2023年12月31日发(作者:书院二小松)
端粒末端G-四联体结构的形成以及
以G-四联体结构为靶点的端粒酶抑制剂研究进展
07102108 王婷婷
摘要:端粒是真核细胞染色体末端的特殊结构,由简单的DNA片段重复而成,这些片段多富含G,因此这种DNA被称为富-G DNA。G-四联体就是单链部分的富-G DNA在特定的离子强度和PH值条件下形成的结构。肿瘤细胞中这种结构的形成可抑制端粒酶的活性,使端粒长度稳定机制遭到破坏。因此G-四联体成为目前抑癌手段的新热点。
关键词:G-四联体 端粒 端粒酶抑制剂 富-G DNA
1.端粒和端粒酶
端粒作为一种特殊的染色体末端的结构,存在于真核生物细胞中,由端粒DNA和端粒蛋白质组成。其中,端粒DNA的G碱基含量很多,经常由简单的富G-DNA片段高度重复而成。端粒具有高度的保守性和种属特异性。
1.1端粒存在的意义
在DNA复制过程中,由于其只能从5’端向3’端顺序复制,新生成的DNA中只有一条单链是顺序复制下来的,另一条单链则会以RNA引物加上冈崎片段的形式复制。 其中一条新单链5’端会被RNA引物先行占据。(图1)
图1 DNA复制
当复制完成后,RNA引物会自行脱下,接着由DNA连接酶识别每个冈崎片段的末尾,对其与下一个冈崎片段的开头进行连接(从上图中看是从右向左进行连接)。这时就出现了一个问题,那条新单链的5’端(最右端)没有上个冈崎片段的末尾,DNA连接酶不能补全它由于RNA引物的脱去而缺失的部分。这个问题被称为末端隐缩。
有端粒存在的情况下,在染色体进行复制时,丢失的部分只是一段高度重复的DNA(在上图中也就是存在于原DNA的3’端,并不含有翻译后有意义功能的序列)——即一部分端粒,用这种方法保证了染色体的完整复制,这是端粒的主要作用之一。当然,因为染色体是互补配对进行复制的,所以在DNA的5’端也有端粒的序列,以保证子代DNA的3’端在下次复制时不会丢失重要序列。由此可见,端粒是真核生物进化过程的产物,因为它的存在,
复杂的染色体复制机制才可以周而复始地进行下去。
由于每次都是子代DNA的5’端不能复制原DNA的序列,所以相比较而言,子代DNA3’端比5’端的序列要长。由此类推,所有DNA的端粒部分,3’端都比5’端要长一些。这和下面介绍的G-四联体的形成息息相关。
除此之外,端粒位于染色体的末端,还可以有效避免染色体相互之间的融合,避免核酸酶将染色体降解。有一个很好的比喻——端粒就如同一条鞋带末端的胶圈,没有胶圈,鞋带末端就会开始散开,鞋带也就失去了使用的价值。在染色体中,失去端粒将意味着基因的不稳定,基因突变和基因丢失的几率增加,也会因此触发细胞的凋亡机制。比如P53抑癌基因,它的触发就源于细胞中端粒缩短到一定的临界长度,这个细胞再生长增殖下去已经对生物体的基因稳定有威胁,于是会由P53来诱导此细胞凋亡。由此,细胞中如果端粒维持在一定的长度,细胞便不会凋亡,肿瘤细胞便是如此。究竟是什么导致了肿瘤细胞中的端粒不会缩短呢?答案是端粒酶。
1.2 端粒酶的作用
端粒酶是一种逆转录酶,由RNA,蛋白质以及催化亚基组成。它能以自己的RNA为模板合成端粒DNA序列,维持甚至增长端粒的长度,这一切的前提是在端粒酶有活性的情况下。在胚胎期,端粒酶的活性很高,很多组织中都能测出它的存在。但随着细胞的分化,端粒酶的活性很快下降,因为其基因表达受到抑制。在正常情况下,除了在干细胞,造血细胞等必须不断分裂的细胞中,仍能检测出端粒酶的活性外,其余的细胞中均没有有活性的端粒酶的存在。这说明,端粒酶的活性在正常细胞中受到很严密的调控。
而在恶性肿瘤细胞中,几乎都可以测到端粒酶的活性。这使得恶性肿瘤细胞的端粒总能被延长而保持一定的安全长度,染色体将永远完整的被复制,细胞因此不会走向凋亡,只会不断增殖扩散。
2 G-四联体
G-四联体是G-四联体螺旋的基本单位,也是四联体DNA的一种特例。
2.1 G-四联体的形成
以人的DNA为例,在端粒末端靠近3’一端是富含G重复序列的的,比如重复序列TTAGGG(同理,另一端5’端则富含C,即是AATCCC)。这种富含G的DNA被称为-G DNA。而上面提到,端粒末端3’端总比5’端要长一些,被称为“端粒尾”,所以端粒尾既是-G DNA又是单链DNA。
……
图2 人端粒末端序列
1989年,Sundpuist和Klug发现在一定条件下,人工合成的模拟一种原生动物棘毛虫的DNA中,富-G的单链DNA可形成四联体结构。由此他们推测端粒尾也形成了四联体结构。1992年,Klug通过X-射线晶体衍射实验证实,富-G的DNA片段的确能够形成四联体结构。
