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重组人肠激酶纯化方案

更新时间:2025-01-13 22:24:41 阅读:17 评论:0

2023年12月12日发(作者:七宝街)

重组人肠激酶纯化方案一、设计背景肠激酶是存在于哺乳动物十二指肠内的一种异源二聚体丝氨酸蛋白酶。分子质量为150ku,由1条115ku重链和1条35ku轻链组成,在pH值4.5~9.5、温度4~45℃范围内特异性水解蛋白底物。天然肠激酶由1条结构亚基(重链)和1条催化弧基(轻链)构成,两者通过1个分子间二硫键结合,结构亚基负责将催化亚基固定在小肠刷状缘膜上并引导它向肠腔移动,催化亚基可以特异性识别Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列并沿序列的羧基端切下,由于经BEK(即重组人肠激酶)裂解融蛋白所释放的目的多肽具有和野生型完全一致的N-末端氨基酸序列,因而可作为蛋白表达体系中融合蛋白的切割试剂。如将胰蛋白酶原活化为胰蛋白酶,从而启动各种酶原活化的级联。目前化工生产一般用稀酸法提取,此法的缺点是天然的肠激酶来源有限,并且提取分离的成本高,加之天然提取的肠激酶易为其它蛋白酶污染,造成切割融合蛋白的同时又降解了目的产物。而基因工程的方法具有低成本高纯度且易分离低污染的特点,因而运用基因工程的方法生产肠激酶广为应用。二、设计依据金属鳌合亲和层析介质,又称固定金属离子亲和色谱,其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu",z.n"',Ni",co,Fe"发生特殊的相互作用,能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质,从而达到分离纯化的目的。因此,偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合,但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。镍NTA亲和层析介质(Ni-NTA)具有特异性好、流速快的优点,颗粒粒度均匀,粒径小,并且鳌合镍更稳定,能耐受更高的还原剂,物理和化学稳定性好,批次重复性好。本产品已经螯合好镍离子,使用更方便。与大多蛋白的分离纯化方法类似,重组人肠激酶(BEK)可通过硫酸铵沉淀、DEAE柱、凝胶层析和透析等方法得到纯品。另外,运用组氨酸(Histidine,His)在蛋白末端进行标记,使用Nickel金属螯合柱亲和纯化这种低成本高效率一步分离蛋白的方法,也正广泛地运用到BEK的分离纯化。本方案依据蛋白质与金属离子亲和的原理设计了一种使用Ni2+螯合亲和层析填料纯化BEK的方案。三、提取方案(一)材料、试剂与仪器设备1.材料与试剂物料名称EDTA氢氧化钠Ni6FF(IDA)Tris氯化钠咪唑磷酸二氢钠磷酸氢二钠EDTA氢氧化钠Ni6FF(IDA)Tris氯化钠咪唑磷酸二氢钠级别ARARN/AARARARARARARARN/AARARARAR生产商西陇科学西陇科学汇研生物麦克林广东光华麦克林西陇科学西陇科学西陇科学西陇科学汇研生物麦克林广东光华麦克林西陇科学2.仪器与耗材仪器:紫外检测仪、层析柱(1L)、低温离心机(湘仪离心仪器有限公司)耗材:冻存管、培养皿、量筒、枪头、烧杯、标签等,由珠海冀百康生物科技有限公司提供。(二)纯化工艺流程图(三)纯化操作前准备工作1.层析柱装填填料:NiFocuro6FF(IDA)原理:NiFocuro6FF(IDA)是利用Ni2+与蛋白质侧链上的某些氨基酸(主要为组氨酸、半胱氨酸、色氨酸)相互作用而进行分离纯化,适用于His标签蛋白及与Ni2+具有相互作用的生物分子的分离纯化。NiFocuro6FF(IDA)的特点:a.快速、简单(一步纯化)。b.使用范围广、操作简单,适合重力柱和预装柱(蠕动泵或者层析系统)。c.多重选择,当Ni2+不能获得较好的应用时,可以螯合其它的金属离子进行使用(例如Cu2+、Zn2+、Fe2+、Co2+、Ca2+等)。备注:当螯合Ca2+时,避免使用磷酸盐缓冲液(会形成沉淀)。体积:0.5L。层析柱:5cm×50cm。填料装柱步骤如下:(1)取层析柱,拆卸柱头和柱尾,注意拆卸柱头前,需将密封阀拧松,然后缓慢将柱头拔出。柱尾同理。(避免将柱头拔断)(2)将层析柱冲洗干净,柱头,柱尾的膜需仔细清洗,然后用纯化水将层析柱润洗几遍(避免残留其他填料)。(3)润洗后先将柱尾装上,拧紧末端的密封阀,拧上螺丝,注意拧螺丝时需两两相对的拧(确保拧紧且拧入的长度一致,避免底部漏液)。(4)将层析柱固定于铁架台上,用水平仪打好水平(防止沉装填料时表面不平影响实验)。(5)先将层析柱内装入一定量的纯化水,用注射器从下端出液口吸出气泡,然后保留约1.5cm高的水(防止装填料前干柱子)。(6)向层析柱内加入填料,不断缓慢地沿层析柱口的边缘加入纯化水,待填料沉降高度约为层析柱的2/3,向填料上方加入纯化水至于柱口持平,夹柱下方出液口(防止处理柱头时干柱)。