基于杂化的碳纳米颗粒的光合作用刺激物、相关的生产方法以及在农作物中作为纳米生物刺激物和纳米肥料的相关用途与流程
1.本专利属于农用化学品领域。本发明涉及基于碳点的具有发光和营养物携带的特性的纳米复合材料的制备，所述纳米复合材料当施用于植物的叶和/或根时刺激光合作用，并且还刺激生理响应以增强发育和生产力。这样的响应是文献中归类为生物刺激物和/或生物肥料的材料的特征。
背景技术
：：：2.持续的人口增长，加上无节制的城市化，给农业和其他生产部门带来了压力，以克服不断增长的粮食需求、有限农业区的可持续生产以及农村劳动力减少和适应气候变化的挑战(jaggard；qi；ober,philosophicaltransactionsoftheroyalsocietyb:biologicalsciences,2010)。3.根据un(联合国)，2050年世界人口将超过90亿人，粮食产量将必须增加50-70％。与此同时，对水和能源的需求将成比例增长(keating等人，globalfoodsecurity,3,125-132,2014)。4.fao(联合国粮食及农业组织)对农业田枯竭和退化、水源急剧减少及其对粮食安全和生态系统保护的影响表示出关切。(prasad；bhattacharyya；nguyen,frontiersinmicrobiology,8,1014,2017)例如，到2050年，粮食和动物饲料对谷物的需求可以达到30亿吨，而目前为21亿吨(keating等人,globalfoodsecurity,3,125-132,2014)。5.这种悲观的情况促使全世界努力开发替代方法，在不对自然资源增加压力的情况下以满足全球对粮食、能源和水不断增长的需求(mueller等人,nature,490,254–257,out.2012)。6.从历史上讲，农业是最稳定且最重要的部门，几个世纪以来，农业一直负责为粮食和动物饲料工业提供原材料。20世纪60年代的绿革命极大地增加了全球粮食供应，因为农业受益于由生物技术和化学部门引入的各种技术创新。然而，绿革命后对合成杀虫剂和肥料的严重依赖对生态系统和公共健康造成了负面影响(europeanpublichealthalliance,agricultureandpublichealth:impactsandpathwaysforbettercoherence2016)。7.杀虫剂和肥料的滥用造成了生态系统的污染，以及水生环境和土壤的富营养化(tilman等人,nature,490,254-257,2002；bhat,asiapacificjournalofclinicalnutrition,17,91-94,2008)。在淡水资源(albuquerque等人,environmentalscience.processes&impacts,18,779–787,2016)、水果、加工食品(cabras,angioni,j.agric.foodchem.48,967-9732000)甚至人类母乳(bedi等人,scienceofthetotalenvironment,463–464,720–726,2013)中都发现了杀虫剂残留。8.martin等人(2018)观察到癌症与接触杀虫剂之间的联系，并主张杀虫剂在恶性结肠癌肿瘤的病因学中可发挥重要作用，因此需要监测人接触农药残留物的水平(martinenvironmentalmicrobiology,78,6749–6758,2012)。17.纳米农用化学品残留物在人类和环境中的生物累积是一个有待解决的问题，因为随着生产链中这样添加剂的逐渐增加，这种累积必然会增加，并且有必要考虑这些残留物可能存在的所有水平，并且还确定这样的投入品的安全参数，从而确保对环境的影响最小。18.在这种情况下，本发明优于使用金属纳米颗粒的所有技术，因为它基于碳纳米颗粒或碳点，其被植物完全代谢，并且不在食物链中转移，即不存在营养转移。19.此外，金属纳米颗粒对土壤微生物有影响。ge等人(2012)通过基于dna的指纹分析评估了tio2和zno纳米颗粒对土壤细菌落的影响(ge；schimel；holdena,appliedandenvironmentalmicrobiology,78,6749–6758,2012)。获得的结果表明，这些材料引起了土壤生物区系平衡的变化。观察到根瘤菌目、慢生根瘤菌科和慢生根瘤菌(固氮菌)种的减少，以及对鞘脂单胞菌科和链霉菌科种的积极影响(ge；schimel；holdena,appliedandenvironmentalmicrobiology,78,6749–6758,2012)。20.为此，碳纳米材料因其具有低毒性、生物相容性和不可生物累积性而成为开发可持续农业替代品的希望。除了作为肥料之外，碳纳米材料显示出对种子发芽和增强植物生长的有益效果(zheng等人,acsomega,2,3958–3965,2017)。21.