融合蛋白标签与纯化

2023年12月12日发(作者：民族团结绘画)

蛋白标签

蛋白标签

蛋白标签（proteintag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和纯化等。随着技术的不断发展，研究人员相继开发出了具有各种不同功能的蛋白标签。目前，这些蛋白标签已在基础研究和商业化产品生产等方面得到了广泛的应用。

美国GeneCopoeia（复能基因）为客户提供50多种蛋白标签，可以满足客户的不同需求，包括各种最新型的标签，如：SNAP-Tag?、Halo Tag?、AviTag?、Sumo等；也提供齐全的各种常用标签，如eGFP、His、Flag等等标签。

以下是部分蛋白标签的特性介绍，更加详细的介绍可在查询克隆产品的结果列表里面看到各种推荐的蛋白标签和载体。

标签

His6

Flag

GST

MBP

His-MBP

HA

Myc

His-Myc

His-AviTag?

Sumo

His-Sumo

SNAP-Tag?

Halo Tag?

TrxHIS

纯化 促进溶解度 抗体效价 细胞标记

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eGFP/CFP/YFP

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His6是指六个组氨酸残基组成的融合标签，可插入在目的蛋白的C末端或N末端。当某一个标签的使用，一是能构成表位利于纯化和检测；二是构成独特的结构特征（结合配体）利于纯化。组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。使用His-tag有下面优点： 

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标签的分子量小，只有~0.84KD，而GST和蛋白A分别为~26KD和~30KD，一般不影响目标蛋白的功能；

His标签融合蛋白可以在非离子型表面活性剂存在的条件下或变性条件下纯化，前者在纯化疏水性强的蛋白得到应用，后者在纯化包涵体蛋白时特别有用，用高浓度的变性剂溶解后通过金属螯和亲和层析去除杂蛋白，使复性不受其它蛋白的干扰，或进行金属螯和亲和层析复性；

His标签融合蛋白也被用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用研究；

His标签免疫原性相对较低，可将纯化的蛋白直接注射动物进行免疫并制备抗体。

可应用于多种表达系统，纯化的条件温和；

可以和其它的亲和标签一起构建双亲和标签。

Flag标签蛋白

Flag标签蛋白为编码8个氨基酸的亲水性多肽（DYKDDDDK），同时载体中构建的Kozak序列使得带有FLAG的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。

FLAG作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

FLAG作为融合表达标签，其通常不会与目的蛋白相互作用并且通常不会影响目的蛋白的功能、性质，这样就有利用研究人员对融合蛋白进行下游研究。

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融合FLAG的目的蛋白，可以直接通过FLAG进行亲和层析，此层析为非变性纯化，可以纯化有活性的融合蛋白，并且纯化效率高。

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FLAG作为标签蛋白，其可以被抗FLAG的抗体识别，这样就方便通过Western

Blot、ELISA等方法对含有FLAG的融合蛋白进行检测、鉴定。

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融合在N端的FLAG，其可以被肠激酶切除（DDDK），从而得到特异的目的蛋白。因此现FLAG标签已广泛的应用于蛋白表达、纯化、鉴定、功能研究及其蛋白相互作用等相关领域。

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MBP（麦芽糖结合蛋白）

MBP（麦芽糖结合蛋白）标签蛋白大小为40kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。MBP标签可通过免疫分析很方便地检测。有必要用位点专一的蛋白酶切割标签。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。纯化：融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。结合的融合蛋白可用10mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。结合亲和力在微摩尔范围。一些融合蛋白在0.2% Triton

X-100或0.25% Tween 20存在下不能有效结合，而其他融合蛋白则不受影响。缓冲条件为pH7.0到8.5，盐浓度可高达1M，但不能使用变性剂。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。 GST(谷胱甘肽巯基转移酶)

GST(谷胱甘肽巯基转移酶) 标签蛋白本身是一个在解毒过程中起到重要作用的转移酶，它的天然大小为26KD。将它应用在原核表达的原因大致有两个，一个是因为它是一个高度可溶的蛋白，希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性；另一个是它可以在大肠杆菌中大量表达，起到提高表达量的作用。GST融合表达系统广泛应用于各种融合蛋白的表达，可以在大肠杆菌和酵母菌等宿主细胞中表达。结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱。在大多数情况下，融合蛋白在水溶液中是可溶的，并形成二体。GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测。标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性。在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。

