密码子优化的蛋白酶k在毕赤酵母中的表达及分离纯化

2023年12月4日发(作者：国庆节作文600字作文)

大连理工大学学位论文独创性声明作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。学位论文题目：瓷塑查逝笾黯西睦垡查噬昼垫氇幽盔纽鱼作者签名：垫：丛数日期：丝咝年—上月—Ｉ坦日大连理一大学专业学位硕十学位论文摘要蛋白酶Ｋ是由林伯氏白色念球菌（ＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒ）分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酶，具有较高的蛋白水解活性。蛋白酶Ｋ多用于一些生化实验中，如在核酸提取中，可以除去核酸中的ＤＮＡ酶和ＲＮＡ酶；在原位杂交中，蛋白酶Ｋ具有降解包围靶ＤＮＡ蛋白质的作用，可以用来处理杂交前的样本，提高检测的敏感性。现在商业化供应的蛋白酶Ｋ主要由林伯氏白色念球菌分泌获得。林伯氏白色念球菌生长缓慢，难以高密度培养，蛋白酶Ｋ的产量较低。另外，林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。本实验利用毕赤酵母表达系统，实现了蛋白酶Ｋ的分泌表达，省去了细胞破碎，ＤＮＡ沉淀等步骤，提高了产物的回收率。为了提高蛋白酶Ｋ的表达量及简化分离纯化工艺，本实验对蛋白酶Ｋ密码子进行了优化，将蛋白酶Ｋ的密码子都变成了毕赤酵母偏爱的密码子，并在目的基因３’端加上六个组氨酸标签，然后利用人工合成的方法获得目的基因。实验构建了蛋白酶Ｋ酵母表达载体，将其导入毕赤酵母ＧＳｌｌ５中实现了分泌表达，分泌的蛋白酶Ｋ可以利用Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析柱进行分离纯化，减少了分离纯化步骤，提高了蛋白酶Ｋ的收率。由于发酵条件对产物的表达量有很大影响，实验对诱导温度、ｐＨ、诱导剂浓度及诱导时间等条件进行了优化，确定最佳发酵条件。利用优化的条件进行５Ｌ发酵罐发酵，并通过测定了茵体生长曲线来确定开始诱导时间。在下游分离纯化中，利用三种方法进行纯化，通过比较这三种纯化方法的酶收率及比活，确定最佳的纯化方法。结果表明，ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ表达载体构建正确，并实现了在毕赤酵母中的分泌表达。通过摇瓶发酵确定的最佳发酵条件为甲醇量Ｏ．７５％，温度２５℃，ｐＨ７．０，诱导时间为１４４ｈ。利用优化的条件进行５Ｌ发酵罐发酵，蛋白酶Ｋ表达量可以达到２．２ｇ／Ｌ，比目前现有蛋白酶Ｋ工业生产方法的产率（０．３－０．５∥Ｌ发酵液）高４—７倍。最后，通过比较三种纯化方法的酶收率及比活，可以看出，将去菌体后的发酵液直接通过Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析柱层析，－ＩＤＡ得到较好的纯化效果，无需对去菌体后的发酵液进行前期处理，回收率可以达到８４％，酶的比活为１７５Ｕ／ｒａｇ。关键词：蛋白酶Ｋ：密码子优化：酵母表达系统：分离纯化蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化Ｈｉｇｈ－ｌｅｖｅｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚｅｄｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＡｂｓｔｒａｃｔＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｉｓａｌｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｓｅｒｉｎｅｈａｓｅｎｄｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｉｎｔｅｎｓｉｖｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂｙｔｈｅｆｕｎｇｕｓｒｅｓｅａｒｃｈＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒ．Ｉｔａｔｔａｃｔｅｄｉｎｔｅｒｅｓｔｆｒｏｍｔｈｅａｃａｄｅｍｉｃ，ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌａｎｄａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｉｓｏｂｔａｉｎｅｄｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙｉｎｌａｒｇｅａｎａｏｕｎｔｓｂｙａｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｆＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ口胁“ｍＬｉｍｂｅｒ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｍｂｅｒｉｓｓｌｏｗｌｙｇｒｏｗｉｎｇｆｕｎｇｕｓｗｈｉｃｈｏｎｌｙｓｅｃｒｅｔｅｓｓｍａｌｌａｍｏｕｎｔｓｏｆｐｒｏｔｅａｓｅｓｉｎｔｏｔｈｅｉｓｕｎｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｍｅｄｉｕｍ．Ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｏｎａｌａｒｇｅｓｃａｌｅ．ｉｍｐｒｏｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫａｎｄｓｉｍｐｌｉｆｙｔｈｅｏｎｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ，ｔｈｅｇｅｎｅｏｆｐｒｏｒｅｉｎａｓｅＫＷａｓｆｉｒｓｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄａｎｄｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｂａｓｅｄｔｈｅｐｒｅｆｅｒｒｅｄｃｏｄｏｎｕｓａｇｅｏｆＰｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｏｔｈｅｒｗｉｓｅ，ｔｈｅｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇｓｉｘｈｉｓｔｉｄｉｎｅＧＳ１１５．ＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｗａｓｇｅｎｅＷａｓｆｕｓｅｄｉｎｆｒａｍｅｗｉｔｈａｓｔｒｉｎｇｏｆｒｅｓｉｄｕｅｓ（Ｈｉｓ６－Ｔａｇ）ａｎｄｔｈｅｎｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄｉｔｉｎｔｏＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓｓｅｃｒｅｔｏｒｙｆｏｒｍｉｎＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５、ｗｈｉｃｈｓｅｃｒｅｔｅｄａｓａｓｉｍｐｌｉｆｉｅｄａｓｔｈｅｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓ．Ｂｅｆｏｒｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｓｕｃｈｔｈｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈａｎｏｌ，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｐＨａｎｄｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｗａｓＷｅａｌｓｏｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｒｅｅｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｐｕｒｉｆｙｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｏｐｔｉｍｉｚｅｄ．ａｎｄｓｄｅｅｔｔｈｅｂｅｓｔｏｎｅ．１１１ｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ．ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｔｈｅｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＣａｌｌｂｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙｔｈｅＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓＧＳ１１５ａｓａｓｏｌｕｂｌｅｆｏｒｍ．１１１ｅｏｐｔｉｍａｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｏｆｍｅｔｈａｎｏｌＯ．７５％，ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ２５＂Ｃ，ｐＨ７．０．ＵｎｄｅｒｔｈｅｏｂｔａｉｎｅｄＷａｓａｂｏｕｔｏｐｔｉｍｉｚｅｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，ｔｈｅｆｉｎａｌｙｉｅｌｄｏｆ２．２９ｐｅｒｌｉｔｅｒｏｆｃｕｌｔｕｒｅ．ＢｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｔｈｅｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌｓｕｐｅｍａｔａｎｔｆｒｏｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｐｕｒｉｆｙｉｎｇｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ，ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｔｈａｔｂｒｏｔｈｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＷａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉ－ＮＴＡａｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｄｉｒｅｃｔｌｙｉｓｔｈｅｂｅｓｔｏｎｅ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｒｏｔｅｎｉａｓｅＫ；ｙｅａｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｙＳｔｅｍ；ｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ大连理：］！大学专业学位硕士学位论文目摘Ａｂｓｔｒａｃｔ录要………一…………………………………………………………………………………………………Ｉ．…．…．…．．…．…．…．…．……．．…．……．…．．…．…．．…………．．…．．………．……………．……．．…．ＩＩ引１言……………………………………………………………………………………………………．．．１．文献综述…………………………………………………………………………．．２．１．１蛋白酶Ｋ的研究进展……………………………………………………．．２．１．１．１蛋白酶Ｋ的发现…………………………………………………一２．蛋白酶Ｋ的酶学特性……………………………………………一３．１．１．２蛋白酶Ｋ的分子生物学研究……………………………………一２．１．１．３１．１．４蛋白酶Ｋ的应用…………………………………………………一４．１．１．５蛋白酶Ｋ的生产现状及研究进展………………………………一６．１．２酵母表达系统……………………………………………………………一７．１．２．１酵母表达系统的优点………………………………………………．７．１．２．２毕赤酵母的生物学特性……………………………………………．８．１．２．３巴斯德毕赤酵母表达系统宿主茵…………………………………．８．１．２．４毕赤酵母表达系统载体种类………………………………………．９．１．２．５影响外源基因高效表达的因素…………………………………．．１２．１．３２２．１本实验的研究目的及意义……………………………………………一１３．目的基因的获得及ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表达载体的构建……………………一１５．引言………………………………………………………………………………………………．１５．２．２实验材料与试剂…………………………………………………………．１５．２．２．１材料和试剂………………………………………………………．．１５．２．２．２２．２．３２．３实验仪器…………………………………………………………．．１６．主要溶液剂配制方法……………………………………………．．１６．蛋白酶Ｋ密码子的优化及人工合成……………………………．１６．ｐＰＩＣ９Ｋ载体及目的基因的双酶切………………………………．１７．酶切产物的回收…………………………………………………．．１７．ｐＰＩＣ９Ｋ载体与目的基因的连接…………………………………．１８．Ｅ．ｃｏｌｉ实验方法…………………………………………………………………．１６．２．３．１２．３．２２．３．３２．３．４２．３．５ＤＨ５ａ感受态的制备………………………………………．１８．２．３．６连接产物的转化及鉴定……………………．……………………．１９．２．４实验结果与讨论…………………………………………………………．２０．３４蛋白酶Ｋ的分离纯化……………………………………………………………．４４．蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化２．４．１优化后蛋白酶Ｋ密码子序列……………………………………．２０．２．４．２ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ表达载体的构建及鉴定…………………………．．２１－２．５小结………………………………………………………………………．