(7)将柱头所连接的进液管夹在蠕动泵上,排除管路内气泡。柱头膜上的气泡可用滴管吸去。(8)排去气泡后关停蠕动泵,将柱头缓慢装入柱子,注意装柱头时需保持填料平整。(9)装好柱头后按照和柱尾相同的方法拧紧螺丝,拧紧顶部的密封阀。(10)装好柱子后先用纯化水低流速冲柱,冲至填料紧实后可提高流速。若是已安装的层析柱,使用0.2MEDTA将金属离子螯和脱去之后再使用0.5MNaOH再生,然后后挂Ni2+(0.1M硫酸镍溶液),层析柱测定柱效合格后可重复使用。2.平衡液的配制(1)配方:50mMTris、1.6M氯化钠、40mM咪唑ph8.50±0.02。(2)配制量:5L3洗脱液的配制(1)配方:50mMTris、1.6M氯化钠、0.2M咪唑ph8.50±0.02。(2)配制量:2L(四)纯化步骤1.样品预处理(样品来自珠海冀百康生物科技有限公司发酵部门发酵培养的BEK发酵液)(1)经发酵所得发酵液进行离心,7000r/min,离心2-3次,每次10min;(2)测量离心上清的体积;(3)将离心后上清进行破碎均质,均质两到三次,每次10min;(4)均质后再次离心,取上清,测得体积,低温保存待用;(5)样品再上样前需将PH值调至与平衡液一致上样。2.纯化流程(1)样品处理:Ni6FF:样品加10mM咪唑,调pH至8.00上样。(2)平衡:将用平衡液将装填好的Ni柱,用平衡液平衡2-3倍柱体积,流速为1-2CV/h,直至紫外检测UV值到基线平稳。目的是使柱内的液体环境变为填料的吸附最优条件,使吸附力最大化,以保证产品的利用率以及后续实验纯度,避免因吸附不完全而导致实验结果出现误差。(3)上样:平衡结束后按1-2CV/h流速上样,载量为(65U/ul)/ml填料。上样时需注意盛放样品的容器应大小适宜防止有空气从管路进入导致柱内有气泡,若不慎进入气泡,需先直接再生,而后将柱子重新拆分,清洗柱头并重装填料,即从头开始实验。(4)再平衡:用平衡液再平衡2~3倍柱体积,流速为1-2CV/h,直至紫外检测UV值到基线平稳。平衡液需调定PH与管路内PH一致,防止因PH值不同而导致目标物不挂柱,导致实验失败。(5)洗脱:用平衡液和洗脱液量得各50ml将平衡液倒入与进液管相连的梯度洗脱缸中,梯度混悬仪的转速不宜过快,应保持较均速的搅动,保证由低浓度到高浓度后,进行梯度洗脱,洗脱10CV。控制流速1-2CV/h。当出峰时开始收集,视出峰图样进行分段收集(一般峰顶单独收集一个),以达到获得收集纯度最高时的浓度数据,待紫外检测UV值降至基线时结束收集。(6)再生:洗脱结束后使用0.2MEDTA脱Ni2+,用纯化水洗涤3-6CV,然后使用再生液再生2-4CV,纯化水冲至中性,流速为1-2CV/h。再生后的柱子如在短时间内仍需使用,则可将柱子两端管口夹紧,防止气泡进入或柱子内保存液流干;如不再使用,则将柱子拆洗,填料在确认再生完全后倒回原容器中。3.注意事项(1)样品预处理时应破碎均匀无沉淀。(2)低温保存样品。(3)实验过程中需注意流速一致。(4)时刻注意紫外检测基线。(5)记录紫外检测仪上的UV值。(6)记录实验数据如:平衡体积、上样量及时间、再平衡体积、透过体积、洗脱时间和体积、各收集的体积和出峰体积等。(7)各收集取样(若是分开收集需按体积比取样的要计算好取样量)(8)测定蛋白含量和后计算收率和纯度,。4.重组人肠激酶的电泳定性分析试验后收集的样品(SJ)送检电泳分析,收集品的条带清晰,未出现拖尾现象,与标准品所示条带位置一致,证实产物确为BEK。四、小结本设计采用Nickel金属螯合柱亲和纯化法纯化重组人肠激酶,此实施方案结合了前人的丰富经验,在实际操作步骤上对纯化条件加以细微改动,在整个纯化过程中,每一纯化步骤都非常重要。其中,由于上样量较多,为保证上样的条件,操作过程中再平衡时间应控制在两倍柱体积,保证上样挂柱。同时,对试剂的用量和上样量,再平衡及洗脱时间合理把握,最后制得重组人肠激酶。通过Nickel金属螯合柱亲和纯化这种一步分离蛋白的方法,严格按照设计方案步骤进行操作,并对BEK进行电泳分析,经验证,纯化所得产品与标准品的电泳图几乎一致,可以确定产物为重组肠激酶。五、附件材料图1.5cm*50cm层析柱MSY图2.紫外检测仪(嘉鹏)和蠕动泵(琪特)SJ图3.纯化后电泳图六、参考资料1.张向辉,谭树华,李泰明.肠激酶特点及其基因工程的研究进展[J]药物生物技术2005.05.16.2.张弨.重组牛肠激酶的克隆表达、纯化与活性测定方法研究[D].浙江大学.2019.3.孙自勇,陈均勇,陈新园,汪晶,田鹏鹏,吴盛,刘建宁.牛肠激酶轻链在毕赤酵母中的分泌表达、纯化和活性鉴定[J].南京大学学报(自然科学版),2004(01):41-48.4.宋晓彤.重组肠激酶包涵体的复性、纯化及其新型重组子的构建[D].天津大学,2008.

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标签:纯化   肠激酶   金属   蛋白   填料
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