碳点是一类尺寸小于10nm的准晶体类球形纳米颗粒，且由无定形碳边界包围的高度有序的多芳族域(核)组成(choi等人,chemistry-anasianjournal,13,586-598,2018)。碳点在2004年在单壁碳纳米管的纯化过程中首次被分离出来(xu等人journaloftheamericanchemicalsociety,120,12737-12737,2004)。22.现有技术中描述了许多碳点制备方法。23.liu等人(2016)采用电化学方法，通过使用石墨电极作为碳源来合成碳点(liu等人,analyst,141,2657-2664,2016)。研究人员使用石墨棒作为电化学电池的阴极和阳极，用氢氧化钠/乙醇作为电解质溶液。电流通过电化学电路导致石墨棒碎片的形成，从而产生具有不同发光特征(不同波长)的碳点。由于作者获得的碳点是多分散的，发光行为的差异可以归因于混合的尺寸和明显的表面缺陷。该方法的另一个缺点是产品产量低，石墨棒的成本高，并且需要纯化阶段。必须要强调的是，上述方面使得由电解产生的碳点的商业应用不可行。24.还描述了电化学途径，(ramiladevi；vigneshkumar；sundramoorthy,journaloftheelectrochemicalsociety,165,g3112–g3119,2018)提出了电解质溶液组成的变化以获得其它性能。然而，电化学方法的一个明显的限制是大的颗粒尺寸分布和形态，通常在合成结束时，需要随后分离和纯化获得的材料(ramiladevi；vigneshkumar；sundramoorthy,journaloftheelectrochemicalsociety,165,g3112–g3119,2018)。25.在涉及碳源的多个反应过程(例如燃烧(combustion)或燃烧(burning))中产生的碳烟，也被用作合成碳点的前体。将这些材料/副产物放入具有浓酸(如硝酸)的回流系统中，然后对较小的纳米颗粒进行尺寸分离(liu等人,angewandtechemie,46,6473-6475,2007)。酸的强氧化特性对于碳烟中碳聚集体的溶解至关重要；酸进一步与碳胶体反应，以产生与颗粒的荧光发射相关的富氧和富氮表面缺陷。然而，这样的碳烟基的或富碳的副产物材料导致低产率的碳点，并形成大量的有毒残留物。26.碳源的水热处理已经成为碳点生产最常见的程序。这种方法使得能够从各种来源(例如分子和残留物)产生纳米颗粒(deyro等人,aipconferenceproceedings,2083,0200007,2019)。27.碳点的水热合成的本质是一个开始于高温诱导碳分子成核/凝结的过程，该碳分子作为形成石墨核的结构单元。水热合成方案的另一个重要特征是来自碳试剂的一些残留物保留在石墨核的表面上，从而为颗粒提供各种可控的功能和光学特性(wang等人,analyticalmethods,10,2775–2784,2018)。28.与前面提及的方法相比，水热路线显示颗粒具有窄的尺寸分布和发光性能的一致性。然而，限制因素与通常较高的合成时间，以及受使用控制内部压力的系统限制的低产率有关。29.demedeiros等人(2019)通过基于微波的水热合成获得了碳点。微波辐射取代了传统水热法中使用的热源。通过微波加热产生的碳点在溶液和固相中都发射高发光。合成时间大大减少，因为整个过程中释放的能量相当高，并且可以在设备本身内控制。得到的颗粒类似于通过水热法得到的颗粒，尽管产率降低并受限于合成中所用附件的强度(demedeiros等人,journalofmaterialschemistryc,7,7175–7195,2019)。上述方面阻碍了通过水热反应大规模生产碳点。30.用于制造碳点的高温碳化已经在除水以外的溶剂中进行。马克斯·普朗克聚合物研究所的研究人员表明，对分散在非配位溶剂(例如，有机溶剂十八烯和1-十六胺)中的碳源(例如柠檬酸)进行热处理产生高度发光的碳点(wang等人,chemistryofmaterials,22,4528–4530,2010)。反过来，在这样的条件下，来自合成的残留物成为增加碳点产量的障碍。31.前面提到的技术虽然对碳点的生产有效，但都有关于生产大量具有均匀且可选择特征的材料方面的障碍。如在电化学法和水热法中，即使那些具有高产率合成的技术也面临着所得材料的再现性和质量的困难。值得一提的是本发明提出的方法允许大规模生产碳点，并且不同于前面提到的方法，因为没有使用水热法，没有毒性试剂或残留物。在本发明中，碳点的生产通过在封闭回路中的连续流动反应来进行，这确保了再现性和高产率。所提出的方法再使用所有的水和残留物，并且不产生温室气体。32.除了碳点生产技术，重要的是要强调，在生物环境中探索碳点需要注意，因为合成材料的原材料和条件是影响表面组成、功能性和生物活性的因素。33.几个示例说明水热法产生的碳点在其表面上含有前体分子的片段。