一种体外培养鸡小黄卵泡的方法
1.本发明涉及家禽卵泡体外培养技术领域，更具体的说是涉及一种体外培养鸡小黄卵泡的方法。
背景技术：
2.蛋鸡的卵泡发育过程中大部分的卵泡发生了闭锁，只有少数卵泡能通过卵泡选择进一步发育成熟，而小黄卵泡阶段是从白卵泡库选择卵泡进一步发育和积累卵黄物质的关键阶段。不同于哺乳动物，家禽卵泡发育过程中多种类固醇激素的合成和分泌需要卵泡的颗粒细胞和膜细胞共同参与，家禽的卵泡发育是一个连续且复杂的过程，除了卵泡的颗粒细胞和膜细胞外，卵泡的发育还受到与其相关的微环境生长因子，类固醇激素等多方面的作用，他们对卵泡的发育具有重要的作用。
3.目前的卵泡细胞研究主要限制在无法准确复制体内的表型和遗传学特征，常规家禽卵泡原代颗粒细胞和膜细胞的体外培养方法不足以反映家禽体内卵泡发育的真实变化。
4.相对常规的细胞培养，鸡的卵泡离体培养模型成本更低，用时短具有更高的效率，试图模拟出鸡体内卵泡在不同状态下的变化，尽可能的保留组织的完整性反映出鸡卵泡发育过程的真实过程。
5.因此，建立高效的小黄卵泡体外卵泡培养模型，对研究家禽卵泡发育及微环境因子对其调控的机制具有重要的意义。
技术实现要素：
6.有鉴于此，本发明提供了一种体外培养鸡小黄卵泡的方法。工艺流程参见图1，相比于常规的颗粒细胞或者膜细胞培养，保留了细胞间的相互作用，能够更大成度上复刻体内环境中卵泡的真实情况，并且克服了传统卵泡原代细胞培养周期长难存活容易污染的缺点，填补了家禽小黄卵泡体外培养的空白，建立了快速高效的体外家禽卵泡培养模型。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，包括以下步骤：
9.1)将筛选后的小黄卵泡转移到pet细胞培养小室上层，并加入预热好的生长培养基，得培养物；
10.2)将培养物转移到38.5℃，5％co2的环境下培养。
11.有益效果在于：培养温度提高更接近鸡体内的温度40.8～41.5℃。
12.优选的：步骤1)筛选的标准：结构完整表面无血污，直径6～8mm；pet细胞培养小室：24孔0.45μm，每个孔放1枚小黄卵泡；预热：37℃水浴锅进行预热40min，生长培养基的加入量：每孔1ml。
13.有益效果在于：相对于哺乳动物，家禽卵巢中有连续大小不等的各时期卵泡且不需要同期发情，取材方便是研究卵泡发育的理想模型；
14.pet细胞培养小室作为通透性的支架进行卵泡培养。
15.进一步的，卵泡位于培养小室上层滤膜上，孔径与卵泡直径接近，可以模拟体内与卵巢相连接的结缔组织在体外给予卵泡支撑作用，能够概括卵泡发育过程中的复杂性和动态性；
16.青霉素-链霉素溶液、its液体培养基补充剂、胎牛血清fbs均为体积占比。
17.优选的：pet细胞小室各孔间隙加入湿度平衡液，湿度平衡液：20μl灭菌的pbs。
18.优选的：生长培养基：含有1％青霉素-链霉素溶液，1％its液体培养基补充剂，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培养基。
19.有益效果在于：dmem培养基添加1％双抗，降低采样转运过程中污染的可能；
20.活性vd3具有促进卵泡细胞增殖和雌激素孕激素合成的作用，弥补体外培养系统较体内发育卵泡的不足，促进卵泡的增殖和存活。
21.优选的：步骤2)培养的时间：72h。
22.优选的：步骤2)每24小时更换一次生长培养基，更换时，收集替换下的生长培养基用于雌激素和孕激素含量的测定。
23.优选的：步骤2)每间隔12小时观察卵泡生长情况和培养基消耗情况，并进行十字晃动，十字晃动：频率为20～30次每分钟，摇晃10次。
24.有益效果在于：保证组织充分接触气体，模拟体内的动态环境。
25.本发明还提供了上述任一的方法在和颗粒细胞或者膜细胞共培养中的应用。
26.进一步的：在下层铺细胞实现和颗粒细胞或者膜细胞的共培养，更好的模拟出卵泡发育过程中细胞的作用和功能。
27.本发明还提供了上述任一的方法培养的鸡小黄卵泡。
28.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，取得的技术效果：
29.1)在无菌条件下采用纯机械法分离小黄卵泡，最大程度上保留了卵泡的完整性，减少了对卵泡结构完整性和发育潜力的影响。
30.2)采用24孔0.4μm的pet细胞小室进行体外卵泡培养，进一步模拟体内环境在体外给予卵泡支撑功能。
31.3)卵泡在38.5℃，5％co2的培养箱中培养更接近于鸡体内的温度，模拟真实情况。
32.4)在dmem培养基中添加活性vd3，调控体外培养系统类固醇的代谢，促进卵泡的增殖和存活。
附图说明
33.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
