花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果

2023年12月6日发(作者：小学写景作文)

花椒根腐病生防芽孢杆菌的筛选鉴定及定殖和防治效果

李姝江;朱天辉;谯天敏;韩珊

【摘 要】[目的]对花椒根腐病生防芽孢杆菌进行分离、筛选、定殖和防效评价,为开发高效、稳定、持久的生物农药提供理论与实践基础.[方法]采用稀释平板涂布法分离健康花椒根际土中的芽孢杆菌,利用点菌法和打孔法2次筛选拮抗效果最佳的芽孢杆菌,根据形态特征和生理生化试验对其进行初步鉴定,并测定其对1年生花椒根腐病的防治效果.用链霉素标记拮抗芽孢杆菌,并检测该菌在花椒根际及根内土壤中的定殖动态,以此为基础,运用灌根法对花椒根腐病进行预防和治疗处理,计算发病率、病情指数和防治效果.[结果]在分离获得的20株芽孢杆菌中,编号为B3的菌株拮抗作用最强,抑菌圈直径达26.0 mm,高温处理后仍具有活性,初步确定其为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus.盆栽试验结果表明,花椒根腐病发病率和病情指数随B3菌株发酵液稀释倍数增加而增加,B3发酵液原液至稀释200倍以下防治效果显著.定殖动态试验结果表明,无论病原菌存在与否,抗300 μg/mL链霉素的突变菌株均能在根际土壤和根内定殖,但根际土菌量大于根内,且早于根内达到峰值,随接种时间延长,定殖量下降并维持稳定.田间试验中,突变菌株B3无论预防还是治疗试验,均能发挥很好的效果,并优于原始菌株和化学农药双效灵.[结论]菌株B3能在花椒根际和根内很好地定殖、排挤病原物,具有对花椒根腐病进行生物防治的潜力和良好的发展前景.

【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2016(044)004

【总页数】9页(P114-122) 【关键词】花椒;根腐病;腐皮镰刀菌;芽孢杆菌;生物防治

【作 者】李姝江;朱天辉;谯天敏;韩珊

【作者单位】四川农业大学林学院,四川成都611130;四川农业大学林学院,四川成都611130;四川农业大学林学院,四川成都611130;四川农业大学林学院,四川成都611130

【正文语种】中 文

【中图分类】S435.73

花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)属芸香科花椒属植物，是一种重要的油料、香料、药材等多用途树种，在中国栽培的范围广、产量高[1]，为目前四川省内发展的主要经济林种之一。但花椒易受到根腐病[2]、流胶病[3]、锈病[4]和枯穗病[5]等20余种病害的危害，其中由腐皮镰刀菌(Fusarium solani (Mart)

Sacc.)[1-2]引起的花椒根腐病导致根系腐烂，地上部分叶片变小、枝条发育不全，最终导致整株枯死，严重影响花椒产量和品质，给花椒产业造成重大的经济损失。迄今对花椒根腐病病原鉴定及其生物学特性[1]、发生特点[2]及防治[6]研究较为广泛。蒋其军等[7]选用根腐净、福美双等药剂对该病进行田间防治，得到较好防效。化学防治虽是一种有效的防治手段，但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题，一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用[8]。而与环境友好的生物农药越来越受到人们的青睐，是未来农业可持续发展的重要组成部分[9-10]。花椒根腐病是一种土传根病，侵染循环尚不明显，发病土壤环境相对稳定，最适宜于生物防治。但目前有关花椒根腐病的生物防治，仅见朱天辉和杨启智[11]采用腐皮镰刀菌培养液诱导花椒抗根腐病的初步研究。