例如，在zhao等人(2017)报告的文件中，由蛋黄油热解产生的碳点表现出类似于药物血凝酶的抗出血活性(zhao,y.,zhang,y.,liu,x.等人.scientificreport,7,4452,2017)。34.在专利申请cn103980894a中，通过水热路线由叶酸产生的碳点能够通过与和叶酸相互作用的质膜蛋白(叶酸受体)特异性地相互作用来选择性识别肿瘤细胞。各个碳点表现出与由其它前体产生的其它纳米颗粒相似的所有形态和物理化学特征。尽管如此，表面上叶酸片段的存在使它们独特，并有资格获得专利保护。35.在另一个示例中，由鸡蛋膜热解产生的碳点能够选择性地识别dna和rna片段(pramanik等人.pccp,20,20476,2018)。值得一提的是，由其它碳源热解产生的碳点没有显示出识别核酸的选择性能力。36.在国际专利申请wo/2018/160142中，由聚氧乙烯在酸性条件下的缩合产生的碳点产生了具有抗菌特性的纳米材料，并被结合到惰性聚合物膜中。同样，形态和物理化学特征类似于由其他碳源产生的碳点的特征，尽管颗粒的表面特性导致了能够保护其的特定生物活性。37.因此，尽管形态和物理化学方面表明碳点通常只是碳球，但是合成过程和碳源影响碳点的表面组成和生物特性。38.zheng等人(2017)发表的文件中提出了碳点在农业中作为肥料的用途，该文件公开了花粉作为纳米颗粒前体的用途(zheng等人,acsomega,2,3958–3965,2017)。在水培莴苣中进行试验，且该试验表明，用20mg·l-1溶液处理的植物生长约50％。结果没有表明与负责植物生长的蛋白质或酶的选择性相互作用。作者简单地提出了碳点作为肥料的用途。39.在li等人(2018)发表的研究中，由石墨电解产生的五个碳点在水稻中表现出独特的表面组成和不同的响应(li等人,acs,appliedbiomaterials,1,663-672,2018)。40.描述了颗粒之间植物生长活性的显著差异，证明了即使尺寸和物理化学特征相似，每个颗粒也具有独特的特征。此外，观察到合成的碳点与植物遗传物质相互作用，促进生长基因os06g32600的表达。进一步观察到c点与负责固定大气co2的rubisco蛋白相互作用(li等人,acs,appliedbiomaterials,1,663-672,2018)。41.综上所述，本发明优于其他技术，因为它处理具有特定特征的碳点，所述特征模拟了类似于与质膜蛋白特异性地相互作用的植物激素的响应，并通过专门开发的合成有机催化方法获得，以促进加速植物生长并将常量和微量营养物直接输送到植物细胞中。42.本专利中描述的碳点作为生物刺激物，增强营养物吸收，改善植物对水的利用，并提高光合作用速率，因为它使气孔开放时间更长，并促进测试培养物的加速生长。43.由此提出的碳点生物活性是独特的，并表明在植物代谢中的颗粒作用发生在类似于植物激素(例如生长素、guiberlines和细胞分裂素等)的水平的分子水平。44.对于以上所有内容，开发如本发明所公开的具有模拟激活质膜蛋白h-atp酶的植物激素的活性的生物刺激物在现有技术中没有预见到。附图说明45.基于图1至19，可以更容易地理解本发明，其描述如下：46.图1图示了由金属纳米颗粒和金属氧化物纳米颗粒引起的食物链富营养化过程。47.图2示出了根据所开发方法的生物刺激物生产方案。48.图3示出了通过所开发的方法合成的碳点的傅立叶变换红外光谱。49.图4示出了通过合成前体产生的碳点形成和表面基团的保持。50.图5示出了碳点在uv-可见光区的吸收光谱和在360至620nm区间的激发发射光谱。51.图6示出了叶绿素a和b的吸收光谱。52.图7在a中示出了xps光谱和通过计算常量营养物氮、磷和钾(n、p、k)的生物刺激物组成。在b中，为磷的高分辨率光谱。在c中，为显微图像和高分辨率透射电子显微图像(hrtem),在d中，为颗粒直径分布。53.图8示出了zeta电势(ζ)和流体动力学直径作为加入了10ml体积的浓度为50mg/l的碳点的营养物溶液体积(ml)的函数。54.图9示出了在四个区中的植物分布p1(白)和p2(蓝)。55.图10示出了用不同浓度的碳点处理的p1组在处理开始后第17天(a)、第28天(b)、第42天(c)和第56天(d)的样品分布。56.图11示出了用不同浓度的碳点处理的p2组在处理开始后第17天(a)、第28天(b)、第42天(c)和第56天(d)的样品分布。57.图12示出了b1、b2、b3和b4组在植物房中的处理分布。58.图13示出了不同浓度的碳点对b1和b2区的‘finestra’番茄的光合作用速率(右侧)和水分利用效率(左侧)的处理效果。59.图14示出了不同浓度的碳点对b3和b4区的‘finestra’番茄的光合速率(右侧)和水分利用效率(左侧)的处理效果。60.图15示出了不同浓度的碳点对水培莴苣作物的水分利用效率的处理效果。61.图16示出了碳点在玉米幼苗根干质量(rdm)中的浓度影响。62.