纯化：该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶(Glutathione pharo)亲和树脂进行纯化。GST标签蛋白可在温和、非变性条件下洗脱，因此保留了蛋白的抗原性和生物活性。GST在变性条件下会失去对谷胱甘肽树脂的结合能力，因此不能在纯化缓冲液中加入强变性剂如：盐酸胍或尿素等。

如果要去除GST融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。

检测：可用GST抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测。

HA

HA标签蛋白，标签序列YPYDVPDYA，源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，9个氨基酸，对外源靶蛋白的空间结构影响小, 容易构建成标签蛋白融合到N端或者C端。易于用Anti－HA抗体检测和ELISA检测。

c-Myc

C-Myc标签蛋白，是一个含11个氨基酸的小标签，标签序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-

Ser-Glu-Glu-Asp-Leu，这11个氨基酸作为抗原表位表达在不同的蛋白质框架中仍可识别其相应抗体。C-Myc tag已成功应用在 Western-blot杂交技术、免疫沉淀和流式细胞计量术中, 可用于检测重组蛋白质在靶细胞中的表达。

eGFP

eGFP标签蛋白，是增强型绿色荧光蛋白eGFP,激发波长为488nm，发射波长为507nm，其是由野生型绿色荧光蛋白GFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于GFP，eGFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eGFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。eGFP作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： 不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

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其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

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同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

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其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eGFP表达标签被广泛地应用于基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

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此外由我公司提供的IRES双顺反子载体，可同目的基因共表达eGFP，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

eYFP

eYFP标签蛋白为增强型黄绿色荧光蛋白eYFP，激发波长为513nm，发射波长为527nm，其是由野生型黄绿色荧光蛋白YFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于YFP，eYFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eYFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。eYFP作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点：

不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

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其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

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同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

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其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eYFP表达标签被广泛的应用与基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

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此外由我公司提供的IRES双顺反子载体，可同目的基因共表达eYFP，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

eCFP

eCFP标签蛋白为增强型青色荧光蛋白eCFP，激发波长为433nm或453nm，发射波长为475nm或501nm，其是由野生型青色荧光蛋白CFP通过氨基酸突变和密码子优化而来的。相对于CFP，eCFP荧光强度更强、荧光性质更稳定。同时载体中构建的Kozak序列使得含有eCFP的融合蛋白在真核表达系统中表达效率更高。eCFP作为标签蛋白，其融合表达目的蛋白后具有以下优点： 不用破碎组织细胞和不加任何底物，直接通过荧光显微镜就能在活细胞中发出绿色荧光，实时显示目的基因的表达情况，而且荧光性质稳定，被誉为活细胞探针。

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其自发荧光，不需用目的基因的抗体或原位杂交技术就可推知目的基因在细胞中的定位等情况。

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同时细胞内的其它产物不会干扰标签蛋白检测，从而使其检测更显得快速、简便、灵敏度高而且重现性。

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其低消耗、高灵敏度检测，十分适用于高通量的药物筛选。因此现eCFP表达标签被广泛的应用与基团表达调控、转基因功能研究、蛋白在细胞中的功能定位、迁移变化及药物筛选等方面。

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Avi Tag

AviTag标签蛋白是一个15 个氨基酸的短肽，具有一个单生物素化赖氨酸位点，与已知天然可生物素化序列完全不同，可以加在目标蛋白的N端和C端。融合表达后，可被生物素连接酶生物素化，为了纯化重组蛋白选用低亲和性的单体抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物，除了用于蛋白质分离纯化，还用于蛋白质相互作用研究。

Avi Tag标签系统具有以下几大优点:

无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi Tag位点轻易且有效地被生物素化；

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生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高；

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生物素Avi Tag只有15个氨基酸，对蛋白空间结构的影响非常小。