芽孢杆菌作为自然界中分布最为广泛且极易分离培养的一类细菌，具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力[12]。目前，在植物病害生物防治领域已得到广泛应用，如在辣椒[13]、水稻[14]、小麦[15]、烟草[16]等多种植物上显示出很好的防效，然而有关将花椒根际土壤中的芽孢杆菌应用于根腐病这一经济林木重大病害防治的研究尚未见报道。此外，成功的生物防治必须具备两个条件：生防菌能在引进位点有效地定殖，并且能在侵染位点表现出与离体测定时相同的拮抗作用[17]。因此，探索生防菌的定殖动态和消长规律成为生物防治研究的重要内容。本研究以健康花椒根际土中芽孢杆菌为筛选对象，通过初筛、复筛、盆栽试验获得目标菌株，经发酵培养后进行定殖动态和田间生物防治研究，以期为开发环保型生防制剂提供技术支撑。

供试花椒样品为1年生大红袍花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)苗木，由汉源清溪花椒种植林地提供，用四川于盆栽防效和定殖试验。

于四川汉源清溪花椒种植林地采集健康花椒根际土壤(表层10 cm以下)装入无菌样品袋带回实验室，用于芽孢杆菌的分离。

供试盆栽试验土壤采自四川省雅安市大兴镇林木育种基地，采样深度为0～30 cm，紫色土。土壤理化性质为：pH 7.1，全磷含量1.8 g/kg，全钾含量8.4 g/kg，全氮含量1.2 g/kg，速效磷含量25.32 mg/kg，速效钾含量35.36 mg/kg，碱解氮含量31.56 mg/kg，有机质含量24.3 g/kg。样土混合均匀后，装袋(5 kg/袋)，共计140袋，用体积分数0.1%甲醛溶液熏蒸灭菌。

供试病原菌为腐皮镰刀菌(Fusarium solani (Mart) Sacc.)，分离于四川汉源清溪花椒根腐病发病林地中发病花椒的根茎组织，由四川农业大学森林保护省级重点实验室提供。将该菌于25 ℃培养7～10 d后，收集其分生孢子，用无菌水稀释成105 CFU/mL，用于盆栽防效和定殖试验。

抗生素为纯度99.9%链霉素(streptomycin，Str)，购自上海生物工程有限公司。杀菌剂为20%双效灵，购自四川瑞进特科技有限公司。

采用稀释平板涂布法[18]。称10 g采集的根际土壤样品于盛有90 mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，充分混匀后制成土壤悬浮液，100 ℃水浴加热5 min。冷却后，无菌条件下取1 mL加入装有9 mL无菌水的试管中，充分混匀得到10-2的稀释液，按照此法依次稀释，分别获得10-3，10-4，10-5和10-6的稀释液，分别取各浓度土壤稀释液0.1 mL，将其涂布在LB培养基上，倒置在30 ℃恒温培养箱中，48 h后根据菌落形态特征，挑取单菌落进行平板划线，保存于斜面备用。

初筛：将斜面培养的产孢的腐皮镰刀菌用无菌水洗出分生孢子，用移液枪取1 mL加入无菌培养皿中，倒入45 ℃左右的PDA培养基15 mL，充分混合均匀，冷却后制成含菌平板。采用点菌法[19]，接种分离获得的芽孢杆菌，倒置在30 ℃培养箱中，24 h后观察有无抑菌圈产生。

复筛：将初筛筛选出的抑菌活性较强的芽孢杆菌菌株活化后分别接种于LB肉汤培养液中，30 ℃、120 r/min的摇床中培养24 h后，作为种子液以1∶1体积比加入含有葡萄糖的LB肉汤培养基，30 ℃、120 r/min的恒温摇床中培养48 h后取出，取上清液，3 500 r/min离心5 min，再取上清液用打孔法[20]进行抑菌试验，24 h后观察有无抑菌圈产生。

对筛选出的芽孢杆菌发酵液进行121 ℃、15 min高温处理，按照上述方法检测拮抗活性的有无。

根据菌体和菌落形态特征、革兰氏染色等，结合生理生化试验，参照《常见细菌系统鉴定手册》[21]进行鉴定。

取105 CFU/mL的腐皮镰刀菌分生孢子悬液50 mL，接种于1年生盆栽花椒苗木根系，7 d后用筛选出的生防菌采用1.3节中的方法发酵后，取其发酵液，分不同浓度(原液及稀释50倍、100倍、200倍、500倍、1 000倍)，采用灌根法[22]对花椒苗进行处理，每盆50 mL，并以无菌水和无菌培养液为对照，每处理10盆，30 d后进行病害调查统计，并计算发病率、病情指数和防治效果。病害分级标准：0级，根部健康；Ⅰ级，1/5以下侧根腐烂；Ⅱ级，1/5至1/3侧根腐烂；Ⅲ级，1/3至2/3侧根腐烂；Ⅳ级，2/3以上侧根腐烂甚至整株死亡。

