ACE2改造蛋白及其应用
ace2改造蛋白及其应用
技术领域：
1.本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及针对新型冠状病毒具有中和效果的类抗体蛋白技术领域。
背景技术：
2.新冠肺炎疫情(covid-19)对人类健康和全球公共卫生安全造成重大威胁，其病原体为sars-cov-2，是21世纪以来引起人类传染病疫情的第三种冠状病毒。目前，虽然已有多种针对sars-cov-2的疫苗和单克隆抗体药物获得紧急使用许可，但是多数研究表明它们对当下广泛传播的新冠病毒变异毒株(如英国株n501y.v1、南非株n501y.v2和巴西株n501y.v3等)的保护效果降低。此外，大量研究数据表明蝙蝠等动物携带多种新冠相关冠状病毒或sars样冠状病毒，如蝙蝠源ratg13及穿山甲源gx/p2v/2017和gd/1/2019，目前的研究结果显示这三种病毒也可以利用血管紧张素转化酶2(ace2)作为受体，提示它们存在感染人的潜力，因而亟需研发针对当下新冠变异毒株及未来可能出现的新的sars样冠状病毒疫情的广谱药物或疫苗，这不仅是当前covid-19疫情下，国家乃至全球的重大需求，也是关系到全球人类健康(one health)的重要举措。
3.ace2属于肾素-血管紧张素系统成员，通过调节血压及电解质的平衡维持心血管、肾脏及呼吸系统的功能，此外作为sars-cov、sars-cov-2等病毒的受体介导病毒入侵。研究发现，外源性ace2重组蛋白(race2)可与内源性ace2竞争结合sars-cov和sars-cov-2，进而抑制病毒感染。临床试验发现race2在健康人和严重呼吸窘迫综合症患者(ards)身上是安全的。这些研究结果表明，对于以ace2为受体的冠状病毒而言，race2是一种潜在的大分子药物，因而设计开发高效race2具有潜在的临床应用价值。目前，虽有多款race2被报道用于抑制sars-cov、sars-cov-2感染，其中两款进入临床前准备阶段，一款进入临床ⅱ期，但是它们对当下流行的新冠变异毒株的效果是未知的。
技术实现要素：
4.有鉴于此，本发明提供了一种ace2改造蛋白在制备和/或预防以ace2为受体的sars样冠状病毒引发疾病的药物中的应用或在制备预防以ace2为受体的sars样冠状病毒感染的疫苗中的应用。
5.在本发明的一些具体实施方案中，所述以ace2为受体的sars样冠状病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株和/或新冠相关冠状病毒等。
6.在本发明的一些具体实施方案中，所述的改造蛋白为hace2-hfc-m4-1改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.5所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.6所示。
7.在本发明的一些具体实施方案中，所述的改造蛋白为hace2-hfc-m4-2改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.7所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.8所示。
8.在本发明的一些具体实施方案中，所述的改造蛋白为hace2-hfc-m5改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.9所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.10所示。
9.在本发明的一些具体实施方案中，所述的sars-cov-2原始毒株为sars-cov-2wt。
10.在本发明的一些具体实施方案中，所述的sars-cov-2变异毒株为英国株n501y.v1、南非株n501y.v2或巴西株n501y.v3。
11.在本发明的一些具体实施方案中，所述的sars-cov-2变异毒株为水貂流行株y453f、水貂流行株f486l或水貂流行株n501t。
12.本发明的hace2改造片段与hfc的改造蛋白为类抗体蛋白，能够用于由新冠病毒原始毒株及变异毒株引起的疾病，可以广泛应用于由以ace2为受体的新冠相关冠状病毒或sars样冠状病毒引起的疾病。
附图说明
13.图1.sars-cov-2rbd与人ace2复合物结构图。
具体实施方式
14.基于此，发明人设计并筛选出了高效人ace2重组蛋白，具有广谱中和sars-cov-2原始毒株及多种变异毒株的能力，同时排除了因ace2自身的酶活效应带来的副作用，表明其可作为针对现有的或未来出现的新的新冠病毒变异毒株及将来可能出现的新的sars样冠状病毒的一种潜在广谱大分子药物。