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SNAP-Tag

SNAP-Tag是新一代的蛋白标签技术，不仅专一性极高而且稳定，最大的优点是适用于多种环境下的蛋白质检测与纯化，如活细胞内、溶液中、或固态相(如SDS-PAGE gels)等。

SNAP-Tag是从人的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移（O6-alkylguanine-DNA-

alkyltransfera）获得。无论体内还是体外，SNAP-Tag都能与底物高特异性地共价结合，使蛋白标记上生物素或荧光基团（如荧光素和若丹明）。SNAP所带的活性巯基位点接受了苯甲基鸟嘌呤所携带的侧链苯甲基基团，释放出了鸟嘌呤。这种新的硫醚键共价结合使SNAP所带的目的蛋白携带上了苯甲基基团所带的标记物。苯甲基鸟嘌呤在生化条件下稳定，并且没有其他蛋白会和这类物质作用，所以SNAP标签反应是高特异的。检测：生物素或各种颜色荧光的底物（如荧光素、若丹明）可渗透进入细胞，方便快捷地进行活细胞内SNAP-Tag融合蛋白的标记与检测。它们也可特异性地标记大肠杆菌，酵母和哺乳动物等细胞抽提液或已经纯化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。 将纯化的或未纯化的SNAP-Tag融合蛋白与表面固定了苯甲基鸟嘌呤的基质混合，蛋白即可特异与底物作用，形成共价键，融合蛋白间接被固定在了基质表面上，可以达到更方便快捷地研究蛋白功能或纯化蛋白的目的。

Halo Tag

HaloTag?标签蛋白是一种脱卤素酶的遗传修饰衍生物，可与多种合成的HaloTag?配基有效地共价结合。这个分子量为33KDa的单体蛋白能融合在重组蛋白的N端或C 端，并在原核和真核系统中表达。

HaloTag?配基是小分子化学物，能够在体外或体内与HaloTag?蛋白共价结合。这些配基由两个关键组分组成：(1)一个通用的HaloTag?反应联结子，结合HaloTag?蛋白；(2)一个功能基团,例如荧光染料或亲和媒介。

能够共价和特异性结合多种合成的报告基团和亲和配基的特性，使得HaloTag?蛋白能够用于检测和亲和结合或固相化固定目的蛋白。

SUMO

SUMO标签蛋白是一种小分子泛素样修饰蛋白（Small ubiquitin-like modifier），是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18%的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。研究发现SUMO可以作为重组蛋白表达的融合标签和分子伴侣，不但可以进一步提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进靶蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。

此外SUMO还有一项重要的应用，就是可用于完整地切除标签蛋白，得到天然蛋白。因为SUMO蛋白水解酶（我公司可提供）能识别完整的SUMO标签蛋白序列，并能高效地把SUMO从融合蛋白上切割下来。切除SUMO后，经过亲和层析，去除标签蛋白部分，就得到和天然蛋白一样的重组蛋白。所以SUMO标签也常用于和其他标签一起应用，作为特异酶切水解位点。

荧光素酶（Lucifera）

荧光素酶不是标签蛋白，但是由我公司提供的IRES载体，可同目的基因共表达萤火虫荧光素酶基因，用于目的基因的体内蛋白示踪研究。

荧光素酶（Lucifera）能催化荧光素氧化，在氧化的过程中，发出生物荧光，然后通过荧光测定仪或液闪测定仪就可以测定荧光素氧化过程中释放的生物荧光。荧光素酶的优势在于发生物荧光，无需激发，无本底的影响，所以相关线性程度高；而且萤火虫荧光素酶在一般细胞中不会出现；荧光素酶分析的灵敏度很高，也容易操作；生物荧光的测定用简单的手动或全自动的微孔板化学发光检测仪都可以用；适合高通量筛选。 蛋白质融合表达的标签及切割研究