发病率=(发病株数/总接种株数)×100%；

病情指数=[(各病级株数×代表级值)/(总株数×发病最高级的代表级值)]×100；

防治效果=[(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数]×100%。

原始菌株与突变菌株活化后，与病原菌对峙培养，30 ℃培养5 d，观察培养皿中有无拮抗带，记录拮抗带的宽度并计算抑制率，每处理重复3次。抑制率=(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100%。

参照周林等[23]的方法，将突变菌株在抗性平板上继代培养，每隔3 d转接1次，转20次后保存LB斜面，30 d后将保存于斜面的菌株分别转接于LB平板(含300

μg/mL链霉素)和LB培养液。观察LB平板上突变菌株的生长情况；LB培养液中的突变菌株培养24 h后，涂布于LB平板，然后用灭菌牙签随机挑取100个菌落点接种到含300 μg/mL链霉素的LB平板上，30 ℃培养3 d，以突变菌株所占百分比计算其稳定性。

田间防治试验在四川汉源清溪花椒种植林地进行。

预防处理方法为：选择1年生尚未发病花椒林地内的花椒苗木，用1.3节制作的原始菌株和1.6.1中筛选的突变菌株菌剂原液及二者的10倍、100倍、500倍、1

000倍稀释液灌根，每株100 mL，每处理30株，每年春季施用1次， 2011-2013年连续3年施用，以双效灵1 000倍液、无菌水和无菌培养液为对照。

治疗处理方法为：选择3年生发病花椒林地内的花椒植株，用1.3节制作的原始菌株及1.6.1中筛选的突变菌株菌剂原液和10倍、100倍、500倍、1 000倍稀释液灌根，每株100 mL，每处理30株，春、夏各1次， 2011-2013年连续3年施用，以双效灵1 000倍液、无菌水和无菌培养液为对照。

以上处理全部完成后80 d进行病害调查，分级标准为：0级，整株健康；1级，叶片变小、枝条发育不全；2级，整株死亡。按1.5节的方法计算发病率、病情指数和防治效果。

试验数据采用Excel 2007和SPSS 13.0软件分析处理，采用LSD法进行多重比较(P<0.05)。

根据菌落颜色、形态、光学特性以及是否产生色素等特征进行合并后，从花椒根际土壤中共分离获得20株生防芽孢杆菌(表1)。采用点菌法进行拮抗测定发现，20株芽孢杆菌均有一定的抑菌作用，其中B2、B3和B20 3株芽孢杆菌对花椒根腐病菌具有较强的拮抗作用，抑菌圈直径均达到10.0 mm以上。B3菌株拮抗作用最强，抑菌圈直径均达到20.0 mm以上，其次是B2和B20，抑菌圈直径均达到13.0 mm以上，显著高于其他菌株。B11抑菌圈直径最小，仅为4.0 mm。

采用打孔法进一步复筛，结果表明B2、B20基本不产生抑菌圈，而B3菌株抑菌圈直径达到26.0 mm，说明B3对腐皮镰孢病菌具有较好的抑制作用。B3发酵滤液经过121 ℃高温处理15 min后仍具有拮抗活性(抑菌圈直径为9.0 mm)，说明B3菌株具有耐热性。