图17图示了leonard花瓶中的玉米作物系统，通过营养物溶液施用碳点。63.图18示出了100mg/l碳点在液体光合作用(a)、气孔导度(b)、蒸腾作用(c)和水分利用效率(d)中的浓度影响。64.图19示出了通过使用带有碳点的霍格兰德溶液，玉米植物中营养物增加或减少的百分比。具体实施方式65.本发明涉及一种具有光致发光特性的含碳光合作用刺激物(碳点)，其用作生物刺激物和生物肥料，因为一旦施用于植物的叶或根，可以引起促进植物生长的生理响应。所述生理响应在光合变量、植物根系特征以及发育周期必需的微量和常量营养物的吸收中观察到。66.此外，本发明的产品表现出高的水溶性和可生物降解性；能被植物完全代谢，因此不具有生物累积性；其使用减少了食物链中常规纳米颗粒的营养物转移的负面影响；并且它是无毒的。正因为该原因，与传统的农用化学品相比，它减少了与土壤和水污染有关的环境影响，从而使其具有更高的潜力用作投入品。67.纳米材料作为有机碳源，并作为锚定在其结构中的微量和常量营养物载体。在自下而上的合成过程中，纳米材料的尺寸受到控制，并因此其结构中的活性位点的活化受到控制。通过表面工程专业知识，这些活性位点被构建并易于接收营养物和/或刺激物，由于植物与纳米复合材料的生物亲和性以及它们的易代谢性，这些营养物和/或刺激物将以更高的效率被输送到最多样类型的作物。68.该技术中显示的纳米材料通过根据图2的使用反应器组合的流通(flow-through)法获得。为了在合成过程后更好地储存，材料要进行另一次干燥操作。69.本发明的形式之一涉及生产碳点的方法，这是一种通用的方法，因为它允许使用不同的富碳基质作为原料，例如谷氨酰胺、有机酸、柠檬酸、酒石酸、油酸、苹果酸、富马酸、异柠檬酸、玉米淀粉；还可以通过使用能够提供适当试剂成分的替代来源、具有相同官能团和短链的复合材料来进行协同处理，优选柠檬酸和酒石酸。70.与常规路线(水热路线)相比，所提出的方法是快速的方法，因为不需要如在水热路线中发生的长的稳定时间来启动碳化过程和颗粒生长。这也是一种低成本的方法，因为它可以以连续过程生产。水被用作溶剂，并且在合成过程结束时没有产生有毒废物。71.碳点合成中使用的方法是一种涉及物理化学转化的方法。所使用的路线被认为是化学上绿的，因为它使用水作为溶剂，并且在合成中没有产生有毒残留物。72.通常，所述方式(modality)可以理解为由催化化学反应和流通过程组成的获得碳点的过程。73.纳米颗粒由不同的碳源(即柠檬酸、葡萄糖、氨基酸和农业废物，例如果皮、果浆和动物粪便)获得；主要使用柠檬酸是因为部分中和酸碱反应，其中碱溶液(羟基官能团的来源)用于由酸形成盐，并通过溶液形式的离子(oh-)诱导的静电排斥作用促进形成多个成核点。所用的碱溶液可以是氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、苯胺、金属胺、尿素和硫脲，优选氢氧化铵。74.制备酸溶液(碳源)和碱溶液(官能团源)，并将其放入流动系统中。75.使用计量泵和阀，将所述溶液计量加入混合器中，随后，将其再引导至接收再循环物和掺杂物(微量和常量营养物或刺激物)的第二混合容器。在通过混合器后，将试剂泵入配有阀的活塞流管式反应器(pfr)中，该阀限制材料输出并在其内部保持恒定压力，从而避免当反应器加热到100℃至250℃，优选150℃时试剂蒸发。76.pfr反应器必须具有减小的直径，仅几毫米，并且由低粗糙度的材料制成，以减少材料流出过程中的压降。该过程中的另一个关键因素是保持湍流水动力径流状态；所有这些都是通过伯努利方程计算得出的，因为该反应器必须放置在温室内以加热混合物。77.根据所用材料的浓度，所述反应器必须加热到100-250℃。反应器内的压力由出口阀控制，从而防止溶液沸腾；压力因反应而异，取决于所涉及的盐的密度。所述压力是高的，因此反应器材料必须承受至高5巴的压力。从第一反应器(管式反应器)出来的材料流排放到连续搅拌釜式反应器(cstr)中，该连续搅拌釜式反应器也被加热并具有搅拌活动。所述反应器的出口流通过分离系统，该分离系统通过水力旋流器密度差或滗析器工作，该滗析器允许通过溢流除去最终产物并将底流料流返回至回流。78.需要进行材料回流直到建立最佳操作条件。形成的产物密度低于前体盐溶液，因此，可以通过该原理分离产物，去除上清液并再循环底部材料，将底部材料插入在反应器之前并加入初始试剂料流中。材料保持回流的稳定化过程之前的过程花费0.5至2小时，优选1小时；从这时起，材料密度开始改变，产品开始成型。79.该方法的产率为95％(2小时循环后为713g)。材料的这些量足够用于24公顷。80.该产品可以以液态储存，或者可以经过干燥过程，在该干燥过程中，材料的表面积扩大到其体积的大约5倍。81.用于生产碳点的技术具有缩放特征，这允许其在不对所形成的碳点的质量产生负面影响的情况下可行地过渡到工业规模。在将实验室生产的c点的生产放大100倍进行的试验中，显示出可以生产和保持相同性能和质量。