引言近年来,一些抗原表位的肽类和蛋白质已被用于大量生产重组蛋白质.这些亲和标签系统具有以下特征:(a)一步的吸附纯化,(b)对三级结构和生物活性影响小,(c)可方便且专一的去除以产生天然蛋白质,(d)在纯化过程中重组蛋白的分析简便准确,(e)适用于大量的不同蛋白质.有几种不同的策略用于大规模生产重组蛋白质.其中一种办法是使用很小的肽标签,这些标签不会与融合的蛋白质发生干扰.使用最为广泛的有多聚精氨酸,FLAG-,多聚组氨酸-, S-, and Strep II-tag等. 对于某些应用,小标签无需去除.这些标签不像大标签具有免疫原性,经常可以直接作为抗原用于产生抗体. 小标签对于融合蛋白的三级结构和生物活性的影响取决于标签的位置和氨基酸组成.另一种方法是使用大的肽类或蛋白质作为融合蛋白.，它们的使用可以增加目标蛋白的溶解性.缺点是对于一些应用如结晶或抗体产生等,标签必须加以去除.一般来说,对于特定的目标蛋白很难决定最佳的融合系统.这取决于目标蛋白本身(如稳定性,疏水性),表达系统,纯化后蛋白的用途.

1．融合标签融合标签的作用是用于检测和纯化目的蛋白，有时也用来增加目的蛋白在细胞质中的可溶性或帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高目的蛋白的生物活性。

1.1多聚精氨酸-标签(Arg-tag)

精氨酸-标签通常由5或6个精氨酸组成.它已被成功用作细菌C末端标签,精氨酸是碱性最强的氨基酸,带5个精氨酸标签的蛋白质可以结合到阳离子交换树脂SP-Sephadex上, 而大部分杂蛋白不结合.结合后,带标签的蛋白质在碱性pH下运行线性NaCl梯度洗脱得到.当C末端为疏水性区域时,多聚精氨酸可能影响蛋白质的三级结构.氨酸残基的C末端序列可用羧肽酶B处理去除.这一酶促处理已被成功用于一些例子,但常常由于低的切割得率或者在期望的蛋白质序列间发生不必要的切割而受到限制.然而精氨酸标签并不常用,与第二标签联用是很有趣的蛋白质纯化工具.

1．2 多聚组氨酸-标签(His-tag)

已广泛采用的方法是利用固定化金属螯合层析纯化带有由多聚组氨酸残基组成的一个短的亲和标签的重组蛋白质.固定化金属螯合层析的基础是固定在基质上的过渡态金属离子(Co2+, Ni2+,Cu2+, Zn2+)与特定的氨基酸侧链之间的相互作用.组氨酸是与固定化金属离子作用最强的氨基酸,组氨酸的咪唑环作为电子供体容易与固定的金属离子形成配位键.基质材料洗涤之后,可通过调节柱缓冲液的pH或者添加游离咪唑洗脱含多聚氨基酸序列的肽类。虽然在变性条件下系统对于带6个组氨酸标签的蛋白质纯化有效,带3个组氨酸标签的蛋白质在生理条件下可有效纯化.然而带6个组氨酸标签的蛋白质可以在天然条件下,在低或高浓度盐的缓冲液中结合到Ni2+-NTA 基质上.结合后,目标蛋白可用0.8到250 mM咪唑梯度洗脱.低浓度的咪唑(如0.8 mM)可减少带有组氨酸的宿主蛋白质的非专一吸附.6个组氨酸标签的蛋白质可用20到250mM咪唑浓度范围洗脱. 使用咪唑的缺点是咪唑的存在经常导致蛋白质的聚集.另一种用于纯化多聚组氨酸标签蛋白质的材料是TALON.这由Co2+-羧甲基天冬氨酸(Co2+-CMA)组成,并偶联到固相的树脂上.TALON使得标签蛋白在温和条件下洗脱,已有报导与Ni2+-NTA树脂相比,其非特异性蛋白结合更少,从而达到更高的洗脱产物纯度.一种酶制剂通过SDS-PAGE鉴定的纯度高于95%.

