硫酸铵分级沉淀的原理【硫酸铵分级沉淀原理及实验方案】

2024年3月15日发(作者：游乐园项目)

硫酸铵分级沉淀的原理【硫酸铵分级沉淀

原理及实验方案】

一，基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用

此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用

方法。乳酸盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏

蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从氢氧化钠中沉淀出来。

各种脂肪酸的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来氢氧化钾

沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表

示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使弯果而应用最为广范。

二，试剂及仪器

1 . 组织培养上清液、血清成品或腹水等

2. 硫酸铵（ NH 4 ） SO 4

3. 饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

4. 蒸馏水

5. PBS( 含 0.2g /L 叠氮钠 )

6. 透析袋

7. 超速离心机

8. pH 计

9. 磁力搅拌器

三，操作步骤

以腹水或组织培养选种上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各

种不同的免疫球蛋白所需硫酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分

离抗体的硫酸铵饱和度为 33% — 50% 。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（ SAS ）

1.将 767g （ NH 4 ） 2 SO 4 边蒸馏边慢慢加到 1 升蒸馏水中。

用氨水或硫酸吴萸到硫酸pH7.0 。此即饱和度为 100% 的硫酸铵溶液

（ 4.1 mol/L, 25 ° C ）.

2.其它不同饱和度铵溶液的酿制

（二）沉淀

1.样品（如腹水） 20 000 ′ g 离心 30 min ，除去细胞碎片；

2.保留上清液并测量体积；

3.烘烤边搅拌边慢慢加入等体积的 SAS 到上清液中，终浓度为

1 ： 1 （

4.将溶液磁力放在磁力搅拌器上所搅拌 6 小时或搅拌过夜（ 4 °

C ），使大分子充分沉淀。

（三）透析

1.蛋白质溶液 10 000 ′ g 离心 30 min （ 4 ° C ）。弃上清

保留沉淀；

2.将沉淀溶于少量（ 10-20ml ） PBS -0.2g /L 叠氮钠中。沉淀

溶解后放入透析袋对

PBS -0.2g /L 叠氮钠透析 24-48 小时（ 4 ° C ），每隔 3-6

小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

3.透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

四，应用提示

（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂受体。

1.边搅拌边慢慢加 SAS 到样品溶液中，使浓度为 0.5:1 (v/v) ；

2.烤箱将溶液放在磁力搅拌器上搅拌 6 小时或过夜（ 4 ° C ）；

3.3000 ′ g 离心 30 min （ 4 °

C ），保留上清液；上清液再加 SAS 到 0.5:1(v/v) ，再次离心

得到沉淀。将沉淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

4.上清液再加 SAS 到 0.5:1 (v/v) ，再次离心得到沉淀。将沉

淀溶于 PBS ，同前透析，除去硫酸氨；

5.杂蛋白与欲纯化氢化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，

用预沉淀硫酸锂蛋白是非常有效

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨成功进行盐析（硫酸氨

用量参阅表 1 ）；硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一

步纯化的抗体。

今天的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，

这一个步骤是有名的烦，要慢慢用敲的把硫酸铵之中高家岭加入蛋白

质溶液中。

相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在

反应物蛋白质溶液中加入硫酸铵，可以会使得蛋白质的溶解度下降，

因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子数也多

(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些氢离

子水合。

蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，片区水分子会在

这些非极性区的表面聚集，形成类似『水笼』的构造(请见下图)，以

便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，后者赚足了大量

水分子，使水笼化学键无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非

极性区之间的吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的即

非极性区域，就越容易用硫酸铵日积月累下来。 在计算所添加的硫酸

铵的重量方面，找到了一个不太好的网站——硫酸铵计算机

这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、熔点想要到达的

百分浓度以及初始的百分浓度这四个数值，就可以得到需要添加的硫

酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算是一个很不错

的网站。

此外另一个比较可资提的，是我有用两种方式加入溴化亚，第一

种是固体的硫酸铵模碎加入，一种另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液就

要加入，各有各的优缺点，比较如下：

1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液

利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不够造成

变质(没试过用倒入的)。不像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度

一快蛋白质就坏了(溶液伽马射线有高能量的白色气泡产生)。

2.操作的容易度：硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵

固体最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所

以当你要溶解的糖类很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液

比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它饱合后，回到操作温度让它

过饱和，接下来用滤纸把硫酸铵结晶去掉。

3.蛋白质溶液的体积放大程度硫酸铵饱和溶液>>固体的硫

酸铵

这是使用饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸

铵平均数从0%到25%，如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100

ml变成107 ml左右，但发烟硫酸若是加入硫酸铵饱和溶液，会让溶液

变成125 ml！而且若是要不断提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶

液，所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。

因此在加入硫酸铵这时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶

液，然而如果是高百分浓度的，除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反

正都要离心离下来)，否则欠佳还是用固体硫酸铵来的不好。