B3菌株经LB琼脂平板培养24 h后，菌落扁平，颜色为乳白色，不透明，表面略粗糙，呈白蜡状，质地软，略有光泽，无色素，外形不规则近圆形，中部突起，边缘不整齐。显微镜下革兰氏染色呈阳性，菌体呈杆状，末端钝，为短或长链，芽孢椭圆中生或近中。B3芽孢杆菌的生理生化特征见表2。表2结果表明，接触酶、硝酸盐还原、V-P反应、明胶液化、过氧化氢酶试验为阳性，苯丙氨酸脱氢酶、甲基红、马尿酸盐水解试验为阴性，可利用柠檬酸盐、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用木糖、甘露醇、阿拉伯糖、乳糖，厌氧、不能形成吲哚，5 ℃生长、50 ℃不生长。根据B3菌株菌落形态特征、革兰氏染色和生理生化特征测定结果，初步确定B3菌株为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus Frankland)。

由表3可以看出，接种B3发酵液30 d后，对花椒根腐病具有不同的防治效果，发病率和病情指数随稀释倍数的增加而增大，防治效果随稀释倍数的增加而降低。其中，无菌水和无菌培养液的对照花椒苗发病率高达94%以上，B3发酵原液至稀释200倍以下效果显著，特别是稀释50倍以下，可基本上控制病害不发生，而稀释500倍以上防治效果低于50%。

逐步增加链霉素质量浓度获得抗300 μg/mL的突变菌株B3，将原始菌株和突变菌株分别与腐皮镰刀菌对峙培养5 d后，测量拮抗带的宽度和病原菌直径，结果显示，突变菌株拮抗带宽度为1.57 cm，抑制率为77.20%；原始菌株拮抗带宽度为1.59 cm，抑制率为77.87%，二者无显著差异，说明突变菌株对病原菌仍有较强的抑制作用。

测定结果显示，继代培养后突变菌株在含300 μg/mL的LB平板上生长后形态和生长速度与原始菌株相似。选取100个菌落点接种后，突变菌株丢失率为0，说明所获得的突变菌株B3具有很好的抗药稳定性。

花椒根际和根内分离的突变菌株数量结果(图1)表明，根际和根内的定殖量和消长规律有显著差异，无论在有或没有腐皮镰刀菌存在的情况下，突变菌株B3均能在根际和花椒根内定殖。对比根际和根内的定殖量可知，根际土中菌量比根内更早达到峰值，下降维持稳定的菌量要远大于根内部，说明突变菌株B3更易于在花椒根际土中定殖生长。同时，1～80 d内无菌水处理的花椒根际和根内菌量都要显著高于病原菌处理。

图1A显示，在接种后1～80 d内病原菌处理与无菌水对照在根际的定殖动态变化规律相似，1～5 d内下降，5～10 d上升，10 d时达到最大值，之后下降，40～80 d内维持稳定状态。其中，10 d时无菌水处理的菌量为6.70×106 CFU/g，显著高于病原菌处理的菌量(3.32×106 CFU/g)，二者到80 d时仍有9.75×103

CFU/g和4.57×103 CFU/g的菌量。

图1B显示，接种后1～20 d内无菌水和病原菌处理花椒根内的菌量呈缓慢上升趋势，20 d时均达到最大值，分别为4.47×105 CFU/g和1.35×105 CFU/g，之后下降，40～80 d保持稳定，且差异不显著，80 d时根内仍然能检测到突变菌株B3，菌量分别为1.61×103 CFU/g和0.80×103 CFU/g。

原始菌株和突变菌株B3对花椒根腐病的田间预防效果见表4。

由表4可以看出，B3原始菌株和突变菌株菌剂原液、50～1 000倍稀释液沿根系幅面灌根，对花椒根腐病都有一定的预防效果，随稀释倍数的增大发病率和病情指数升高，而预防效果变差。无菌水和无菌培养液对根腐病无预防作用，发病率均超过30%。突变菌株原液稀释500倍以下的预防效果显著优于双效灵1 000倍液，而突变菌株1 000倍液与双效灵1 000倍液相当。相比而言，原始菌株菌剂稀释200倍以下的预防效果与突变菌株相同，但500倍和1 000倍稀释液发病率显著高于突变菌株，相应预防效果也较差；1 000倍稀释液的预防效果仅为52.34%，而突变菌株菌剂均超过80%。

