶可达7-25张，但二者的穂下叶片数相差不大。与普通型玉米相比，多叶型玉米的叶面积指数显著增加，叶片保持良好受光姿态，高效捕获光能，合成更多的光合产物，在同等种植密度下产量潜力高于相同熟期的普通玉米。适当增加玉米穗上叶片数不仅可有效高光能利用率，增大干物质积累的库，促进干物质积累；还可以有效降低雌穗高度与叶夹角，优化玉米株型结构，提高抗倒伏能力和耐密性。
3.玉米穗上叶片数是典型的数量性状，受多位点的共同调控。近年来，国内外多个研究小组利用不同的遗传体，在不同的环境条件下，检测到大量玉米穗上叶片数相关位点(du,x.m.,linghu,j.j.,shang,h.j.,reid,l.m.,zhu,x.y.,wang,j.h.,and wang,g.y.(2015).fine mapping of leafy,a dominant mutant conferring extra leaves above the ear in maize.euphytica 206,49-56.li,d.,wang,x.f.,zhang,x.b.,chen,q.y.,xu,g.h.,xu,d.y.,wang,c.l.,liang,y.m.,wu,l.s.,huang,c.,et al.(2016).the genetic architecture of leaf number and its genetic relationship to floweringtime in maize.new phytol 210,256-268.pan,q.c.,xu,y.c.,li,k.,peng,y.,zhan,w.,li,w.q.,li,l.,and yan,j.b.(2017).the genetic basis of plant architecture in 10maize recombinant inbred line populations.plant physiol175,858-873.salvi,s.(2011).genetic dissection of maize phenology using an intraspecific introgression library.bmc plant biology 11,4.yang,n.,lu,y.l.,yang,x.h.,huang,j.,zhou,y.,ali,f.,wen,w.w.,liu,j.,li,j.s.,and yan,j.b.(2014).genome wide association studies using a new nonparametric model reveal the genetic architecture of 17agronomic traits in an enlarged maize association panel.plos genet 10.李贤唐,丁俊强,王瑞霞,吴建宇(2011)，玉米株型相关性状的tl定位与分析，江苏农业科学，39,21-25。)。然而，玉米穗上叶片数的研究大多局限于初定位的水平，置信区间较大，内含几十甚至上百个候选基因，qtl的精细定位和基因克隆工作相对滞后，难以在实际的分子设计育种中应用。
技术实现要素：
4.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施
例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
5.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
6.因此，本发明的目的是，克服现有技术中的不足，提供一种与玉米穗上叶片数紧密连锁的indel引物组。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：两组与玉米穗上叶片数相关的indel引物组，其特征在于：所述分子标记位于玉米的三号染体上，命名为hf1和hf6。
8.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种用于检测玉米穗上叶片数的hf1和hf6标记的引物。
9.本发明的再一个目的是，克服现有技术中的不足，提供一种hf1和hf6分子标记的筛选方法。
10.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：所述筛选方法包括利用自主选育的多叶自交系y915和普通玉米自交系郑58构建f2和f2:3体；
11.采用玉米55k snp芯片对体基因型进行检测，结合多年多点的表型鉴定结果开展穗上叶片数的qtl定位；
12.对稳定存在的主效位点，利用定位区间两端的分子标记筛选交换单株；
13.结合玉米重测序的结果，在初定位区间开发新的分子标记标记，并使用标记对交换单株及其自交后代进行基因型鉴定；
14.整合交换单株及其后代的表型数据和基因型数据，缩小定位区间。从本实验室自主构建的穗上多叶材料y915的bac文库中筛选覆盖整个定位区间的克隆并测序；
15.根据bac测序结果及参考基因组的序列差异，在其插入缺失片段及共有片段的交界处设计组合引物fh1和fh6。
16.本发明的再一个目的是，解决现有技术中的不足，提供一种引物组在检测玉米穗上叶片数及选育穗上多叶玉米中的应用。
17.作为本发明所述的引物组应用的优选方案，其中：所述利用fh1和fh6引物组配制pcr检测体系对待测玉米品系dna进行pcr扩增，同时以y915作为对照，然后利用琼脂糖凝胶电泳对样品及对照玉米的pcr扩增产物并进行基因分型；含有与y915型等位变异的样品的穗上叶片数显著高于其它样品。
18.本发明有益效果：
19.本发明提供了两组与穗上叶片紧密连锁的indel引物组，可在种子及幼苗阶段提前通过分子标记检测后代植株的叶片数，可大大节省育种成本，加快育种进程；两标记可通过简单的琼脂糖凝胶电泳进行基因分型，表型稳定，检测简单，不需酶切测序或芯片等操作，对仪器设备的要求较低；本发明的标记与控制穗上叶片数的基因紧密连锁，对后期的基因克隆和功能验证具有重要作用。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它
的附图。其中：
21.图1为本发明实施例2中引物组hf1(a)和hf6(b)的示意图图。
22.图2为本发明实施例2中利用标记hf1和hf6检测玉米品种基因型的琼脂糖凝胶电泳图。
23.图3为本发明实施例3中利用标记hf1和hf6进行分子标记辅助选择育种的流程图。
具体实施方式
