表面等离子共振（物理技术）

表面等离子共振（物理技术）

表面等离子共振 （物理技术） 次浏览 | 2022.07.14 09:27:40 更新 来源 ：互联网 精选百科 本文由作者推荐 表面等离子共振物理技术

表面等离子共振技术，英文简写SPR，是从20世纪90年代发展起来的一种新技术，其应用SPR原理检测生物传感芯片（bionsor chip）上配位体与分析物之间的相互作用情况，广泛应用于各个领域。

中文名

表面等离子共振

外文名

Surface Plasmon Resonance

性 质

物理技术

缩 写

SPR

背景简介

1902年，Wood在一次光学实验中，首次发现了SPR现象并对其做了简单的记录，但直到39年后的1941年，一位名叫Fano的科学家才真正解释了SPR现象。之后的30年间，SPR技术并没有实质的发展，也没能投入到实际应用中去。1971年Kretschmann为SPR传感器结构奠定了基础，也拉开了应用SPR技术进行实验的序幕。1983年，Liedberg首次将SPR用于IgG与其抗原的反应测定并取得了成功。1987年，Knoll等人开始研究SPR的成像。到了1990年，Biacore AB公司开发出了首台商品化SPR仪器，为SPR技术更加广泛的应用开启了新的乐章。简言之，SPR是用来进行实时分析，简单快捷的监测DNA与蛋白质之间、蛋白质与蛋白质之间、药物与蛋白质之间、核酸与核酸之间、抗原与抗体之间、受体与配体之间等等生物分子之间的相互作用。SPR在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测以及法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。

原理介绍

消逝波

全反射

根据法国物理学家菲涅尔所提出的光学定理：  可知，当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。（图1）当以波动光学的角度 来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝波。

等离子波

等离子体通常指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等。把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，这实际上也是一种等离子体。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子波。

SPR光学原理

SPR 技术示意图

我们在前面提到光在棱镜与金属膜表面上发生全反射现象时，会形成消逝波进入到光疏介质中，而在介质（假设为金属介质）中又存在一定的等离子波。当两波相遇时可能会发生共振。当消逝波与表面等离子波发生共振时，检测到的反射光强会大幅度地减弱。能量从光子转移到表面等离子，入射光的大部分能量被表面等离子波吸收，使反射光的能量急剧减少。

可以从左侧的反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此时对应的入射光波长为共振波长，对应的入射角θ为SPR角。电子吸收光能量，从而使反射光强在一定角度时大大减弱，其中是反射光完全消失的角就是SPR角。SPR角随金表面折射率变化而变化，而折射率的变化又与金表面结合的分子质量成正比。因此可以通过对生物反应过程中SPR角的动态变化获取生物分子之间相互作用的特异信号。

生物分子相互作用分析基于SPR原理

生物分子相互作用分析是基于SPR原理的新型生物传感分析技术，无须进行标记，也可以无须纯化各种生物组分。在天然条件下通过传感器芯片实时、原位和动态测量各种生物分子如多肽、蛋白质、寡核苷酸、寡聚糖，以及病毒、细菌、细胞、小分子化合物之间的相互作用过程。表面等离子共振是表面增强拉曼的重要增强机理之一，由于贵金属纳米粒子的尺寸效应及量子效应通过激发光照射能引起表面等离子共振，从而大大增强拉曼散射信号，已达到痕量检测的目的。

应用操作

综合运用

表面等离子共振广泛应用于研究结合特异性、抗体选择、抗体质控、疾病机制、药物发明、生物治疗、生物处理、生物标记物、配体垂钓、基因调控、细胞信号传导、亲和层析、结构-功能关系、小分子间相互作用等。

检测原理

表面等离子共振（SPR）是一种光学现象，可被用来实时跟踪在天然状态下生物分子间的相互作用。这种方法对生物分子无任何损伤，且不需任何标记物。

先将一种生物分子（靶分子）键合在生物传感器表面，再将含有另一种能与靶分子产生相互作用的生物分子（分析物）的溶液注入并流经生物传感器表面。生物分子间的结合引起生物传感器表面质量的增加，导致折射指数按同样的比例增强，生物分子间反应的变化即被观察到。这种反应用反应单位（RU）来衡量：1 RU = 1pg 蛋白/mm2 = 1 x 10-6 RIU（折射指数单位）。