15.首先，根据sars-cov-2刺突蛋白受体结合区域(rbd)和人ace2(hace2)复合物结构(图1)，发现ace2上参与rbd相互作用的氨基酸多为疏水性或带电氨基酸，因而发明人选取了一系列位点进行突变，以增强其疏水性或电性，同时，将其与人igg1的fc段(hfc)融合表达，最终形成一系列hace2-hfc突变体。然后，通过测定这些hace2-hfc突变体与sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)rbd的亲和力，筛选出亲和力增强的hace2-hfc突变体，再将这些突变体进行组合，最终形成具有更强亲和力的组合突变体，包括t27f、k31y、l79w和n330y这四个位点。
16.此外，由于ace2在调节血压及电解质的平衡中发挥着重要作用，为了排除过多的外源性ace2蛋白可能导致的血压过度调节等副作用，根据文献报道，又将控制酶活性的关键氨基酸r273进行突变(r273q)，以破坏其酶活功能，但不影响结合sars-cov-2，下文称为hace2-hfc-m4-1(包括t27f、k31y、n330y和r273q四个突变位点)、hace2-hfc-m4-2(包括t27f、l79w、n330y和r273q四个突变位点)和hace2-hfc-m5(包括t27f、k31y、l79w、n330y和r273q五个突变位点)，它们的编码序列及氨基酸序列分别为seq id no.5-10。
17.表达纯化获得hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5蛋白后，通过测定其与新冠病毒原始毒株及多种变异毒株rbd的亲和力，其中变异毒株包括英国株n501y.v1、南非株n501y.v2、巴西株n501y.v3及三种水貂流行株y453f、f486l和n501t株，相比于野生型hace2-hfc(hace2-hfc-wt)，发现hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2结合新冠病毒原始毒株及变异毒株rbd的能力均增强(表1)，并且二者结合sars-cov-2wt和水貂流行株y453f株的能力相似，结合其他变异毒株的能力存在一定的差异，因而发明人又将hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2进行组合，形成hace2-hfc-m5。
18.hace2-hfc-m5结合新冠病毒原始毒株及变异毒株rbd是hace2-hfc-wt的3.7～29.5倍，并且略高于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，其结合变异毒株(水貂流行株
y486l株除外)的能力高于sars-cov-2wt(表1)。
19.相比于hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2中和sars-cov-2原始毒株及变异毒株假病毒的能力均明显提高，分别提高8.3～104.1倍和6.5～44.6倍，尤其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3最为明显(表2)。hace2-hfc-m5中和新冠病毒原始毒株及变异毒株假病毒是hace2-hfc-wt的8.7～126倍，整体上高于或相似于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，尤其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3的能力进一步提高(表2)，这与亲和力的结果是相符的。
20.当新冠病毒侵染人体细胞时，本发明的hace2改造蛋白优先识别并结合病毒，再加上融合了人igg1 fc段，从而形成了hace2-hfc类抗体蛋白，进一步降低了半衰期，延长了中和病毒的能力。
21.本发明的三种hace2改造片段的hfc融合蛋白特别适用于对新冠病毒突变株，例如英国株、巴西株、南非株及水貂流行株的或预防，推测对以ace2为受体的新冠相关冠状病毒或sars样冠状病毒及未来出现的新的变异毒株也有作用，具有潜在的广泛应用价值。
22.本发明的hace2改造蛋白可以通过本领域常规使用的方法得到。首先，将野生型hace2氨基酸编码序列与hfc编码序列无缝连接构建至pcaggs表达载体上，形成pcaggs-hace2-hfc，然后在此基础上进行氨基酸位点定点突变，进而得到hace2改造蛋白的表达质粒，pcaggs-hace2-hfc-m4-1，pcaggs-hace2-hfc-m4-2，pcaggs-hace2-hfc-m5。
23.实施例1
24.hace2-hfc改造蛋白的获得