２３．蛋白酶Ｋ在毕赤酵母中的分泌表达及条件优化……………………………一２４．３．１前言………………………………………………………………………………………………．２４．３．２实验材料与试剂…………………………………………………………．２４．３．２．１材料与试剂………………………………………………………．．２４．３．２．２主要实验仪器……………………………………………………．．２４．３．２．３主要试剂及配制方法……………………………………………．．２５．３．３实验方法…………………………………………………………………．２６．３．３．１ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒的线性化及质粒的纯化……………………．．２６．３．３．２毕赤酵母感受态的制备及转化…………………………………．．２７．３．３．３高拷贝阳性转化子的筛选及ＰＣＲ鉴定…………………………．２８．３．３．４蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳鉴定及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析………．２９．３．３．５蛋白酶Ｋ活性测定………………………………………………．３２．３．３．６摇瓶中蛋白酶Ｋ表达条件的优化………………………………．３３．３．３．７发酵罐中蛋白酶Ｋ的诱导表达及浓度测定……………………．３４．３．４实验结果与讨论…………………………………………………………．３５．３．４．１毕赤酵母的电转化及阳性高拷贝转化子的筛选………．………．３５．３．４．２蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳鉴定及活性测定…………………．３７．３．４．３蛋白酶Ｋ样品的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析……………………………．３８．３．４．４诱导时间对蛋白酶Ｋ表达量的影响……………………………．３８．３．４．５诱导剂浓度对蛋白酶Ｋ表达量的影响…………………………．３９．３．４．６诱导ｐＨ对蛋白酶Ｋ表达的影响………………………………．．４０．３．４．７诱导温度对蛋白酶Ｋ表达量的影响……………………………．４１－３．４．８发酵罐发酵表达蛋白酶Ｋ………………………………………．．４２．３．５小结………………………………………………………………………………………………．４３．４．１引言………………………………………………………………………………………………．４４．４．２实验材料与试剂…………………………………………………………．４４．４．２．１材料和试剂………………………………………………………．．４４．大连理工大学专业学位硕十学位论文４．２．２主要实验仪器……………………………………………………．．４４．４．２．３主要溶液及配制方法……………………………………………．一４５．４．３实验方法…………………………………………………………………．４５．４．３．１硫酸铵梯度沉淀…………………………………………………．．４５．４．３．２透析……………………………………………………………………………………．．４５．４．３．３４．３．４Ｎｉ．ＮＴＡ亲利层析柱层析………………………………………一４５．ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析……………………………………………．．４６．４．３．５三种纯化方法对蛋白酶Ｋ的纯化………………………………．４７．４．３．６纯化后样品收率及比活的测定…………………………………．．４７．４．３．７菌株遗传稳定性分析……………………………………………．．４８．４．４实验结果与讨论…………………………………………………………．．４８．４．４．１４．４．２４．４．３蛋白酶Ｋ的硫酸铵梯度沉淀……………………………………．４８．Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析分离蛋白酶Ｋ………………………………一４８．三种纯化方法的比较……………………………………………．．４９．４．４．４菌株遗传稳定性分析……………………………………………．．５０．４．５小结…………………………………………………．…………………………………………．．．５１．结论与展望…………………………………………．．：……………………………一５２．参考文献…………………………………………………………………………．５４．附录Ａ优化前后蛋白酶Ｋ基因序列比较及氨基酸序列………………………．５９．攻读硕士学位期间发表学术论文情况……………………………………………．．６０．致谢………………………………………………………………………………．．…………………．．６１．大连理工大学学位论文版权使用授权书…………………………………………．．