34.图1附图为本发明提供的体外培养小黄卵泡流程示意图。
35.图2附图为本发明提供的直径6～8毫米的小黄卵泡图。
36.图3附图为本发明提供的小黄卵泡在pet细胞培养小室中培养图。
37.图4附图为本发明提供的he染检测卵泡的形态图。
38.图5附图为本发明提供的brdu检测有无活性vd3卵泡增殖图。
39.图6附图为本发明提供的有无活性vd3培养液中雌激素含量变化趋势图。
40.图7附图为本发明提供的有无活性vd3培养基中孕激素含量变化趋势图。
具体实施方式
41.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.本发明实施例公开了一种体外培养鸡小黄卵泡的方法。
43.实施例中，未提及的实验材料均为常规市售材料，未提及的实验方法为常规实验方法，例如，青霉素-链霉素溶液(双抗)；gibco，批号：15140-122
44.dmem培养基；gibco，批号：c11995500bt
45.its液体培养基补充剂(100x)；sigma批号：i3146
46.胎牛血清fbs(fetalbovineserum)；gibco，批号10099-133
47.pet细胞培养小室；labselect；批号：14341
48.活性vd3(粉末)(calcitriol)；mce；批号：hy-10002
49.5-溴脱氧尿嘧啶核苷：brdu；mce，批号：hy-15910
50.通用型组织固定液：博尔夫生物；批号b0038
51.肌肉固定液：博尔夫生物；批号：b0007
52.(无菌)pbs：nacl16g，na2hpo412h2o5.8g，kcl0.2g，kh2po40.48g；调整ph为7.2并定容至2l，无菌过滤后进行高压灭菌，灭菌后的pbs加入1％青霉素-链霉素溶液(试验使用的pbs皆添加1％双抗)；
53.解剖培养基：在无菌条件下将dmem培养基分装到50ml离心管中，加入1％青霉素-链霉素溶液(在4℃冰箱保存用于分离后小黄卵泡的转运，取样后将装有培养基和卵泡的离心管置于冰盒中带到细胞房)；
54.活性vd3工作液体：将保存在-80
°
冰箱的10mg活性vd3粉末，在避光条件下加入无水乙醇配成10mm的活性vd3母液，根据需要将母液稀释(0～1000nm)作为工作液备用，母液置于-20
°
保存一个月，-80
°
冰箱保存6个月；
55.生长培养基：取5ml无菌的fbs，加入1ml青霉素-链霉素溶液和1ml的its培养基补充剂，再加入93mldmem基础培养基和10μl活性vd3母液，配制成1000nm活性vd3的培养基，培养基要现配现用；
56.小黄卵泡来源，取离体小黄卵泡或采用下列方法制备：
57.1)选择产蛋周期规律的海兰褐蛋鸡(35～45周龄)颈静脉放血致死，迅速剖开腹腔取下整个完整的卵巢，无菌条件下用预冷的pbs漂洗表面血污(尽量取出卵泡表面的血液和油脂)，根据卵泡直径大小摘取6～8mm小黄卵泡置于50ml无菌的离心管中，用解剖培养基(含有1％双抗的dmem培养基)暂时保存。
58.2)将卵泡放到冰盒中带到细胞房，转移到灭菌超过30分钟的超净台上进行操作。在培养皿中用预冷的无菌pbs将小黄卵泡漂洗3～5次，对肉眼可见的血污可以用无菌的尖
头细胞镊子夹住卵泡与卵巢基质连接的一端，用另一把镊子轻轻刮掉卵泡表面的血污，漂洗期间轻轻十字晃动培养皿尽可能的漂洗干净卵泡表面血污，最后用眼科剪剪掉卵泡上多余的结缔组织，全程动作轻柔保持卵泡的结构完整性。
59.苏木精-伊红(h-e)染：
60.1)石蜡切片的制备：培养结束后取小黄卵泡置于通用型组织固定液中固定24h，再更换成肌肉固定液固定24h。随后按常规方法进行洗涤脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(选取卵泡最大面)和烤片。
61.2)苏木精-伊红(h-e)染：按常规方法对切片进行脱蜡、浸水、染核、分、蓝化、质染、脱水、透明和封片。
62.实施例1
63.一种体外培养鸡小黄卵泡的方法
64.1)将配制好的生长培养基置于37℃水浴锅进行提前预热，挑选结构完整表面无血污的小黄卵泡从培养皿中分离出来(参见图2)，转移到24孔0.45μm的pet细胞培养小室上层(pet细胞小室各孔间隙加入湿度平衡液，湿度平衡液：20μl灭菌的pbs)，每个孔放1枚小黄卵泡，并加入1ml预热(37℃水浴锅进行预热40min)的生长培养基(含有1％青霉素-链霉素溶液，1％its培养基补充液，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培养基)(图3a、b)。将所有培养物全部转移到38.5℃，5％co2的细胞培养箱中培养72小时，每24小时更换一次生长培养基(更换时，收集替换下的生长培养基用于雌激素和孕激素含量的测定)，间隔12小时观察卵泡生长情况和培养基消耗情况，并进行晃动(十字晃动：频率为20～30次每分钟，摇晃10次)来模拟体内的动态环境。