1.3 谷胱甘肽S-转移酶-标签

1988年首次描述了融合有谷胱甘肽S-转移酶(GST)的多肽的一步纯化.来自日本血吸虫(schistosoma japonicum),26-kDa的 GST被克隆在大肠杆菌表达载体中.融合蛋白可从未经处理的裂解液中用固定化的谷胱甘肽亲和层析加以纯化.结合的融合蛋白在非变性条件下用10mM 还原型谷胱甘肽洗脱..GST标签可用酶学分析或免疫分析很方便的检测.标签有助于保护重组蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其稳定性.在大多数情况下GST融合蛋白是完全或部分可溶的.推荐采用位点专一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子从融合蛋白切除GST标签.蛋白酶解后,GST载体和蛋白酶通过谷胱甘肽琼脂糖亲和层析去除.GST标签可位于N端或C端,可用于细菌,酵母,哺乳细胞, 和杆状病毒感染的昆虫细胞. GST融合蛋白已成为分子生物学家的基本工具。

1.4 Strep-标签(Strep-tag)

Strep-标签是一氨基酸肽开发来用于在链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)柱上亲和纯化相应的融合蛋白.链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)在特定位点第44,

45, 和47位的突变体与天然形式相比,对八肽Strep-tag II的亲和力更强,.Strep标签的蛋白质在生理缓冲液条件下结合到生物素结合区域中,并可用生物素衍生物温和洗脱.洗脱时推荐使用2.5 mM脱硫生物素.基质可以用4-羟基-偶氮苯-2-羧酸再生,这种物质在溶液中呈黄色,当结合到基质上则呈红色.结合条件是非常专一的.生物素化的蛋白质如大肠杆菌的羧基载体蛋白可以结合,但生物素或者生物素化的蛋白质则用抗生物素封闭.纯化条件是多种多样的.螯合剂,温和性去污剂,还原型去污剂,和高达1M的盐可以加到缓冲液中. Strep-标签系统适合用于研究蛋白质之间的相互作用以及当那些大的标签或者带电荷的标签无效时的特殊用途.

1.5 S-标签

S-标签是个融合肽标签可以通过快速灵敏的均匀分析或者在Western blot中用比色法加以检测.该系统的基础是15个氨基酸残基的S-tag与103氨基酸残基的S-蛋白质之间的强烈相互作用,这两个都来自RNaA.S-蛋白质/S-标签复合物的Kd接近0.1μM,这取决于pH,温度和离子强度.标签由4个带正电荷残基,3个负电荷残基,3个不带电的极性残基和5个非极性残基组成.这使S-标签保持可溶.S-标签的快速分析是基于核酸降解活力的恢复.标签蛋白可以结合到S蛋白质基质上.洗脱条件较苛刻,如pH2.0的缓冲液.然而为了获得有功能的蛋白质推荐用蛋白酶切割标签.该系统可用于纯化的重组蛋白质来源包括细菌,哺乳细胞和杆状病毒感染的昆虫细胞抽提物.该系统经常与第二标签联用.RNa酶A高度灵敏的荧光底物的发现使得该系统可用于与高通量筛选联用的检测.

2. 融合蛋白的切割

为了对目的蛋白进行生化及功能分析，通常要从目的蛋白上去除fusion tag部分。亲和标签的存在可能影响待研究蛋白的重要特性或功能.很早就已建立了数种对融合蛋白进行位点特异性裂解的方法。化学裂解如溴化氰(Met↓)等，不但便宜且有效，往往还可以在变性条件下进行反应。但由于裂解位点的特异性低和可能对目的蛋白产生的不必要修饰，使这个方法渐渐被酶解法取代。酶解的方法相对来说反应条件较温和，更重要的是，普遍用于此用途的蛋白酶都具有高度的特异性。位点特异性蛋白酶(例如凝血酶、肠激酶、Xa因子和烟草蚀刻病毒(TEV)等)通常被用来切割融合蛋白。凝血酶在这三种中是特异性活性最高的，能够有效切质量比仅为1:2000的蛋白。Xa因子似乎对于切点周围的序列很敏感，经常会出现特异性位点切割不理想却发生别的位点被切割的情况。肠激酶的专一性是上述三种中最好的，但由于切割效率低（通常要求质量比达到1:10）而显得比较昂贵。在质量比比较高的酶切反应进行完后，通常要通过色谱法处理。比较方便可行的方法是采用生物素化凝血酶结合链亲和素琼脂糖一起使用。尽管没有一种蛋白酶完美无缺，凝血酶还算的上是活性高、专一性好的典型。蛋白的标签切割后不能降低蛋白质的活力. 另一个需要考虑的问题是：切割完成之后，是否需要去除蛋白酶。切割后蛋白酶的去除对于使用带亲和标签的重组蛋白酶或者生物素化的蛋白酶较为容易.生物素化的蛋白酶可通过Strep-tag/Strep-Tactin亲和层析直接加以纯化。