25.首先，将编码野生型hace2蛋白的基因序列(序列如序列表seq id no.1所示)与编码人igg1 fc段蛋白基因(序列如序列表seq id no.2所示)连接，将得到的序列人工合成(由苏州金唯智提供合成服务)，得到野生型hace2-hfc融合蛋白基因(序列如序列表seq id no.3)，并将该融合蛋白基因克隆到pcaggs真核细胞表达载体上，得到野生型hace2-hfc融合蛋白的表达载体pcaggs-hace2-hfc，再通过氨基酸定点突变的方法将第27位氨基酸t突变成氨基酸f，第31位氨基酸k突变成氨基酸y，第79位氨基酸l突变成氨基酸w，第330位氨基酸n突变成氨基酸y，第273位氨基酸r突变成氨基酸q，得到pcaggs-hace2-hfc-m4-1载体(包含突变位点t27f、k31y、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.5所示)、pcaggs-hace2-hfc-m4-2载体(包含突变位点t27f、l79w、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.7所示)、pcaggs-hace2-hfc-m5载体(包含突变位点t27f、k31y、l79w、n330y和r273q，基因序列如序列表seq id no.9所示)。
26.使用pcaggs-hace2-hfc载体和pcaggs-hace2-hfc-m4-1，pcaggs-hace2-hfc-m4-2，pcaggs-hace2-hfc-m5载体表达并纯化，分别得到了hace2-hfc-wt融合蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.4所示)，hace2-hfc-m4-1改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.6所示)，hace2-hfc-m4-2改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.8所示)，hace2-hfc-m5改造蛋白(氨基酸序列如序列表seq id no.10所示)。
27.氨基酸定点突变的方法：
28.通过设计引物将野生型hace2基因特定位点氨基酸突变成目标氨基酸，然后经pcr扩增出突变后的目的片段，然后目的片段与线性化的载体pcaggs进行同源重组，最终形成含有目的片段的环状载体，并经序列测序正确后，方可用于后续目的蛋白的表达。
29.突变位点包括：将第27位氨基酸t密码子(aca)突变为氨基酸f密码子(ttt)，第31位氨基酸k密码子(aag)突变成氨基酸y密码子(tac)，第79位氨基酸l密码子(ctt)突变成氨基酸w密码子(tgg)，第330位氨基酸n密码子(aat)突变成氨基酸y密码子(tat)，第273位氨基酸r密码子(aga)突变成氨基酸q密码子(cag)。
30.表达纯化的方法：
31.将重组好的目的质粒转染至hek293f细胞中，细胞密度约为2
×
106/ml。转染后5-7天收集细胞上清，离心过滤，经蠕动泵将含有hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1，hace2-hfc-m4-2，hace2-hfc-m5改造蛋白的细胞上清在4℃环境下经过protein a亲和层析柱，使改造蛋白与亲和层析柱充分结合。用结合缓冲液(20mm na3hpo4，ph8.0)洗脱杂蛋白，用洗脱液(0.1m glycine，ph3.0)洗脱改造蛋白，蛋白收集管里预先加入1m tris-hcl(ph9.0)缓冲液，防止蛋白在过酸的环境下失活，最后经分子筛将蛋白换液至pbs缓冲液中。
32.实施例2
33.hace2改造蛋白与新冠病毒突变株的rbd的亲和力
34.发明人利用表面等离子共振技术(spr)，检测了sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)及变异毒株(英国株501y.v1、南非株501y.v2、巴西株501y.v3、水貂流行453f株、水貂流行486l株、水貂流行n501t株)的rbd分别与hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白的亲和力。
35.仪器与材料：
36.rbd蛋白：sars-cov-2原始毒株、英国株501y.v1、南非株501y.v2、巴西株501y.v3、水貂流行y453f株、水貂流行f486l株、水貂流行n501t株的rbd蛋白均由申请人实验室表达纯化。
37.设备：biacore 8k，cm5芯片(ge healthcare)
38.具体实验步骤如下：
39.a.芯片预处理：将识别human igg1 fc的二抗利用氨基偶联的方式固定在cm5芯片表面。cm5芯片共有8个通道，每个通道中包含两个flow cell(fc 1和2)，fc 2注射流动相蛋白样品，fc 1作为对照。