在低环境影响的高生产需求下，如农业投入品行业所要求的，这种技术是创新性的，并与当前新的生产需求相结合。82.多功能性也是开发的生产平台的主要特征之一，它允许其组成和特性发生变化，以满足生产链的需求。83.通过这种方法生产的碳点显示出高水溶性，这是由于在合成中前体分子中存在亲水基团，这可以通过图3所示的红外光谱来检验。84.除了亲水特性之外，纳米颗粒表面基团在溶液中具有离子络合潜力(图4)。当在合成后通过表面基团络合时，植物需要量高的常量营养物(钾、氮、钙、磷、镁和硫)和需要量低的微量营养物(锰、硼、锌、铁、铜、钼和氯)都可以加入到制备碳点的过程中。85.除此之外，它们是可生物降解的材料，这赋予了它们作为农业投入品的更高的应用潜力。86.因此，本发明的另一种方式涉及基于碳点的纳米制剂作为强有力的光合作用刺激物、生物刺激物和有机矿物生物肥料的用途。本文件中介绍的技术是完全无毒的、生物相容的、不可生物累积的，并且是通过使用绿纳米技术原理可持续生产的。试验结果表明，光合作用效率提高约60％，水分利用效率提高50％，根质量增加50％。生产并掺杂基本化学元素的纳米材料同时提供营养物，并改善植物的生理状况，并减少传统上使用肥料的不利影响。必须强调的是，所介绍的技术克服了与经济可行性、生产规模、环境生产和安全性相关的限制，这些限制是农业中可持续使用纳米技术的阻碍。87.碳点作为光合作用刺激物的用途源于其光谱特性。含氮芳族试剂的引入(其促进了c＝n/c＝o键的形成)，是多态吸收并在蓝/绿/红区域发射的原因(图5)。88.叶绿素a和b显示两个吸收带，其中心位于对应于蓝(～440nm)和红(～650nm)的光谱区域，但对绿区域显示极低的光谱响应(图6)。合成的碳点在绿区域(532nm)显示出强吸收，且发射中心在645nm。由于更好地利用阳光，这种光谱适应导致增加的培养物生产率。89.实施例90.示出以下实施例来说明本发明的最佳实施方案。值得一提的是，本发明不限于所引用的实施例，而是可以用于所描述的所有应用或任何其他等效变型。91.实施例1：碳点合成92.农业上的使用的量要求比实验室中使用的量更高。因此，在如图1所示的试点结构中引入了方法和生产规模。将500g葡萄糖和550ml氢氧化铵溶解在1000ml水中，并放入图1所示的流通系统中。工作温度设定为150℃，最终产物的产率为95％(2小时循环后为713g)。材料的这些量足够用于24公顷。93.实施例2：含有常量营养物的杂化的碳点的合成94.最初，该方法没有被提供第二混合器，但是随着再循环的需要和输入营养物的需求，在接收酸料流和碱料流的第一混合器之后增加了第二混合器。因此，计算再循环物和掺杂物剂量，以实现化学计量比。这允许生成纯c点和杂化的碳点，其中将最多样的掺杂物添加到第二混合器中。95.图7a示出了xps光谱和含有常量营养物的样品组成。图7b中的高分辨率xps光谱示出了磷(p)被结合到碳基质中。以131.25和132.25ev为中心的谱带分别对应于-c3-po和-c-po3基团。图7c和d示出了具有类球形形态且平均尺寸为5nm的纳米颗粒的图像。该结果表明，磷可以直接输送到植物细胞机构，且营养物生物利用度过程类似于营养氮的生物利用度过程，这取决于植物对纳米材料的代谢。该纳米材料同时充当光合作用刺激物、生物刺激物/生物肥料和充当常量营养物(有机矿物肥料)的来源。此外，它是完全水溶性的、无毒的，并且有利地减少了由于在土壤中过度使用肥料而造成的环境影响。值得指出的是，到本发明公开为止，文献中没有报道类似的技术。96.实施例3：营养物载体电势的评估97.研究了碳点营养物载体电势，因为在溶液中，在表面占多数的羧基(coo-)赋予负电荷，因此赋予有利于系统胶体稳定性的排斥。被分类为微量和常量营养物的金属在溶液中带有正电荷，并可以被颗粒中的羧基所吸引。98.为了分析添加离子时碳点的表面行为和稳定性，随着营养物溶液添加量的增加，进行zeta电势(ζ)和流体动力学直径的测量。10ml的浓度为50mg/l的c点用标准霍格兰德溶液(1/2强度)标定。在图8中，随着更多离子的加入，可以观察到zeta电势和流体动力学直径的行为。99.如所预期的，电势降低表明正金属离子结合到表面，导致电势逐渐降低。然而，从某一体积开始，曲线行为趋于保持不变，如图8中所观察到的。即使在高离子强度下，颗粒也表现出稳定性，这由流体动力学直径的狭窄变化证实。这些特性表明，c点可以与标准营养物溶液一起使用，以促进营养物运输并避免传统农业中发生的营养物浸出。胶体稳定性也增强了例如光合作用刺激物、生物刺激物/生物肥料和液体有机矿物肥料的技术商业化的可能性。100.实施例4：农艺试验101.选择了一种甜椒作物(capsicumannuum)来显示纳米材料对植物生长的影响，因为这种作物受到了许多关于水果中农用化学品残留物的批评。102.