1．肠激酶由于专一识别5个氨基酸多肽(D-D-D-D-K-X1)并在赖氨酸的羧基上切割,是N末端融合通常选择的蛋白酶,在其他残基的不规则切割发生水平较低,这取决于蛋白质底物的构象(Choi et al.2001). 肠激酶轻链的分子量为26.3kDa. 一个单位定义为在23℃下切割50ug 融合蛋白在8小时内达到95%切割率所需的酶量.生化分析已经表明切割效率取决于D4K识别位点下游的X1 氨基酸残基.

蛋白酶是位点专一的蛋白酶,具有7个氨基酸残基的识别位点,序列为 E-XX-Y-X-Q-S, 切割在两个保守的谷氨酰胺和丝氨酸之间进行. X可以是各种氨基酸,但不是全部氨基酸都可行.最佳的切割序列为 E-N-L-Y-F-Q-S; .当TEV蛋白酶识别位点在两个结构域之间是结果最理想.当切割不理想时,插入增加结构灵活性的小连接肽可改善效率. 高专一性,多种底物的活力以及低温下的有效切割使TEV蛋白酶成为从融合蛋白移除标签的理想工具.

3.凝血酶是一种广泛用于切割标签的蛋白酶.切割可在20到37℃之间切割0.3到16小时.与肠激酶相反,Xa因子和凝血酶切割后,在目标蛋白C末端增加了两个氨基酸.凝血酶最佳的切割位点是X4-X3-P-R[K]-X1'-X2',这里X4 和 X3 是疏水氨基酸而X1'和 X2'是非酸性氨基酸.一些经常使用的识别位点是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F,和MY-P-R-G-N在X4-X3-P-R-G-X2'之间切割比在X4-X3-P-K-L-X2'更有效.其他识别位点是 X2-R[K]-X1', 这里X2 或者 X1'是甘氨酸.例如A-R-G和G-K-A,这里切割发生在第二个残基后.在凝血酶切割位点和N末端标签之间插入五个甘氨酸残基可改善切. 通过这一"甘氨酸连接肽"只需较少酶量就可达到完全切割,而且也可以避免可能发生的错误切割.有效的消化缓冲液是纯的Tris缓冲液,pH8.0.在缓冲液中存在的NaCl具有抑制作用.凝血酶可从切割产物中用p-氨基琼脂糖亲和纯化,或者supero-12 FPLC 柱凝胶过滤或者苯甲脒琼脂糖移去.

4.在标签和目标蛋白之间的Xa因子识别位点可作为有效的工具完全去除N末端的亲和标签.Xa因子在四氨基酸肽I-E[D]-G-RX1的羧基切割, 这里X1可以是除了精氨酸和脯氨酸以外的其他氨基酸.切割可以在4到25℃之间进行.绝大多数Xa因子的分子量大约43 kDa,由两个二硫键连接的多肽组成,一条27 kDa,一条 16 kDa.在 SDS-PAGE,还原的肽链具有30 kDa 和20 kDa的表观分子量. 通过位点专一的蛋白酶如Xa因子切除标签有时候是无效的,有Xa因子切割非专一的报导.原因可能是融合蛋白的不溶性或者变性剂的存在.可通过引入5个氨基酸的多聚甘氨酸区域来增加切割.丹磺酰氯-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-氯甲基酮在室温下1分钟内可使Xa因子活性不可逆失活95%.虽然由于切割需要更长的孵化时间而且效率较低而使Xa因子越来越少使用,但仍有使用Xa因子的成功报导。

