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《中国科学》杂志社

SCIENCE IN CHINA PRESS

基于固定化纳米金增强化学发光双酶传感器测定葡萄糖

林洁华, 张慧, 张书圣*

青岛科技大学化学与分子工程学院; 生态化工教育部重点实验室, 青岛 266042

* 联系人,E-mail:******************收稿日期：2008-09-12; 接受日期：2008-10-15

山东省自然科学基金 (批准号: Q2007B03)、青岛科技大学博士基金 (批准号: 0022141)和国家自然科学基金(批准号: 20775038)资助

摘要 研制了一种新型流动注射化学发光(CL)双酶传感器, 用于葡萄糖的检

测. 该传感器将掺杂金纳米粒子(GNPs)的壳聚糖膜包覆在硅烷化试剂预处理的玻璃微珠上, 用于吸附固定葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP). 葡萄糖在GOD的催化下发生氧化反应生成H2O2, 生成的H2O2在HRP的催化作用下与鲁米诺发生反应, 并产生化学发光信号. 实验表明, 壳聚糖中掺杂的GNPs不仅能够有效的吸附酶分子并保持其生物活性, 还对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系具有增敏作用. 通过化学发光光谱和紫外光谱表征, 详细研究了固定化GNPs增强Luminol-

H2O2-HRP体系的化学发光机理. 在优化的实验条件下, 该传感器对葡萄糖检测的线性范围为0.01 ~ 6.0 mmol/L, 检测限为5.0 μmol/L (3σ). 将所建立的方法用于临床血清样品中葡萄糖含量的测定, 获得了满意的结果.

关键词

化学发光传感器

葡萄糖

金纳米粒子

辣根过氧化物酶

葡萄糖氧化酶

1 引言

实现葡萄糖的快速定量检测在生物化学、临床化学以及食品分析等领域具有重要意义[1]. 迄今为止,

已有许多有关葡萄糖检测方法的报道, 如电化学检测[1~6], 电致发光检测[7], 表面增强拉曼散射光谱检测, 光度法检测和化学发光检测[8][9][10~15]HRP

H2O2

+ luminol

 3-aminophthalic acid + h (2)

化学发光分析技术具有仪器设备简单, 检测限低和线性范围宽等优点. 近年来, 化学发光酶传感器以其高灵敏度, 高通量分析, 易于操作和微型化等优点引起了人们的广泛关注[16~18]. 在诸多化学发光双酶测定葡萄糖的研究报道中, 以鲁米诺化学发光体系应用最为广泛. 例如: Economou A等结合流动注射/顺序注射分析技术, 建立了一种快速测定葡萄糖的方法, 对葡萄糖检测的线性范围为0.01 ~ 1

mmol/L[10]. 一些催化剂如金属离子、金属螯合物、纳米粒子和酶等都能有效的增强该体系的化学发光强等. 其中采用葡萄糖氧化酶(GOD)和辣根过氧化物酶(HRP)研制的双酶传感器, 由于具有选择性好, 灵敏度高等优点而得到了广泛应用. 双酶反应体系的催化反应机理如下:

GOD -D-gluco + O2 + H2O

 gluconolacton + H2O2

(1)

度[19]. 近年来, 以金纳米粒子作为催化剂增强鲁米诺1

林洁华等: 基于固定化纳米金增强化学发光双酶传感器测定葡萄糖

化学发光的研究相继有文献报道[20~25]. HRP作为

化学发光检测中应用最为普遍的酶之一, 通过催

化H2O2氧化Luminol从而提高化学发光反应的效

率. 苯酚衍生物、二氧化碳、荧光素、苯基硼酸等化合物均可作为该体系的发光增强剂[26], 可增强Luminol-H2O2-HRP体系的发光效率. Miró等报道了以Co(II)作为Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的增强剂, 建立了一种双酶传感器测定葡萄糖的方法[11].

目前, 以固定化金纳米粒子(GNPs)作为增敏剂增强Luminol- H2O2-HRP化学发光体系的研究还未见文献报道.

章竹君等用蛋壳膜作为GOD和HRP的固定载体,

研制了一种新型的双酶传感器, 对葡萄糖检测的线性范围为0.001 ~ 0.1 mmol/L[15]. 壳聚糖作为一种性能优良的天然聚合物, 具有无毒、附着力强、生物兼容性好以及对环境友好等优点[27], 可用作酶的固定化载体. GNPs-壳聚糖复合膜能有效地维持生物分子的活性, 被视为一种新型的生物分子固定化载体[28~30].