碳点对甜椒生产系数的影响在析因方案2×4中建立，其中两个是应用用途(单次应用并分四个阶段(instalment))，且四个碳点浓度从0、25、50和100mg.l-1变化。试验采用随机区设计，重复四次，总计总数为32个实验单元。103.实验单元是每个中填充惰性基质和植物的混合物的5.0dm3的塑料容器。通过施肥添加营养物和水，每天添加400ml全营养物溶液四次。104.将甜椒种子播种在发芽盘中，27天后，将长出的幼苗移植到预先填充惰性基质的5升容器中，该惰性基质的组成中有草皮、蛭石、有机废物、农用工业有机废物和石灰石。选择移植后19天内的32株幼苗开始施用碳点；在选择时，所有幼苗的尺寸和使用的生长标准是相同的。105.应用的碳点浓度(0至100mg.l-1)根据前面的试验确定。对于每株植物的每个浓度，用于随后碳点质量量化的最大溶液体积为200ml。植物分为两组p1和p2，其中分类为p1的植物接收单次剂量的溶液(200ml)，而p2的植物每隔15天接收逐步剂量(50ml)，直到达到最大溶液体积(200ml)。图9显示了将植物分为四个区以检查处理随机化。106.将植物放入玻璃温室中，每天均匀灌溉四次。将碳点溶液喷洒在叶上，以使过量的溶液可以自由地流入植物基质中。107.为了测量碳点在植物相对生长中的影响，用一个以毫米为刻度的卷尺沿测试方向测量尺寸。在第一天，在开始施用之前，测量并收集初始尺寸，然后施用第一浓度。p1组在每株植物中接受200ml的体积，而p2组接受50ml的第一剂量。p2组每两周在施用后的同一天进行一次尺寸收集过程，直至达到200ml体积。108.等式1用于计算植物的相对生长，其中“h最终”代表施用处理后进行的测量，“h初始”代表施用处理前进行的测量。109.等式1：110.将收集的数据制成电子表格，用于统计测试。使用的第一统计检验是夏皮罗-维尔克正态性检验，其表明所收集数据的非正态分布类型。然后，使用非参数统计(独立样本的kruskall-wallis检验)来评估结果。(图10)。鉴于此，比较平均值是确定统计差异和进行的观察的结论的最适当方式。111.c点的浓度和数量对植物生理生长的影响通过分开的p1组和p2组的统计数据显示。112.从进行的统计分析可以得出结论，对于p1组(图10)，仅在试验开始时每株植物单次施用200ml后，施用56天后，浓度为100mg·l-1的处理和浓度为0mg·l-1的对照处理之间存在统计学差异。当与其他处理，特别是对照处理(即没有施用纳米生物刺激物(0，0mg.l-1))相比较时，当使用较高浓度的碳点(100mg.l-1)时，甜椒有较大的相对生长。113.相比之下，当分析p2组的结果时(图11)，其中每两周对于每个浓度施用50ml的量，直到达到200ml的体积，在42和56天后观察到浓度为25mg·l-1的处理和0mg·l-1的对照处理之间的统计学差异。当与对照浓度和其他处理相比时，分次施用的较小浓度以更高效的方式促进相对生长。114.实施例4：碳点对‘finestra’番茄光合作用速率的影响115.碳点对光合作用速率的影响通过使用便携式光合作用系统显示，该系统使用红外气体分析仪。这些测量的关键点是co2同化和通过气孔的叶片蒸腾作用造成的失水之间的关系。co2和水在红外线中的特定响应用于开发在气体交换过程中读取红外线的传感器(红外线气体交换分析仪–irga)。116.co2和水蒸气的变化可以通过叶同时监测，因此当被读数室中的设备照亮时，提供了液体光合作用和样品蒸腾作用的精确且综合的体内测量，该读数室在不损坏叶的情况下夹紧叶，并且当样品处于读数室内的黑暗环境中时，还提供了线粒体呼吸速率和残余蒸腾作用。117.在“finestra”番茄(由embrapavegetables开发的f1)中观察到碳点对光合作用的影响。118.番茄幼苗在播种25天后移植到花瓶中，并且在移植后60天开始收获果实。119.在播种48天后，选择5个具有幼苗的盘开始施用生物刺激物。该试验的浓度如下：0mg·l-1(仅水)；0.5mg·l-1；2.5mg·l-1；5mg·l-1和10mg·l-1。将溶液喷洒在叶上，以使过量的溶液可以流入基质中。用于填充盘和花瓶的基质由生物稳定的松树皮、蛭石、木炭粉、水和酚醛泡沫制成。120.在仍然在发芽盘中的真叶出现之后，在幼苗上进行施用第一剂量。对于每种处理将250ml的单次剂量均匀地喷洒在盘上，并连续三天重复该过程。121.从先前处理的盘中，选择来自每种处理的20株幼苗(0；0.5；2.5；5.0；10mg·l-1)移植到具有基质的15升花瓶中。将幼苗随机分布在四个区中，因此对于每种处理，每个区重复计数四次，总共80株幼苗。b1区和b2区暴露在温室的光下，而b3区和b4区用遮光布覆盖(图12)。122.前面实施例中示出的等式1用于计算相对生长。123.在移植到花瓶后，幼苗在基质中经过15天的成熟时间，在这之后恢复施用。对于番茄植物所处的生长阶段，将500ml的剂量施用于叶上，溶液和基质之间可能接触。相同剂量的处理(浓度)被分开并分组用于均匀地喷洒溶液。