65.2)每次换液(生长培养基)时用无菌的1.5mlep管收集卵泡培养基用于雌激素和孕激素含量的测定，并在培养的第48小时向生长培养基中加入20μg/ml的brdu来检测小黄卵泡在体外培养环境中的增殖情况。
66.操作要求(重点)
67.1)全程需要无菌操作。
68.2)卵泡分离和转移控制在40～60分钟内(4～6只母鸡卵巢)。
69.3)卵泡每次拿出培养箱不超过10分钟。
70.4)每间隔24小时更换一次培养基，间隔12小时进行一次晃动。
71.5)培养箱温度38.5℃，5％co2条件进行培养。
72.技术效果：
73.小黄卵泡的存活和生长
74.挑选出形态正常结构完整且洁净直径在6～8毫米之间的卵泡，进行体外培养72小时。体外培养过程中小黄卵泡能维持正常的形态(图4)，通过brdu检测了小黄卵泡的体外增殖，相同条件下添加1000nm活性vd3工作液体促进了体外卵泡的增殖(图5)，成功的实现了小黄卵泡在体外培养环境中的存活和生长。24、48和72小时检测培养液中卵泡合成的主要功能产物雌激素与孕激素的浓度变化，相同条件下添加1000nm活性vd3的培养基能显著提高雌激素和孕激素的含量，并随着时间的增加表现出明显的促进作用(图6和图7)。
75.此外，本发明多次重复实验，试验的结果是成功的，实现了发明的目的。
76.本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他
实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
77.对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
技术特征：
1.一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将筛选后的小黄卵泡转移到pet细胞培养小室上层，并加入预热的生长培养基，得培养物；2)将培养物转移到38.5℃，5％co2的环境下培养。2.如权利要求1所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，步骤1)所述筛选的标准：结构完整表面无血污，直径6～8mm；所述pet细胞培养小室：24孔0.45μm，每个孔放1枚小黄卵泡；所述预热：37℃水浴锅进行预热40min，所述生长培养基的加入量：每孔1ml。3.如权利要求2所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，所述pet细胞小室各孔间隙加入湿度平衡液，所述湿度平衡液：20μl灭菌的pbs。4.如权利要求3所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，所述生长培养基：含有1％青霉素-链霉素溶液，1％its液体培养基补充剂，5％胎牛血清fbs和1000nm活性vd3的dmem培养基。5.如权利要求4所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，步骤2)所述培养的时间：72h。6.如权利要求5所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，步骤2)每24小时更换一次生长培养基，更换时，收集替换下的生长培养基用于雌激素和孕激素含量的测定。7.如权利要求6所述的一种体外培养鸡小黄卵泡的方法，其特征在于，步骤2)每间隔12小时观察卵泡生长情况和培养基消耗情况，并进行十字晃动，所述十字晃动：频率为20～30次每分钟，摇晃10次。8.权利要求1～7任一所述的方法在和颗粒细胞或者膜细胞共培养中的应用。9.权利要求1～7任一所述的方法培养的鸡小黄卵泡。
技术总结
本发明公开了一种体外培养鸡小黄卵泡的方法。涉及家禽卵泡体外培养技术领域。包括将筛选后的小黄卵泡转移到PET细胞培养小室上层，并加入预热好的生长培养基，得培养物；将培养物转移到38.5℃，5％CO2的环境下培养。本发明采用PET细胞小室进行体外卵泡培养，进一步模拟体内环境在体外给予卵泡支撑功能；卵泡在38.5℃，5％CO2的培养箱中培养更接近于鸡体内的温度，模拟真实情况；在DMEM培养基中添加活性VD3，调控体外培养系统类固醇的代谢，促进卵泡的增殖和存活。泡的增殖和存活。泡的增殖和存活。