本工作采用GNPs-壳聚糖膜固定HRP和GOD, 构建了一种双酶传感器, 采用流动注射化学发光分析测定葡萄糖. 首次提出以固定化GNPs作为增强剂, 建立了Luminol-H2O2-HRP-GNPs增强化学发光新体系,

并对其增强机理进行了探讨.

2 实验部分

2.1 试剂及标准溶液

壳聚糖(MW 1.9 ~ 3.1105; 脱乙酰度85% ~ 90%,

Aldrich), Luminol(ABCR GmbH & Co. KG, 德国),

H2O2(AR, 上海化学试剂厂), β-D-葡萄糖(AR, 沈阳试剂公司), γ-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPS, 南京化学试剂厂), 葡萄糖氧化酶(GOD, 146 U/mg,

Sigma), 辣根过氧化物酶(HRP, 300 U/mg, Sigma),

玻璃微珠(<200 μm, 河北永清玻璃制品有限公

司). 其他试剂均为分析纯, 使用时未经进一步提纯.

0.01 mol/L Luminol储备液: 称取0.1772 g固体Luminol溶于0.1 mol/L NaOH溶液中, 摇匀, 避光保存, 使用时用0.1 mol/L pH 9.2的Tris-HCl缓冲溶液稀释至所需浓度. 2%壳聚糖溶液(wt%): 称取1 g壳聚

2

糖固体粉末, 溶于50 mL 1%的醋酸溶液中, 摇匀备用. 1.0 mmol/L H2O2溶液: 移取10.2 μL 30% H2O2于100 mL蒸馏水中, 摇匀备用. 实验室用水为二次蒸馏水.

2.2 仪器

IFFM-E型流动注射化学发光分析仪(西安瑞迈分析仪器有限公司), 0.1 mol/L pH 6.8磷酸盐缓冲溶液(PBS)作为葡萄糖的载流. JEM 1200EX型透射电子显微镜(JEOL, 日本). Cary 50型紫外分光光度计(Varian Pty Ltd, 澳大利亚). 化学发光光谱在F-4500荧光分光光度计(Hitachi, 日本)上测得, 检测时关闭激发光源.

2.3 GNPs-壳聚糖复合膜的合成

采用柠檬酸钠还原法制得粒径分别为25, 40及60 nm的金溶胶[30], 通过TEM表征, 得到的三种GNPs的平均粒径分别为(25 ± 2.5) nm, (40 ± 3.0) nm及(60 ± 5.0) nm. 然后将金溶胶分别与10 mL 2%的羧基化壳聚糖溶液混合均匀.

用新配制的混酸(HNO3:HCl=1:3)清洗玻璃微珠,

用二次蒸馏水彻底冲洗干净后晾干. 对玻璃微珠表面进行硅烷化预处理后[27], 在其表面包覆一层GNPs-壳聚糖膜, 于40℃下烘干2 h.

2.4 化学发光双酶葡萄糖传感器的研制

将GNPs-壳聚糖修饰的玻璃微珠分别置于1 mL

4×104 g/mL HRP溶液和1 mL 5×104 g/mL GOD溶液中吸附酶分子24 h, 并于4℃冰箱保存. 将固定了GOD(或HRP)的玻璃微珠填充到12 cm长的透明塑料管中(3.0 mm i.d.)制成GOD(HRP)传感器. 如图1所

示, 在进行流动注射化学发光检测时, 当葡萄糖标准溶液恰好充满GOD传感器时, 立即将管路的b和d两端连接起来形成回路. 当GOD与葡萄糖样品反应完全后, 断开b和d两端使管路恢复原状, 此时反应产生的H2O2通过控制换向阀被载入到流通池内, 在光电倍增管正上方的HRP传感器中与Luminol溶液混合, 在固定化GNPs的增敏作用下, 由IFFM-E型流动注射化学发光分析仪检测化学发光信号.

图1 流动注射化学发光双酶传感器测定葡萄糖示意图

3 结果与讨论

3.1 GNPs对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的增强作用

研究了固定化GNPs对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的影响. 结果表明, 壳聚糖中掺杂的GNPs显著增强Luminol-H2O2-HRP体系的化学发光强度,

结果如图2所示. 然而, 不同粒径的固定化GNPs对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的增强作用差别很小(图2中未显示), 该结果与报道的溶液状态下, 不同粒径金溶胶对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系增强作用不同的结论不符[25].

Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增强化学发光体系的发光光谱如图3所示, 结果表明, Luminol-

H2O2-HRP-固定化GNPs增强化学发光体系的最大发射波长为425 nm, 与Luminol-H2O2化学发光体系的最大发射波长相同. 表明该体系的发光体仍然是3-氨基邻苯二甲酸盐阴离子, 没有新的发光体生成. 化学发光的增强作用可能是由于GNPs的催化效应, 加速了体系的电子转移速率, 这与文献[25,31]报道的机理相一致.

通过紫外光谱进一步研究了Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增强化学发光体系的发光机理, 如图4所示. 结果表明, 与金溶胶 (曲线(e))相比, 掺杂在壳

中国科学 B辑: 化学 200x年 第xx卷 第xx期

图2 固定化GNPs对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的增强作用

实验条件: 1.0 mmol/L Luminol溶液; 0.1 mol/L Tris-HCl溶液(pH

9.25); 1.0 mmol/L H2O2溶液. (a) Luminol + H2O2; (b) luminol +

H2O2 + GNPs; (c) luminol + H2O2 + HRP; (d) luminol + H2O2 + HRP

+ GNPs

图3 Luminol-H2O2-HRP-固定化GNPs增强化学发光体系的化学发光光谱

实验条件: 1.0 mmol/L Luminol溶液; 0.1 mol/L pH 9.25 Tris-HCl溶液; 1.0 mmol/L H2O2溶液. (a) Immobilized GNPs; (b) luminol +

H2O2; (c) luminol + H2O2 + GNPs; (d) luminol + H2O2 + HRP; (e)

luminol + H2O2 + HRP + GNPs

聚糖中的GNPs的吸收波长 (曲线(f))没有出现红移,

表明固定在壳聚糖膜内的GNPs没有发生团聚现象.

固定化GNPs在化学发光反应前后, 紫外吸收波长没有发生改变 (曲线(f), (g)), 该结果与文献报道的结果相吻合[25], 进一步证明了GNPs的催化效应.

3

林洁华等: 基于固定化纳米金增强化学发光双酶传感器测定葡萄糖

催化H2O2氧化Luminol的反应从而促进化学发光,

首先, HRP与H2O2反应形成氧化态HRP(HRP I), HRP

I与Luminol阴离子反应形成半还原态酶(HRP II)和激发态Luminol[32]. 掺杂的GNPs充当了反应的电子转移媒介, 加快了固定在其表面的HRP经HRP I和HRP II转变为还原态(HRP)的速率, 从而起增强作用.

3.2 化学发光检测条件的优化

双酶传感器的性能主要取决于化学发光反应中Luminol溶液的浓度、缓冲溶液的pH值, 以及GOD催化氧化葡萄糖的反应条件. 优化检测条件的结果

如图5所示. 以0.1 mol/L PBS缓冲液作为1.0 mmol/L葡萄糖样品的载流, 在GOD传感器中反应4 min, 从而确定Luminol的反应pH和浓度. 图5(a)表明, 当0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液pH值为9.2时, 化学发光信号最强. 图5(b)表明, 当Luminol溶液浓度在0.05 ~ 1.0 mmol/L之间时, 该体系的化学发光强度随Luminol溶液浓度的增加而增加, 当浓度达到1.0

mmol/L时, 化学发光强度基本达到峰值, 然后随着Luminol溶液浓度的增加, 发光信号反而降低. 因此,

图4 不同底物溶液的紫外光谱

(a) H2O2; (b) luminol; (c) HAuCl4; (d) 柠檬酸钠; (e) 溶液中的GNPs; (f) 固定化的GNPs; (g) 化学发光反应后固定化的GNPs

综上所述, 固定化GNPs对Luminol-H2O2-HRP化学发光体系具有明显的增强作用, 并且, GNPs的粒径大小对化学发光的增强作用影响不大. 由此推断, Luminol-H2O2体系化学发光的增强很可能是由掺杂的GNPs和HRP的协同催化效应引起的. HRP能够

图5 葡萄糖测定实验条件优化

(a) Luminol 溶液pH值; (b) luminol溶液浓度; (c)葡萄糖的酶催化反应时间; (d)葡萄糖浓度. 实验条件: 1.0 mmol/L葡萄糖溶液; 0.1 mol/L

PBS缓冲液; 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液

4

选择Luminol溶液的最佳pH值为9.2, 最佳浓度1.0

mmol/L.