然后，将处理物再次分配到各自的初始工作台，注意不要让有遮光布的花瓶与没有遮光布的花瓶在返回工作台时混合。施用过程一直以单次剂量每周重复四次以上。124.在停止施用后在早晨进行数据收集，并对一天中光合作用速率和蒸腾作用的机制和强度进行生理学研究。保存所有处理的读数条件，并在分析结束后，提取数据用于在由设备提供的感兴趣变量中应用统计检验。125.图13和14示出了处理的效果。使用的第一统计检验是夏皮罗-维尔克正态性检验，其表明所收集数据的非正态分布类型。然后，使用非参数统计(独立样本的kruskall-wallis检验)来评估结果。鉴于此，比较平均值成为确定统计差异和进行的观察的结论的最适当方式。126.通过比较具有遮光布的处理的组(b3和b4)和没有遮光布的处理的组(b1和b2)，显示了碳点浓度和自然光在‘finestra’番茄植物的光合作用中的联合作用。如前面所解释的，碳点具有光吸收/发光和发射特性，这些热性可以通过叶绿素对光的吸收过程来研究。127.获得的b1区和b2区数据显示，浓度为2.5mg·l-1和5mg·l-1的处理有增加光合作用速率的趋势(图13)。128.水分利用效率不是由irga直接提供的参数，而是可以通过将光合作用值(pho)除以气孔导度(ci)获得。因此，对于b1和b2区的浓度为2.5mg·l-1和5mg·l-1的处理的水分利用效率也趋于增加(图13)。129.b3和b4区(均由遮光布保护)收集的数据(图14)强调了一个事实，即在施用碳点的地方，光合作用速率低于对照处理(0mg·l-1)。然而，水分利用效率提高了(图14)。130.遮光区和非遮光区之间的差异表明，碳点发光行为仅在当被外部光源照射时发生。131.实施例5：碳点对莴苣作物的光合作用速率的影响132.还显示了碳点对水培系统中栽培的莴苣(lactucasativa)的光合作用的影响。水培作物是一种栽培技术，其中土壤或基质被含有植物生长所必需的所有的营养物所替代。133.水培系统允许幼苗通过根用营养物溶液逐渐灌溉。因此，排除喷洒，水培系统本身被用作碳点到植物的分配载体。134.使用了与三个具有独立水培溶液的储存器相连的三个独立的工作台。每个储存器有1000升溶液的体积，该溶液定期地被投入系统中的循环。为所有的储存器准备了霍格兰德改进的营养液营养物溶液(植物生长所必需的)并测定了碳点的三种浓度，0mg.l-1；20mg.l-1和50mg.l-1。营养物溶液本身被用作碳点分配载体。135.获得幼苗并在温室中经过一段适应期，在温室中，它们均匀地分布在三个工作台，并用预先制备的营养物溶液灌溉。碳点在储存器中被稀释，并在随后的莴苣幼苗移植21天后投入循环。136.在每个处理中对十株莴苣幼苗进行数据收集。在开始施用碳点后15天进行测量，并保存所有处理的读数条件。在分析结束后，提取数据用于如实施例4中的统计检验。137.图15示出了由irga获得的数据。仅在较高浓度的处理50mg.l-1和对照处理0mg.l-1的水分利用效率上观察到差异。这些观察有助于这样一个事实，即当在叶上进行施用时，实现了光合作用效率，但是，即使在没有促进光合作用的变化的情况下，碳点也可以促进光合作用期间水分更好地利用。138.实施例6：碳点浓度对玉米幼苗根系的影响139.玉米幼苗用10％的naclo4溶液超声处理10分钟，并用蒸馏水冲洗5次以达到灭菌目的。然后将它们无菌放置在发芽纸上，并在黑暗、28℃的bod室中发芽。发芽两天后，将约1-1.5cm的生根幼苗转移到塑料花瓶中的水培系统中，该花瓶含有补充有0mg.l-1、10mg.l-1、20mg.l-1、40mg.l-1、80mg.l-1和160mg.l-1的碳点的霍格兰德营养物溶液(25％强度)。生长5天后，收获植物(n＝9)并评估根干重量(rdw)。通过回归分析结果，并计算最有效的碳点浓度。140.为了计算最有效的碳点浓度，进行了回归分析，且本文显示的模型是最适合数据的模型。回归数据遵循正态分布(图16)。141.显示了一个显著的二次模型，在较低浓度时增加而在较高的所用碳点浓度时逐渐抑制(图16)。最有效的浓度估计为100mg.l-1碳点，导致与对照处理相比rdm增加约75％。142.实施例7：碳点对叶中的光合作用速率、气体交换和玉米种子中的营养物含量的影响143.用不同剂量的碳点进行回归分析后，在仅对照(0mg.l-1)与如实施例6中所概述的观察到的最有效剂量(100mg.l-1)的比较中，显示出碳点影响。144.将约1-1.5cm的生根种子转移到leonard花瓶中(图17)，在花瓶顶部含有0.5kg的用10％hcl溶液灭菌，随后用蒸馏水冲洗，直到电导率《5ms.cm-1的沙(0.5-0.84mm)。在leonard花瓶的底部，放置0.5dm3的补充有0或100mg.l-1碳点的霍格兰德营养物溶液(25％强度)。将幼苗移植，每周用新生产的，但浓度增加到50％、75％和100％浓度的溶液替换溶液。