裂解融合蛋白以除去fusion tag

IMPACT系统的推出是融合表达系统的一个重大突破。该系统最大的优点是表达的融合蛋白无需蛋白酶裂解即可实现目的蛋白与fusion tag的精确切割。IMPACT(Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag)系统利用一个来源于枯草杆菌的5kDa大小的几丁质结合域（chitin binding domain，用于亲和纯化）和一个来源于酵母intein蛋白质组成一个双效的fusion tag，再与克隆到多克隆位点的目的基因融合表达。Intein是一个蛋白质剪接元件，类似于基因组中的内含子intron在RNA的剪接中所起的重要作用，intein在较低的温度和还原条件下发生自身介导的N端裂解，可以释放出与之相连的目的蛋白。也就是说融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4度）条件下用含DTT，或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将fusion tag留在纯化柱上。而还原剂的小分子可以非常简单的去除。该系统的出现是融合表达系统的重大突破，完全避免了蛋白酶的使用，不但可以有效降低成本，提高效率，也避免了蛋白酶与目的蛋白的分离纯化的麻烦。

随后推出的IMPACT-CN系统提供了两种选择，即fusion tag可以选择在目的蛋白的C端或者N端，使克隆或表达都能满足不同需要。但是这一系统仍然有一个缺陷，那就是含有较多二硫键的蛋白不适用这一系统，因为还原剂的存在会破坏/影响蛋白的二级结构。

IMPACT—TWIN的推出为我们带来了更大的惊喜。在多克隆位点的两端各有一段intein和几丁质结合域的fusion tag，提供了三种选择：1、在克隆时切掉N端的fusion tag 1，插入目的基因，同原来的系统一样，可以在表达产物挂上亲和纯化柱后加入还原剂，将目的蛋白从fusion tag上解离并洗脱下来，得到的目的蛋白C端带有硫酯键，可以直接用于连接一个标记物、非编码氨基酸或者另一个蛋白；2、在克隆时切掉C端的fusion tag 2并插入目的基因，当表达产物挂上亲和纯化柱时只需要改pH值和温度（pH7, 25度）即可将目的蛋白从fusion tag上解离并洗脱下来。这不但避免了蛋白酶的使用，更重要的是也避免了还原剂对含丰富二硫键的蛋白二级结构的破坏。由于调节缓冲液的pH值非常方便且无需另外去除洗脱产物中的还原剂，这大大地简化了目的蛋白的纯化过程，也扩大了该系统的应用范围。3、可以将目的基因插入两个fusion tag之间，这样表达产物的两端都含有fusion tag，当产物挂上亲和纯化柱并经过两级洗脱后，由于目的蛋白两端分别有一个硫酯键和半胱氨酸，可以自身环化得到环形蛋白。

结论

亲和标签在蛋白质纯化过程中时很重要的,可以有助于稳定蛋白质并提高其溶解性.亲和层析 通常可以达到90-99%的纯度.纯化系统的选择取决于蛋白质本身及其进一步的应用.有时候 融合蛋白由于其标签没有暴露到表面而不能加以纯化.在变性条件下或者将标签置于蛋白质的另一个末端可以解决这个问题.在许多情况下,第二亲和标签用于第二步亲和层析以增加纯度.作为选择,一个标签用于纯化而另一个用于检测.如果两个不同的标签放在不同的末端,则全长产物可通过两步亲和层析得到.多个标签也是可能的,每一个标签用于特定的用途.多个标签还可以连续多步纯化达到高纯度.这些高度纯化的蛋白质使得检测蛋白质之间的相互作用成为可能. Xa因子、凝血酶、肠激酶、凝乳酶、胶原酶等蛋白酶都具有较长的底物识别序列(如在凝乳酶中为7个氨基酸)，从而降低了蛋白质中其他无关部位生断裂的可能性。选择一种合适的酶至关重要，要综合考虑酶的成本（这些蛋白酶价格一般都相当昂贵），反应时间，特异性，更重要的是蛋白酶本身能混入目的蛋白中，造成新的污染，提高纯化的复杂性。