在最佳实验条件下, 试验了GOD催化氧化葡萄糖反应时间的影响, 如图5(c)所示. 结果表明,葡萄糖在GOD传感器中流通的时间越长, 两者的反应时间越长, 产生的H2O2的量越大. 但是, 反应时间太长会使整个分析过程延长. 因此, 选择催化氧化反应时间为4 min. 试验了葡萄糖载流酸度的影响, 如图5(d)所示. 结果表明, 当PBS缓冲溶液的pH值为6.8时,

体系的化学发光信号最强. 因此, 检测中选择GOD酶催化反应的最佳pH值为6.8.

3.3 葡萄糖的检测

在最佳实验条件下对葡萄糖标准溶液进行了测定, 结果如图6所示. 结果表明, 对葡萄糖检测的线性范围为0.01 ~ 6.0 mmol/L, 线性方程为I =

42.87(±27) + 1566(±11)C (其中, I为体系的化学发光强度, C为葡萄糖浓度, mmol/L), 线性相关系数为0.9997(n=10), 检测限为5.0 μmol/L(3σ). 与文献报道的化学发光葡萄糖传感器[10,13]相比, 本方法灵敏度高, 检测限低且线性范围宽.

图6 流动注射化学发光双酶传感器测定葡萄糖的工作

曲线

3.4 干扰试验

为检测血清中葡萄糖的含量, 研究了血清中共存组分的干扰. 结果表明, 当葡萄糖溶液浓度为0.5

中国科学 B辑: 化学 200x年 第xx卷 第xx期

mmol/L时, 1000倍的Na+, K+, Ca2+, Cl, NO3, PO43和SO42; 100倍的尿素和50倍的尿酸不干扰测定. 这说明该生物传感器具有良好的选择性.

3.5 血清样品测定

对人血清中葡萄糖的含量进行了测定, 见表1所示. 结果表明, 该方法和医院采用的临床分析方法所得结果相吻合. 为进一步验证该方法的准确性, 采用标准加入法测定了样品的回收率, 见表2. 结果表明,

回收率在96% ~ 105%之间, 方法准确, 可用于临床样品的测定.

表1 血清样品中葡萄糖的测定

样品

医院临床本方法 相对偏差

/mmolL1 /mmolL1, n=5

/%, n=5

Serum 1 0.29 0.23 2.62

Serum 2 1.28 1.37 1.28

Serum 3 5.60 5.28 0.87

Serum 4 4.90 5.40 1.75

表2 样品中葡萄糖的回收率测定

样品

标液加入量测得值

回收率 相对偏差

mmolL1 /mmolL1, n=5 /%, n=5 /%, n=5

1 0.50 0.48 96.00 2.32

2 1.50 1.57 104.67 1.86

3 3.50 3.58 102.28 1.51

4 4.50 4.38 97.33 2.70

3.6 传感器的稳定性

传感器的稳定性主要取决于固定的HRP和GOD的稳定性. 对所研制的传感器的稳定性进行实验,

每次测完后将其置于pH 7.0 PBS缓冲溶液中并于4℃冰箱保存. 结果表明, 传感器保存3周后测得的发光信号没有明显的降低, 5周后测得信号大约降低到初始值的85%, 之后的两个月内信号基本保持不变. 另外, 为确定该传感器的操作稳定性, 对浓度为1.0

mmol/L的葡萄糖标准溶液进行了50次连续测定, 相对标准偏差为1.9%. 说明固定在GNPs-壳聚糖膜上的酶能够保持良好的生物活性, 传感器具有较好的稳定性.

5

林洁华等: 基于固定化纳米金增强化学发光双酶传感器测定葡萄糖

4 结论

本文构建了一种快速、高效的测定葡萄糖含量的流动注射化学发光双酶传感器. 以GNPs掺杂的壳聚糖膜作为HRP和GOD的固定化载体, 可以有效地固定HRP和GOD酶分子, 而掺杂的GNPs对Luminol-

H2O2-HRP化学发光体系具有增敏作用. 固定化的GNPs充当了反应的电子转移媒介并加速了化学发光

反应中酶的催化作用. 由于固定化的HRP与GNPs的协同催化效应, 该方法对葡萄糖的检测灵敏度高,

检测限低, 且线性范围宽. 所构建的生物传感器已成功地用于血清样品中葡萄糖的测定. 固定化GNPs作为Luminol-H2O2-HRP化学发光体系的一种新型增强剂, 在酶分析和免疫分析等领域具有较好的应用

价值.

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