四联体DNA是由富-G DNA单链在特定离子强度和pH值条件下,由4条或4段富-G
DNA单链形成的一段平行右旋的四联体DNA。当DNA重复片段中G成串排列时,形成的四联体更具代表性,称为G-四联体螺旋。G-四联体螺旋中的基本单位,就是G-四联体。
2.2 G-四联体的结构
图3 G-四联体的结构 图4 G-四联体螺旋结构
G-四联体是4个G由8条氢键形成的平面,每个G既是氢键配体又是氢键的受体。因为G-四联体的中心有4个带负电的羰基,所以中心往往会螯合一个正离子,这个正离子会使整个G-四联体的结构更为稳定。这个稳定的作用是根据正离子大小改变而改变的,大小越接近于中心“口袋”的大小,就会使整个结果越稳定。另外,在大小合适的基础上,螯合的正离子价态越高,G-四联体结构越稳定。
稳定的G-四联体螺旋拥有多种形态。首先,从形成四联体的链的数量上看,可以由四条链,两条链,甚至一条链形成的三种G-四联体螺旋。
图5a 一条链 图5b 两条链 图5c 四条链
其次,由链的排列方向上看,G-四联体螺旋有四条链都平行,和两条链平行(另两条链反平行)两种情况。
图6a 四条链平行 图6b 两条链平行
再有,根据离子螯合的位置也有下面几种不同情况。
图7 不同的离子螯合情况
除此之外,四联体中的苷键构型也有两种:全反或是交替顺反。这种构型的不同也与链的平行情况有关。
图8 苷键不同构型
3 以G-四联体结构为靶点的端粒酶抑制剂
3.1 G-四联体与端粒酶的关系
在端粒酶发挥作用时,必须要将自己的RNA序列与端粒末端的DNA序列相互识别并结合,才能延长端粒的长度。此时的端粒末端,应当呈现的是链状的一级结构。G-四联体是端粒末端往往会形成的二级结构,也就是说,当端粒末端呈现G-四联体螺旋时,端粒酶便不具有结合位点,它的活性将被抑制。所以,我们要寻找与G-四联体结合并维持其稳定性的小分子,以抑制端粒酶的活性。
3.2 以G-四联体为靶点的小分子端粒酶抑制剂
3.2.1 蒽醌类药物
2,6-二酰胺蒽醌衍生物BSU 1051是第一个以G-四联体为靶点的端粒酶抑制剂,在此之后,人们发现很多蒽醌化合物都具有稳定G-四联体结构的作用,主要机制是与双链DNA结合。但也因为此作用,这种抑制剂对细胞的毒性很大。
图9 2,6-二酰胺蒽醌衍生物BSU 1051结构式
3.2.2 吖啶类药物
吖啶类化合物与蒽醌类化合物结构相似,但抑制端粒酶活性的效果比蒽醌类化合物更强。主要原因在于吖啶类化合物稠环中的N原子能质子化,从而带一定的正电荷,因此能更准确地螯合在G-四联体的中心部位,增强其结构的稳定性。
图10 吖啶类化合物结构式
3.2.3 卟啉类药物
与上述两种化合物不同的是,卟啉类化合物对G-四联体的结构有很高的选择性。不同的卟啉类化合物与不同的G-四联体结合对端粒酶的活性抑制效果不同。卟啉类化合物同G-四联体的结合主要通过堆积作用。
图11 卟啉类化合物结构式
3.2.4 二萘嵌苯类药物
N,N’-双[2-(1-哌啶基)乙基]-3,4,9,10-北四甲酰二亚胺同卟啉类化合物类似,通过外向堆积作用与G-四联体结合。需要说明的是,此种化合物不但能够稳定G-四联体的结构,还能促进G-四联体的形成,对DNA单、双链的作用很小。不同的二萘嵌苯类化合物对不同结构的G-四联体亦有很高的选择性。
图12 二萘嵌苯类化合物结构式
3.2.5 溴乙啶类药物
溴乙啶是一种DNA二聚体的插入剂,它的作用机理是通过插入在G-四联体之间而稳定G-四联体结构的形成。G-四联体与溴乙啶结合会产生荧光效果,常被用作分子荧光探针。
图13 溴乙啶类化合物结构式
3.2.6 花青染料类药物
虽然花青染料类化合物中只有很少的几种可与G-四联体结合以抑制端粒酶的活性,但花青染料DODC可以双分子发夹型G-四联体特异性结合,显示出特殊的光谱特征,常被当做此类G-四联体的分子探针。
图14 花青染料类化合物结构式
3.2.7 三吖嗪类药物
三吖嗪类化合物的作用机理在于可以明显升高G-四联体的解链温度。并且有实验发现:肿瘤细胞在该类化合物中长期培养,结果是端粒缩短和细胞衰老,这种现象与起始的端粒长度有关。
图15 三吖嗪类化合物结构式
4 结语
以G-四联体为靶点的端粒酶抑制剂相关研究已经成为现在的抑癌热点之一。G-四联体的稳定性会受到周围环境的影响,而小分子通过各种途径增强G-四联体的稳定性,使端粒酶的结合位点受到封闭,从而打破端粒长度稳定机制,这是一个崭新的治疗恶性肿瘤的途径。有些小分子对正常细胞亦有毒害作用以及其他尚未成熟的方法,都需要我们进一步的努力研究。
参考资料
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