24.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
25.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
26.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
27.以下实施例涉及的穗上多叶的材料y915，普通玉米材料郑58、g86和w373及其定位体均由扬州大学农学院玉米遗传育种组保存。
28.实施例1
29.确定玉米穗上叶片数主效qtlqla3-2的定位区间。
30.玉米穗上多叶材料y915和郑58(我国主要栽培品种郑单958的母本)杂交构建的包含190份单株f2体。利用中玉金(北京)生物技术有限公司提供的玉米56k芯片平台，对该体进行基因型检测。经质量控制，构建了全长1608cm，包含1736个snp标记的高质量遗传图谱。将构建的f2：3体在扬州(2016年春播)、淮安(2016年夏播)及海南(2016年冬播)种植，调查表型数据(每一地点种植两个重复)。在三个环境中，在3号染体3.09bin处定位到稳定的穗上多叶主效位点qln3-2，可解释38％-59％的表型变异(cui m,jia b,liu h,kan x,zhangy,zhou r,li z,yangl,dengd,yin z(2017).genetic mapping of the leaf number above the primary ear and its relationship with plant height and flowering time in maize.frontiers in plant science,8,1437.)；从郑58和y915构建的f2和f3体中筛选交换单株，利用其中具有极端穗上叶片数的交换单株(5叶以下和12叶以上)将qln3-2区间缩小至标记indel-o2和y250之间，物理距离约1.53mb；以穗上多叶玉米y915与穗上少叶玉米g86、w373分别杂交构建f2定位体，通过关键交换单株定位和后代体验证，将穗上叶片数主效qtl-qln3-2定位区间缩小到标记y152和l30-2之间，物理距离为66.7kb。
31.实施例2
32.与玉米穗上叶片紧密连锁的分子标记的开发及多态性标记筛选
33.本发明通过精细定位将qln3-2的候选区间限定y152和l30-2之间，并从穗上多叶玉米自交系y915的bac文库中，筛选到一个覆盖整个定位区间的阳性单克隆maize-177。对阳性单克隆进行测序，结果显示其大小约为142kb。根据maize177序列信息与参考基因组比对结果，在插入(或缺失)片段与共有片段交界处共设计5对组合标记，其中2对在亲本及f1
之间存在多态性，分别为fh6和fh1，具体见图1和2。
34.实施例3
35.利用标记hf1和hf6选育多叶玉米品系
36.为培育具有农艺性状优良的多叶玉米新品系，本方案利用实施例1中的武香粳y915和高产常规材料郑58进行连续杂交并进行分子标记辅助选择(mas)，从中筛选携带多叶基因型的优良株系。具体流程见图3。从杂交f2代开始，利用与穗上叶片紧密连锁的indel标记hf1和hf6对进行pcr扩增和凝胶电泳检测，从中选择具有y915型纯合基因型的单株连续自交，获得300个f6株系。根据f6株系的综合农艺性状，从中选择50个株系，利用分子标记hf1和hf6再次检测，确认所选株系携带y915纯合基因型。将选定的f6株系自交后获种成小区进行综合性状鉴定，从中获得5个性状稳定的多叶新品系。
37.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其
·
均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
技术特征：
1.一种与玉米穗上叶片数紧密连锁的indel引物组，其特征在于：所述引物组的两组分子标记位于玉米的三号染体上，命名为hf1和hf6。2.两组用于检测如权利要求1所述的hf1和hf6标记的引物，其特征在于，包括hf1的引物对：正向引物5'
–
tgcgaagggatggagagc
–
3'，反向引物a 5'
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ccagcagtccagctcttg
–
3',反向引物b 5'
–
tgcgtgctcacgacgtcgact
–
3'hf6的引物对：正向引物a 5'
–
cagtctccacctagctgt
–
3'，正向引物b 5'
–
tactgcaagcgcacctgacc
–
3'，反向引物5'
–
tcgacatcgactctagac
–
3'。3.一种如权利要求1所述的hf1和hf6分子标记的筛选方法，其特征在于，包括：利用自主选育的多叶自交系y915和普通玉米自交系郑58构建f2和f2:3体；采用玉米55k snp芯片对体基因型进行检测，结合多年多点的表型鉴定结果开展穗上叶片数的qtl定位；对稳定存在的主效位点，利用定位区间两端的分子标记筛选交换单株；结合玉米重测序的结果，在初定位区间开发新的分子标记标记，并使用标记对交换单株及其自交后代进行基因型鉴定；整合交换单株及其后代的表型数据和基因型数据，缩小定位区间。从本实验室自主构建的穗上多叶材料y915的bac文库中筛选覆盖整个定位区间的克隆并测序；根据bac测序结果及参考基因组的序列差异，在其插入缺失片段及共有片段的交界处设计组合引物fh1和fh6。4.如权利要求1所述的引物组在检测玉米穗上叶片数及选育穗上多叶玉米中的应用。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：利用fh1和fh6引物组配制pcr检测体系对待测玉米品系dna进行pcr扩增，同时以y915作为对照，然后利用琼脂糖凝胶电泳对样品及对照玉米的pcr扩增产物并进行基因分型；含有与y915型等位变异的样品的穗上叶片数显著高于其它样品。6.如权利要求4所述的应用，其特征在于，包括：可在种子及幼苗阶段提前通过分子标记检测后代植株的叶片数。
技术总结
本发明公开了一种鉴别玉米穗上叶片数的分子标记以及利用其培育穗上多叶玉米的方法。通过选用自主选育的穗上多叶玉米与常规品种杂交，利用本发明提供的与穗上多叶紧密连锁的分子标记进行后代叶片数的快速选择，可显著缩短育种年限，节省育种成本；同时该方法可拓宽多叶种质资源，对培育多叶玉米新品种提供了重要的技术支持。要的技术支持。要的技术支持。