分析物在被注入的过程中，由对流和扩散流经相互作用表面而与靶分子形成复合物，导致分析物浓度改变。微射流系统内nL数量级流动通道的应用，使得这种浓度的改变降至最低点，以确保高传质系数（Mass Transport Coefficient，km）。为保证分析物的传质性不被限制，键合在生物传感器表面的靶分子浓度必须较低。当分析物被注入时，分析物-靶分子复合物在生物传感器表面形成，导致反应增强。而当分析物被注入完毕后，分析物-靶分子复合物解离，导致反应减弱。通过结合式相互作用模型拟合这种反应曲线，动力学常数便可被确定。而非特异性结合和总折射指数移相等效应则可通过参照曲线减除功能予以驱除。

相关商业化系统

表面等离子共振已经在商业化的检测仪器中应用。目前最广泛使用的是Biacore Life Sciences公司生产的Biacore系列。Biacore Life Sciences现已被General Electric收购。其它表面等离子共振的商业仪器还有例如ICx的SensiQ等。

SensiQ的SPR生物传感器运用了Texas Instruments公司研发的光学传感器设计，以及Kretschmann SPR几何学构建，灵敏度高，光学静稳。生物传感器一次性使用，其羧基化表面适合于多种优化键合方案。生物传感器的安装快捷，几秒钟便可完成，使用也非常简便。功能化的生物传感器即便在储存一段时间后仍可继续使用。

SensiQ的双通道nL数量级的流动池设计，利于实时的参照曲线减除，并保证分析物在生物传感器的相互作用表面具有高传质性（Mass Transport）。

表面等离子共振仪器结构及工作原理

表面等离子共振仪核心部件包括光学系统、传感器芯片、液体处理系统三个主要部分，其他的组成部分包括LED状态指示器及温度控制系统等。

光学系统

能够产生和测量SPR信号的光电组分称为光学检测单元。

传感器芯片

传感器的芯片是其最为核心的部件。在SPR技术中必须首先有一个生物分子偶联在传感片上，然后用它去捕获可与之进行特异反应的生物分子。

传感芯片又分为三个主要组成部分，分别是光波导耦合器件、金属膜以及分子敏感膜。

液体处理系统

液体处理系统包括两个液体传送泵，其中一个泵负责保持稳定流速的液体流过传感芯片表面，另一个泵负责自动自动进样装置中的样品传送。

其他部分

包括例如LED状态指示器和温度控制系统等。

实验设计

原料

亲和分子对包括：

蛋白质–蛋白质（Protein–Protein）

多肽–受体（Peptide–Receptor）

抗体–抗原（Antibody–Antigen）

膜受体–配体（Membrane Receptor–Ligand）

凝集素–聚糖/糖蛋白（Lectin–Polysacharride/Glycoprotein）

蛋白质–小分子（Protein–Small Molecule）

蛋白质–核酸（Protein–Nucleic Acid）

细胞–配体（Cell–Ligand）

调和方法

任何一对亲和分子，一个（靶分子）被键合在生物传感器表面，另一个（分析物）被置于溶液中。当含有分析物的溶液流经靶分子键合的生物传感器表面时，亲和性复合物生成。

SensiQ配备双通道流动注射分析式微射流系统，内有85nL流动池。SensiQ使用一次性的SPR生物传感器，装卸简便。生物传感器表面包被有单层的羧基化寡聚环氧乙烷（Carboxylated Oligoethyleneoxide）基质，可键合多种生物分子，并有效地阻止非特异性结合及变性。靶生物分子的这种既被键合在固相生物传感器表面，又存在于液相中的方式，增进了两种亲和分子间的接触性，同时避免了由于人为因素所造成的动力学分析的复杂化。

SensiQ备有多种键合方案用于改进实验设计，以支持生物分子的附着。最常用的偶联方式是用EDC/NHS进行胺偶联。其它键合方式，例如顺丁烯二酰亚胺-硫醇（Maleimide-thiol），还原胺化，酰肼-醛（Hydrazide-aldehyde），亲和力捕获等，亦可使用。SensiQ双通道检测中的一个通道可用于生成适当的参照曲线。当表面化学物固定好以后，加入最多250 μl的样品，缓冲液流经生物传感器表面时产生稳定的基线。样品注入和计时通过自动化控制完成。通过实验设置向导功能，用户可记录多次注射周期，并具备高重复性。