145.在28天的生长之后，通过使用具有6cm2的标准叶室的irga型的光合作用系统测量植物(n＝4)中叶的气体交换的参数，例如液体光合作用、气孔导度和蒸腾作用。水分利用效率(wue)计算为液体光合作用和蒸腾作用之间的比率。气体交换室中的co2浓度设定为400μmol.mol-1，且测量在500μmol.m-2.s-1的光合通量密度下进行。在上午9点至11点进行计算。实验过程中的平均温度为约28℃，且相对湿度为50％至60％。146.对于营养分析，收获植物并在65℃下热处理直至恒定重量，用刀磨机(knifemill)进一步研磨成细粉末(2mm目筛)。在180℃下用hno3和hclo4分解0.5g复合材料后，用微波等离子体原子发射光谱法分析所得材料的ca、mg、s、fe、cu、mn、zn和ni含量。在用h2so4和h2o2分解复合材料后，通过抗坏血酸/钼蓝酸法在660nm下用比法估计总磷。147.通过方差分析的f检验分析了叶的气体交换和营养物含量。148.添加碳点导致液体光合作用增加(p《0.05)(图18a)。然而，气孔导度和蒸腾速率没有改变(分别为图18b和18c)。149.世界农业对水分利用效率(wue)的需求不断增加。在这方面，植物刺激物的使用应被视为一种有价值的工具，因为这些刺激物作为根结构改进剂和损害植物初生和次生代谢过程的诱导剂。wue代表植物优化碳吸收和最小化水分损失的能力，从而产生竞争优势。150.碳点将wue显著提高了22％(图18d)。该参数的增加是植物刺激物添加的特征，并突出了碳点通过增加植物从土壤中吸收水分的能力来调节根生长的能力。151.由于营养物溶液中存在碳点，分析的所有营养物的含量都显著变化(图19)。其中，观察到仅镁有所下降(8.7％)。磷、ca和zn显示出较小增量，按顺序分别为7.8；8.3％和13.0％。硫和ni含量显示出26.6％和55.5％的中等增加。观察到mn、cu和fe的增加最多，它们的含量分别达到70.2；82.1；82.6％。152.营养物含量数据显示，碳点作为光合作用刺激物和纳米生物刺激物，改善了一些营养物的吸收。当前第1页12当前第1页12
技术特征：
1.一种光合作用刺激物，其特征在于其包括具有发光和营养物携带特性的杂化的碳纳米颗粒。2.根据权利要求1所述的光合作用刺激物，其特征在于所述碳纳米颗粒掺杂有常量营养物，其中包括钾、氮、钙、磷、镁和硫，优选磷，或者微量营养物，例如锰、硼、锌、铁、铜、钼和氯。3.根据权利要求1或2所述的光合作用刺激物，其特征在于所述碳纳米颗粒吸收多态并在蓝/绿/红区域发射。4.根据权利要求1至3所述的光合作用刺激物，其特征在于所述碳纳米颗粒在532nm波长区域显示吸收，并且发射中心在645nm波长区域。5.根据权利要求1至4所述的光合作用刺激物，其特征在于所述碳纳米颗粒显示出具有5nm平均尺寸的类球形形态。6.生产根据权利要求1至5中任一项所述的光合作用刺激物的方法，其特征在于所述方法是部分酸碱中和反应。7.根据权利要求6所述的生产光合作用刺激物的方法，其特征在于碳点纳米颗粒由富碳基质形成，例如谷氨酰胺、有机酸、柠檬酸、酒石酸、油酸、苹果酸、富马酸、异柠檬酸、玉米淀粉，优选柠檬酸和酒石酸。8.根据权利要求6或7中任一项所述的生产光合作用刺激物的方法，其特征在于所用的碱溶液包括：氢氧化钙、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、苯胺、金属胺、尿素和硫脲，优选氢氧化铵和尿素。9.根据权利要求6至8中任一项所述的生产光合作用刺激物的方法，其特征在于所述方法使用水作为溶剂。10.根据权利要求6至9中任一项所述的生产生物杀虫剂纳米制剂的方法，其特征在于碳点纳米颗粒的形成发生在连续的流通系统中，在所述系统中将酸和碱溶液通过计量泵注入到混合容器中，随后再引导到接收再循环物和掺杂物(微量和常量营养物或刺激物)的第二混合容器中，然后泵送到具有阀的活塞流管式反应器中，所述阀限制材料输出并在内部保持恒定压力和100-250℃，优选150℃的温度，其中过程保持在湍流流体动力径流的状态；然后，将从所述管式反应器出来的材料流排放到在相同的加热模式下的连续搅拌釜式反应器中，所述反应器的输出流通过分离系统，在所述分离系统中去除上清液并将底部的材料再循环，将底部的材料插入反应器之前并加入初始试剂料流中；继续回流过程，直到形成产物。11.根据权利要求1至5中任一项所定义的光合作用刺激物的用途，其特征在于其用作生物刺激物。12.根据权利要求1至5中任一项所定义的光合作用刺激物的用途，其特征在于其用作常量营养物和微量营养物的载体。
技术总结
本发明属于农用化学品领域。本发明涉及基于碳点的具有发光和营养物携带的特性的纳米复合材料的制备，所述纳米复合材料当施用于植物的叶和/或根时刺激光合作用，并且刺激生理响应以增强发育和生产力。这样的响应是文献中归类为生物刺激物和/或生物肥料的材料的特征。征。征。