40.b.进样：首先用运行缓冲液(20mm hepes,150mm nacl,0.005％(vol/vol)tween 20,ph 7.4)稀释样品，此实验样品含有不同突变株的rbd。
41.c.芯片再生：用再生缓冲液(10mm glycine,ph 1.5)对芯片进行再生。
42.d.数据分析：用biacore 8k评价软件对数据进行分析，得出结合常数ka，解离常数kd及平衡解离常数kd。
43.表1.ace2改造蛋白与野生型蛋白亲和力对比数据表
44.[0045][0046]
结果显示，与野生型hace2-hfc(hace2-hfc-wt)相比，发现三种hace2改造蛋白(hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5)结合新冠病毒原始毒株及变异毒株rbd的能力均增强，尤其是hace2-hfc-m5提高最为显著。
[0047]
实施例3
[0048]
hace2-hfc改造蛋白的中和作用
[0049]
测定了hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白在vero e6细胞中对sars-cov-2原始毒株(sars-cov-2wt)及变异毒株(包括英国株n501y.v1、南非株n501y.v2、巴西株n501y.v3及水貂流行株y453f、水貂流行株f486l和水貂流行株n501t)假病毒的中和效果。
[0050]
设置了vero e6细胞(细胞阴性对照组)，vero e6细胞+假病毒+培养基(无蛋白的阴性对照)，vero e6细胞+假病毒+hace2-hfc野生型蛋白(hace2-hfc-wt组)、vero e6细胞+假病毒+hace2-hfc-m4-1蛋白(hace2-hfc-m4-1组)、vero e6细胞+假病毒+hace2-hfc-m4-2蛋白(hace2-hfc-m4-2组)、vero e6细胞+假病毒+hace2-hfc-m5蛋白(hace2-hfc-5组)。
[0051]
实验仪器和材料：
[0052]
vero e6细胞(申请人实验室保存)，hace2-hfc-wt蛋白基因(由苏州金唯智合成，其编码序列为seq id no.3)，hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5蛋白序列均为实施例1中得到的，sars-cov-2原始毒株及其变异毒株假病毒由申请人实验室包装获得。
[0053]
蛋白原液配制：分别将hace2-hfc-wt，hace2-hfc-m4-1，hace2-hfc-m4-2，hace2-hfc-m5改造蛋白在超净工作台中经0.22μm无菌滤器过滤，用bca法测定浓度，用含2％fbs的dmem培养基配制成浓度60μg/ml的溶液。
[0054]
改造蛋白的梯度稀释液的配制：用含2％fbs的dmem培养基将各hace2改造蛋白原液进行2倍倍比稀释，共稀释11个梯度，每个梯度8个复孔，每孔50μl。
[0055]
假病毒稀释液：将sars-cov-2原始毒株及变异毒株假病毒液在vero e6细胞上进行定量，将出现1000个ffu时的稀释度作为中和实验时的病毒用量。
[0056]
具体步骤如下：
[0057]
a.提前一天在96孔细胞培养板中铺vero e6细胞，使第二天细胞汇合密度达到80-90％。
[0058]
b.取上述各hace2改造蛋白的梯度稀释液，在各孔中加入等体积(50μl)的上述假
病毒稀释液，混匀后，在37℃孵育1h。
[0059]
c.将96孔细胞培养板上清小心弃去，加入上述蛋白-病毒混合液(100μl/孔)，在培养箱中继续培养15h。
[0060]
b.利用显微镜统计被感染了的细胞数，计算各浓度下的抑制率，再利用graphpad计算出ic
50
。
[0061]
表2.ace2改造蛋白与野生型蛋白中和活性对比数据表
[0062][0063]
结果显示，相比于hace2-hfc-wt，三种hace2改造蛋白(hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2和hace2-hfc-m5)中和sars-cov-2原始毒株及变异毒株假病毒的能力均明显提高，尤其对原始毒株、南非株501y.v2、巴西株501y.v3和水貂流行株f486l株提高的较为显著。
[0064]
从整体上看，hace2-hfc-m5的中和活性高于或相似于hace2-hfc-m4-1和hace2-hfc-m4-2，但是其中和南非株501y.v2和巴西株501y.v3的能力进一步提高，这与亲和力的结果也是相符的。
[0065]
实施例4
[0066]
hace2-hfc改造蛋白在小鼠模型上的保护作用
[0067]
将hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白注入小鼠模型体内，通过测定小鼠肺内病毒载量和肺组织he染评价ace2改造蛋白新冠病毒感染情况。
[0068]
设置病毒+pbs组(阴性对照组)，病毒+hace2-hfc-wt蛋白(hace2-hfc-wt组)，病毒+hace2-hfc-m4-1蛋白(hace2-hfc-m4-1组)，病毒+hace2-hfc-m4-2蛋白(hace2-hfc-m4-2组)，病毒+hace2-hfc-m5蛋白(hace2-hfc-m5组)。
[0069]
实验材料：
[0070]
新冠病毒活病毒(中国科学院微生物所p3实验室)，balb/c小鼠(购自维通利华实验动物公司)，hace2-hfc-wt、hace2-hfc-m4-1、hace2-hfc-m4-2、hace2-hfc-m5改造蛋白为实施例1中得到。
[0071]
设备条件：中国科学院微生物所p3实验室
[0072]
实验步骤如下：
[0073]
a.注射新冠病毒：将5
×
105tcid
50
新冠病毒通过滴鼻感染的方式注入小鼠体内，每组5只。
[0074]
b.注射ace2改造蛋白：在攻毒后的第二天，将ace2改造蛋白按10mg/kg剂量通过腹腔注射方式注入小鼠体内。
[0075]
c.组织检测：在攻毒后的第五天，取小鼠肺组织，其中每组中的3只用于提取病毒rna，测病毒载量，另外两只用于做组织切片，he染。
[0076]
d.数据分析：根据肺组织中病毒载量和he染结果，判定ace2改造蛋白保护小鼠抵抗新冠病毒感染情况。
[0077]
本发明的hace2改造片段与hfc的融合蛋白为类抗体蛋白，能够广泛用于由新冠病毒原始毒株及变异毒株引起的疾病，可用于由以ace2为受体的多数新冠相关冠状病毒或sars样冠状病毒引起的疾病。
[0078]
本发明的hace2改造片段与hfc的融合蛋白特别适用于对新冠病毒变异毒株的或预防，例如英国株、巴西株、南非株以及水貂流行株等，也可以广泛用于临床、流行病学调查及相应药物或疫苗的制备。
技术特征：
1.ace2改造蛋白在制备和/或预防以ace2为受体的sars样冠状病毒引发疾病的药物中的应用或在制备预防以ace2为受体的sars样冠状病毒感染的疫苗中的应用。2.依据权利要求1所述的ace2改造蛋白，其特征在于，所述以ace2为受体的sars样冠状病毒为sars-cov-2原始毒株和/或sars-cov-2变异毒株和/或新冠相关冠状病毒等。3.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白为hace2-hfc-m4-1改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.5所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.6所示。4.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白为hace2-hfc-m4-2改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.7所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.8所示。5.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的ace2改造蛋白为hace2-hfc-m5改造蛋白，其基因序列如序列列表seq id no.9所示或氨基酸序列如序列列表seq id no.10所示。6.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2原始毒株为sars-cov-2wt。7.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2变异毒株为英国株n501y.v1、南非株n501y.v2或巴西株n501y.v3等变异毒株。8.依据权利要求1或2的ace2改造蛋白，其特征在于，所述的sars-cov-2变异毒株为水貂流行株y453f、水貂流行株f486l或水貂流行株n501t。
技术总结
本发明涉及基因工程技术领域。本发明提供一种ACE2改造蛋白在制备和/或预防以ACE2为受体的SARS样冠状病毒引发疾病的药物中的应用或在制备预防以ACE2为受体的SARS样冠状病毒感染的疫苗中的应用。本发明的hACE2改造片段与hFc的改造蛋白为类抗体蛋白，能够广泛用于由新冠病毒原始毒株及变异毒株引起的疾病，预期可以由以ACE2为受体的新冠相关冠状病毒或SARS样冠状病毒引起的疾病。关冠状病毒或SARS样冠状病毒引起的疾病。关冠状病毒或SARS样冠状病毒引起的疾病。