软件

控制软件

SensiQ的控制软件在原始反应曲线生成时，同时并实时获取和展示两个通道内的数据。参照通道内的数据被减除，以补偿热漂移、非特异性结合、总折射指数移相等效应，从而得到清晰高质的实验数据。控制软件在反应曲线上简单加入报告点，用来确定样品注入后产生的结合反应。报告点的添加可在实验中的任何时候由人工进行，或由程序预设在固定的实验周期之中。列于表格中的所有报告点，连同相关的事件纪录，均有案可查。数据文件被储存后可被控制软件重新打开并编辑。

SensiQ控制软件的简单明了的用户界面，使得实验设计和进行高效省时。实验向导功能简化设置过程，提高实验重复性。

QDATTM分析软件

反应曲线的分析以及其后的动力学和亲和性数据测算通常繁琐费时。SensiQ的QDATTM分析软件极大地简化了数据分析过程，为研究人员的动力学和亲和性测定提供了简单、省时、可信的手段。

QDATTM是在Biologic Software公司应用广泛的Clamp and Scrubber架构之上开发的最新一代分析软件，可在几分钟内成功分析采集到的高质量数据。QDATTM的简明友好界面带领用户通过一系列步骤，几秒钟内便完成信息的测算。QDATTM的模型拟合运用数字整合及优化的曲线拟合算法，迅速地估算最佳拟合参数值，确保相互作用模型和数据集的拟合，以测定动力学和亲和性常数，以及浓度分析。QDATTM同时提供了简单残差图和残差标准差，用来定量评估拟合的程度。QDATTM的动力学拟合模型包括准一级结合模型（Pudo-first-order Binding Model）和准一级传质结合模型（Pudo-first-order Binding Model with Mass Transport）。

技术参数

一次性生物传感器

流动池数量2

流动池选择1，或2，或1和2

流动池面积2.2 mm2

流动池容积85 nL（高传质率）

样品加入手动（注射器）

样品注入自动电脑控制人工电脑控制

样品双通道同时注入

样品注入体积10–250 μL

样品注射泵内置式外接式

样品流动速率5–150 μL /分自定（< 250 μL /分）

内部死体积< 1.5 μL

实时参照曲线减除

折射指数范围1.32–1.401.33–1.40

短期背景噪音< 0.25 RU< 1 RU

长期背景噪音< 0.30 RU/分（当环境变化 < 3°C /小时）

温度控制15–40°C室温

尺寸（W x H x D）35.0 x 34.2 x 38.8 cm22.9 x 15.2 x 27.9 cm

重量15.9 kg3.6 kg

电源100–240 V，50/60 Hz

工作范围

分子量低限< 200 Da< 250 Da

ka（结合速率常数） 1 x 107 M–1s–1

kd（解离速率常数）10–6–10–1 s–1

KD（kd / ka）10–4–10–10 M

浓度< 10–10–10–3 M

传感化学

胺基偶联固定

（COOH1和COOH2芯片）

由于胺基基团的普遍性，所以通过胺基偶联固定配体适用于绝大部分的生物分子。到目前我们发现这种方法将配体随机固定，通常得到高质量的结果。因此通过没必要直接固定特定位点。

最常用的方法是使用NHS和EDC含水混合物活化羧基产生胺基活性脂。这个流程有以下的几个好处：

无需衍生作用，无需标签，可以固定绝大多数生物分子

产生大量稳定的共价键，以防止配体从表面滤掉

在广泛的pH值中是非常有效的

生物分子无需暴露在恶劣的条件中

很容易控制固定条件，可以防止与表面过度交叉连锁

化学试剂制备，冻存数月

亲和力捕获表面组氨酸标签蛋白

(HisCap和HisHiCap芯片)

ICx Nomadics公司的HisCap芯片使聚组氨酸标签蛋白的固定稳定、可逆，也让表面等离子共振（SPR）实验更加简单。连有固定蛋白的基线非常稳定，可以做动力学分析实验。

