硫酸铵沉淀知识分享

2024年3月15日发(作者：怎么长胸)

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硫酸铵沉淀：

有生物活性的蛋白一般在做硫胺沉淀的时候要小心一点。最保险的做

法是，把硫酸铵配成饱和溶液，把蛋白溶液置于冰浴上，再把饱和硫

胺溶液一滴一滴的加到你的蛋白溶液中，最好边加边搅拌，避免局部

硫胺浓度过高，但搅拌的时候注意不要搅出气泡。按照你的比例加完

之后，最好放冰箱静置至少2h，充分沉淀后离心即可。

4M的硫酸铵pH值为4.6，在这个酸度下可能会有一些蛋白质变性，

要小心。硫酸铵会破坏蛋白质水化层，最好是缓和地加入。边加入边

搅拌，如果在磁力搅拌器上搅拌，小漩涡中心有很多泡沫就表示蛋白

质变性，使得溶液粘度增加，泡沫难破，那就很难保证你的蛋白质有

没有变性了。

溶解度，

在一定温度下，某固态物质在100g溶剂中达到饱和状态时所溶解的质量，

叫做这种物质在这种溶剂中的溶解度。固体物质的溶解度是指在一定的温度

下，某物质在100克溶剂里达到饱和状态时所溶解的克数，用字母s表示，

其单位是“g/100g水”。在未注明的情况下，通常溶解度指的是物质在水

里的溶解度。

溶液饱和度(化学)

某种溶液的饱和度是指在100g该溶液中溶质在溶液中所占质量分数.

一般情况下，一种溶液的饱和度在同一温度下不会变.要想使不饱和溶液

饱和度增加可以选择增加溶质.在刚好有晶体析出的时候就是溶液刚好饱

和的时候.溶液饱和度不会出现100%

加固体比较好，加得越慢越好。 如果加快了，会造成局部浓度过大，

造成意想不到的沉淀。

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硫酸铵沉淀的时候应该要注意pH值的变化，就我的实验来说，一株

产淀粉酶曲霉固态发酵之后用超纯水浸泡离心，得到含有酶的上清液

的pH值为6.5，但是淀粉酶能耐受pH4.5，为了去除更多杂质蛋白质，

我把硫酸铵浓度调节到2摩尔每升的同时会控制pH值为4.5，4度过

夜之后离心取上清液再调节到pH值7.0，4度放置，离心，又去除一

部分杂质蛋白质，上清液直接用pH7.0的疏水层析系统来纯化。

一个纤维素酶的纯化我也用类似的方法，只不过第一步是用4.0。

硫酸铵是酸式盐，2M时pH值约为5，4M时更低，用来沉淀蛋白质的

时候情况就更复杂了，所以最好知道自己需要的蛋白质的耐受情况，

不要搞死了。

透析之前要选用一个不影响自己想要的蛋白质的pH值，硫酸铵沉淀

和透析都要保持一致，才能使损失减少。透析时候产生的沉淀不知道

是不是你想要的蛋白质，不过下次做最好谨慎一点，做我说过的预备

实验。

分段盐析的方法

对分离目的蛋白的盐析，最好采用分段盐析。由于不同的蛋白质其溶

解度与等电点不同，沉淀时所需的pH值与离子强度也不相同，改变盐的

浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开，这种分离蛋

白质的方法称为分段盐析法(fractional saltingout)。如半饱和硫酸铵

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可沉淀血浆球蛋白，饱和硫酸铵则可沉淀包括血浆清蛋白在内的全部蛋白

质。

1. 分段盐析的条件先需要进行小实验探索，如：先进行0%-30%的硫

酸铵沉淀，再进行30%-60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%-80%的硫酸铵沉

淀。

2. 每一段盐析静置之后都将离心取沉淀，透析并检测活性。通过实

验结果可以看出哪一段盐析出来的目的产物最多，相对来说杂质就更少。

3. 比如实验中的活性物质主要在60%-80%这段出来，在以后的实验

中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物可以抛弃（去处大

多数杂质）；然后进行60%-80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀出来是物质是所

需要的目的物质含量比较高的物质，将其收集进行下一步纯化工作。

盐析法：

蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解度随着盐浓度升高而增加（此时称为盐

溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先

后析出，称为蛋白质的盐析。这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷

的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分

子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐

浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，

于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定

浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。

硫酸铵，25度时饱和溶解度为4.1M，即767g/L；0度时饱和溶解度为3.9M，

即676g/L。应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，且缓冲能力比较差。

硫酸铵浓溶液的pH在4.5-5.5之间，当用其他pH值进行盐析时，需用硫

酸或氨水调节。

硫酸铵饱和度计算方法及加入方式：在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，

饱和溶液的饱和度定为100%。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。

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一是当蛋白质溶液体积不大，所需调整的浓度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液；

饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵，加热至50-60度保温数分钟，趁热滤

去沉淀，再在0度或25度下平衡1-2天，有固体析出时即达100%饱和度。盐析

所需饱和度可按下式计算：

今天作的实验是利用硫酸铵沉淀蛋白质，从之前作过的经验知道，这一个步骤是有名的烦，

要慢慢用敲的把硫酸铵缓缓的加入蛋白质溶液中。

相关的原理可以在庄荣辉学习网站中找到，与盐溶刚好相反，在蛋白质溶液中加入硫酸铵，

会使得蛋白质的溶解度下降，因而沉淀出来。因为硫酸铵所解离的离子容很大，所带的电子

数也多(NH4+, SO42-)，因此当其溶入水中时，会吸引大量水分子与这些离子水合。

蛋白质分子表面多少有一些较不具极性的区域，水分子会在这些非极性区的表面聚集，形

成类似『水笼』的构造(请见下图)，以便把蛋白质溶入水中。一旦蛋白质溶液加入硫酸铵，

后者吸引了大量水分子，使水笼无法有效隔离蛋白质的非极性区，造成这些非极性区之间的

吸引，因而沉淀下来。因此，分子表面上若有越多的非极性区域，就越容易用硫酸铵沉淀下

来。

在计算所添加的硫酸铵的重量方面，找到了一个不错的网站——硫酸铵计算机

这个网页上可以靠着输入实验温度、溶液体积、想要到达的百分浓度以及初始的百分浓度这

四个数值，就可以得到需要添加的硫酸铵克数，以及在加入固体硫酸铵后所增加的体积，算

是一个很不错的网站。

此外另一个比较值得提的，是我有用两种方式加入硫酸铵，第一种是固体的硫酸铵模碎加入，

另一种是将硫酸铵溶成饱和溶液再加入，各有各的优缺点，比较如下：

1.造成蛋白质变质的程度：固体的硫酸铵>硫酸铵饱和溶液

利用硫酸铵饱和溶液真的超棒，滴入的速度可以很快而不造成变质(没试过用倒入的)。 不

像固体的硫酸铵只能磨碎慢慢加入，速度一快蛋白质就坏了(溶液有致密的白色气泡产生)。

2.操作的容易度： 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵

固体硫酸铵最大的缺点就是操作不容易，要一直敲敲敲又不能太快，所以当你要溶解的蛋白

质很多时，这是很累的步骤。然而硫酸铵饱和溶液比较麻烦只有在配制部分，要先加热让它

饱合后，回到操作温度让它过饱和，最后用滤纸把硫酸铵结晶去掉。

3.蛋白质溶液的体积放大程度 硫酸铵饱和溶液>>固体的硫酸铵

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这是使用硫酸铵饱和溶液最头痛的部分，举例来说，要让100 ml的硫酸铵百分比从0%到

25%， 如果是加入固体的硫酸铵，只会让溶液从100 ml变成107 ml左右，但若是加入硫酸

铵饱和溶液，会让溶液变成125 ml！而且若是要提高到50%，须加等量的硫酸铵饱和溶液，

所以会让蛋白质溶液从100 ml变成200 ml。

因此在加入硫酸铵时，若是低百分浓度可以利用硫酸铵饱和溶液，然而如果是高百分浓度的，

除非不在意蛋白质溶液体积的放大(反正都要离心离下来)，否则还是用固体硫酸铵来的好。

所以今天从0%拉到25%及从25%拉到50%时，都是利用硫酸铵饱和溶液，但是当要从50%

拉到75%时，我选择利用固体硫酸铵，因为如果用硫酸铵饱和溶液， 离心机无法离那么多

的溶液体积。

硫酸铵沉淀法纯化蛋白的原理和操作及配比用表 - Ox Liu - Ox Liu的博客

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