由表5可以看出，B3原始菌株和突变菌株菌剂原液、50～1 000倍稀释液沿根系幅面灌根，对花椒根腐病都有一定的治疗作用，随稀释倍数的增大发病率和病情指数升高，而治疗效果变差。突变菌株菌剂稀释200倍以下的治疗效果显著优于双效灵1 000倍液，500倍稀释液与双效灵1 000倍液差异不显著，但均超过50%。而原始菌株菌剂稀释200倍以下治疗效果才高于50%，500倍和1 000倍稀释液的疗效显著低于突变菌株和双效灵1 000倍液。以上结果说明，在自然条件下，菌株B3对花椒根腐病既能治疗又能预防；无论在未发病还是已发病的花椒林地，突变菌株的防治效果均比原始菌株更好，更能适应环境并定殖及繁殖。

众多研究表明，细菌有着其他微生物所不具备的优点，如种类和数量庞大，繁殖快速，作用方式多样等，因此在植物病害生物防治中有着非常重要的地位。目前，已发现有18个属的细菌在植物病害生物防治上具有应用潜力[24]，特别是芽孢杆菌属(Bucillus)的细菌，由于其抗逆性强、商贮性好，更是受到生防工作者的重视。其中，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是土壤中的优势菌，不仅能防治植物病害，而且还能促进植物生长，属于目前研究比较多的植物根际促生菌[25]。本研究所分离的蜡样芽孢杆菌对花椒根腐病菌拮抗作用强，能抗高温，易繁殖，是一种极具开发价值的生防菌。但刘国红等[26]指出，芽孢杆菌属细菌的表型特征范围较广泛，较难准确对其进行属种确定，因而结合张艳东等[27]的报道，还应对所得B3菌株进行16S rDNA鉴定进而印证本研究的菌株分类鉴定结果。

植物根标存在大量的有益微生物，现已从多种植物根际分离到对病害具有良好抑制效果的微生物[28-29]。但是，生防菌在植物根际或根部有效定殖是防治根部病害成功与否的关键[17]。将DNA和RNA探针[30]、基因标记[31]、荧光显微镜[32]等方法应用于生防微生物在植物根部定殖均已见报道；利用抗生素标记具有经济、简便、快速等优点。周林等[23]以链霉素标记枯草芽孢杆菌，检测其在香蕉体内及根际的定殖动态，获得理想效果。本试验使用链霉素标记也成功获得蜡样芽孢杆菌B3抗300 μg/mL链霉素的突变菌株，经与原始菌株比较拮抗活性、稳定性发现，其性状稳定，拮抗活性较优。在定殖和消长动态测定中，B3突变菌株在根际土中定殖量大于根内，且达到峰值的时间早于根内。这与刘庆丰等[33]关于枯草芽孢杆菌在大白菜根围的定殖结果相似，生防菌从根际土拓展到根系内部是一个渐进的过程，在此过程中可能受到诸多因素影响，如植物与土壤的相互作用、土壤温度、湿度、植物气孔开放程度等。此外，本研究结果仅是利用灌根法接种B3突变菌株，结合孙建波等[22]、周林等[23]的报道，说明该菌株可主动穿过根皮层进入花椒体内，显示出较强的定殖能力。再者，无论环境中有无病原菌存在，该突变菌株均能很好地定殖于花椒的根系和根际土中，有利于其在根部占据有利生态位点，这为抑制花椒根腐病菌奠定了良好的基础。因此，将定殖能力与拮抗活性相结合，可作为优良高效持久的生防菌筛选的重要指标。

蜡样芽孢杆菌应用于植物病害生物防治时都要经过发酵使细胞富集，进而可以直接制成活菌制剂，但是在实际应用过程中，菌株效能不稳定是制约其开发的重要条件之一。本研究利用突变菌株进行田间防治试验，取得了优于原始菌株及化学农药(双效灵)的预防和治疗效果，结合定殖结果来看，突变菌株B3可能更适应自然环境，能更好地定殖、排挤病原物，其防效更持久、稳定，具有良好的应用前景，可成为防治花椒根腐病的一种新途径。

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