HisCap芯片：

提供一个直接固定His-tagged蛋白的最便利的手段。

也可以适用于任何带有足够数量的组氨酸残基的蛋白。

HisCap芯片采用Hoffman-LaRoche研发建立的NTA-Ni技术来附着蛋白质。在这种技术中,感兴趣蛋白质的组氨酸的侧链咪唑与表面附着的NTA-Ni复合物共协作，如图所示。只要蛋白质有足够的组氨酸，这种技术就非常有效。典型的组氨酸标签是6个组氨酸，但是3个也可以。

HisCap芯片优势：

在实验室的重组蛋白工作中，His-tagging是一个长期建立的标准技术。

利用HisCap芯片捕获His-tagged蛋白产生稳定的基线。

在温和的条件,可以再生芯片。例如EDTA或者咪唑。

可重复使用HisCap芯片。

囊泡捕获膜受体相互作用

(VesCap芯片)

利用ICX囊泡捕获（VesCap）芯片可以研究分子与细胞膜、脂质体的相互作用，进行实时、无标记的实验。在VesCap芯片中，脂双层好像在自然细胞环境中，自身构造中的各种细胞膜组分可以在细胞膜真实模型中自由混合。我们还不能确认囊泡溶入单膜双层，但是这在二维表面是极其可能。

一个好的实验模型应包含药物、毒素以及在细胞信号中所涉及的周边膜关联蛋白质

膜蛋白和伴生蛋白只在真实的细胞膜中相互作用

可以固定着床在脂质体的受体/配体

VesCap芯片性质：

脂双层和膜蛋白的自身结构依保持不变。在传感器表面的囊泡捕获是非共价的，允许任意方向上的膜组分自由融合。

PEG-正葵胺层展示出一个简单的二维相互作用平面。

附着在表面的囊泡、脂类体的制备很简单。

VesCap化学特别适合一个过度表达表面受体的细胞系

VesCap芯片的再生很简单。表面活化剂和溶剂的组合清除VesCap芯片表面所有的囊泡，从而再生VesCap芯片。

亲和素-生物素固定

(BioCap和AvCap芯片)

通过亲和素-生物素为基础的方法固定生物分子，操作简单、效果出色,在今天仍然广受研究人员的欢迎。利用了这个技术，BioCap芯片和AvCap芯片可靠固定配体。示意图如下描绘了这两种固定方法。主要优势在于:

不依赖于蛋白质的等电点

只需要少量配体

可商业获取，广泛的生物素试剂

生物素试剂盒操作简单

固定只需要简单的注射

当所需的Rmax达到时，停止注射可以精确的控制固定结合物的浓度

相对于COOH芯片，表面具有很低的静电电荷

一个生物素反应通常产生足够产物，可以无限量的固定。

SPR技术特点

SPR 光学生物传感器经过 20 年来的发展 , 已经成为生命科学和制药领域的一种重要的研究工具。与传统的相互作用技术如超速离心，荧光法，热量测定法等相比，SPR生物传感器具有如下显著特点：

• 实时检测,能动态地监测生物分子相互作用的全过程
• 无需标记样品，保持了分子活性
• 样品需要极少，一般一个表面仅需要1毫克蛋白
• 检测过程方便快捷，灵敏度高
• 应用范围非常广泛
• 高通量，高质量的分析数据
• 能跟踪监控固定的配体的稳定性
• 对复合物的定量测定不干扰反应的平衡
• 大多数情况下,不需要对样品进行处理
• 由于SPR基于对未穿透样品的反射光的测量,所以能在混浊的甚至不透明的样品中进行.然而现有的SPR 传感技术与传统分析手段相比，特别是与免疫检测手段相比，在检测成本、易用性、稳定性、检测效率等方面还存在一些不足。这就决定了该技术今后几年的主要发展趋势。

SPR技术展望

随着 SPR 技术成为分析生物化学、药物研发和食物监控领域中的一个不可缺少的部分 ,SPR 生物传感器的应用将更加趋向多样化 , 特别是它在小分子检测和脂膜领域的新兴应用将使其在未来的药物发现和膜生物学中扮演一个越来越重要的角色。 近几年 , 其发展尤为迅猛 , 随着 SPR 仪器的不断完善和生物分子膜构建能力的不断增强 ,SPR 生物传感器的应用前景极为广阔。

参考资料