６２．大连理工大学专业学位硕士学位论文引言丝氨酸蛋白酶是以丝氨酸为活性中心的蛋白水解酶，在生物体内起着重要的作用。蛋白酶Ｋ属于丝氨酸蛋白酶类，是由林伯氏白色念球菌分泌的一种重要的蛋白酶，在生化实验、洗涤行业及污水处理等方面有较高的应用价值。目前商业上供应的蛋白酶Ｋ主要是通过林伯氏白色念球菌分泌得到，向培养基中加入大豆粉、奶粉或ＢＳＡ等作为氮源，在菌体进入生长稳定期后就会分泌蛋白酶Ｋ。但是由于林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶Ｋ产量低，并且对林伯氏白色念球菌进行基因操作也比较困难，很难实现蛋白酶Ｋ的高效大规模生产。林伯氏白色念球菌还会分泌其他的蛋白酶，也增加了蛋白酶Ｋ分离纯化的难度。传统的分离纯化方法一般经过超滤．阳离子柱．超滤．阴离子柱等过程，由于纯化步骤复杂，导致酶收率较低，目前工业生产蛋白酶Ｋ的产率为０．３．０．５∥Ｌ发酵液。生产蛋白酶Ｋ的成本较高，这对蛋白酶Ｋ的大规模应用带来了一定的限制。因此利用基因工程技术，通过对蛋白酶Ｋ基因的改造，实现高效表达，简化分离纯化步骤是现阶段的研究重点。利用基因工程技术，将外源基因导入微生物、动物或植物体内实现大量表达，已成为现阶段蛋白大量表达的一种趋势，具有广阔的发展前景。由此发展起来的外源基因表达系统包括原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统等已广泛应用于多种外源基因的表达。由于不同的表达系统在表达周期、蛋白表达量、蛋白加工修饰及操作难易层度等方面存在着很大差异，所以根据外源蛋白的特性及应用目的来选择合适的表达系统。毕赤酵母表达系统是上世纪８０年代初期发展起来的一种重要的外源蛋白表达技术，据报道已有５００多种外源蛋白利用该表达系统成功表达。这种表达系统具有操作简单，表达量高，可以进行糖基化修饰，分泌表达等优点，并且毕赤酵母可以高密度培养，也便于工业化生产。但酵母表达系统中产物表达量受多种因素的影响，如温度、ｐＨ、诱导剂浓度、诱导时间等，除此之外，外源基因密码子序列对产物表达量也有较大的影响。因此，为了得到较高的产量，还需对发酵条件及密码子序列进行优化。本实验利用毕赤酵母表达系统，实现了蛋白酶Ｋ的分泌表达，并通过密码子优化及发酵条件优化提高了蛋白酶Ｋ的表达量。通过基因操作技术，在蛋白酶Ｋ基因的３’端加上六个组氨酸标签，可以将去菌体后的发酵液直接通过Ｎｉ－ＮＴＡ亲和层析柱层析，减少了纯化步骤，提高了酶收率。为工业化生产蛋白酶Ｋ提供了一定的理论依据。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化１文献综述１．１蛋白酶Ｋ的研究进展１．１．１蛋白酶Ｋ的发现林伯氏白色念球菌（ＴｒｉｉｔｉｒａｃｈｉｕｍａｌｂｕｍＬｉｌｎｂｅｒ）属于丛梗孢科，真菌。当培养基中加入外源性氮源如蛋白胨、酵母提取物、奶粉或大豆粉等，该菌体会分泌多种蛋白酶。而一些无机氮源如铵盐、蔗糖等会对产物的表达起到抑制作用…。蛋白酶Ｋ就是由由林伯氏白色念球菌分泌的一种重要的丝氨酸蛋白酬２１。研究发现，在菌体生长进入稳定期后，蛋白酶Ｋ才开始分泌【３１。早在１９７４年ＷｏｌｆｇａｎｇＥｂｅｌｉｎｇ［４】等利用结晶、色谱层析等方法在林伯氏白色念球菌的培养基中分离纯化出了蛋白酶Ｋ，并测定其分子量为１８５００－士５００Ｄａ，随后在１９８６年Ｋｌａｕｓ．ＤｉｅｔｅｒＪａｎｙｔ５】等通过分析蛋白酶Ｋ的氨基酸序列，精确测定出蛋白酶Ｋ的分子量为２８９３０Ｄａ。自从蛋白酶Ｋ被发现以后，人们对蛋白酶Ｋ的结构及性质作了一系列研究。通过对蛋白酶Ｋ结构与性质的研究，发现蛋白酶Ｋ活性位点处的结构与枯草芽孢杆菌有较高的同源性，所以蛋白酶Ｋ也属于枯草杆菌蛋白酶类家族ｆ５，６１。蛋白酶Ｋ作为丝氨酸蛋白酶，具有广泛的底物特异性和较高的蛋白水解活性，能够优先水解与含硫巯基、疏水性氨基酸、芳香族氨基酸Ｃ末端相连的肽键和脂键，可以用来降解蛋白质生成短肽【Ｊ７’９］。蛋白酶Ｋ对天然蛋白质和非天然蛋白质都有较高的蛋白水解活性，并且这种酶在含有尿素或ＳＤＳ的环境中仍有较高的活性［１们，正是由于蛋白酶Ｋ的这一重要性质，蛋白酶Ｋ已在生物实验【１１｜、洗涤行业及污水处理等方面得到广泛应用。１．１．２蛋白酶Ｋ的分子生物学研究通过对蛋白酶Ｋ碱基序列的分析，结果表明蛋白酶Ｋ基因包括两个外显子和一个６３ｂｐ的内含子。两个外显子编码一个１５个氨基酸的信号肽，９０个氨基酸的前导肽和２７９个氨基酸的蛋白酶Ｋ的成熟肽。在蛋白酶Ｋ前体转录翻译运输至内质网后，前导肽被切除，酶原前体转变成成熟的蛋白酶Ｋ［１２１。蛋白酶Ｋ结构中还含有两个二硫键和一个自由的半胱氨酸【５】。通过Ｘ射线衍射技术分析蛋白酶Ｋ的三维空间结构，数据表明蛋白酶Ｋ呈球状结构（图１．１），是由１５个Ｂ折叠股、６个ａ螺旋、和一个３／１０螺旋构成。球体内部是由两个ａ螺旋和一个由９个６折叠股构成的平行￥结构构成，这两个ａ螺旋埋于蛋白酶Ｋ内部，由其他四个两性ａ螺旋包围。球体外部是由四个ａ螺旋和三个分别由两个Ｂ折叠股构成的反平行Ｇ结构构成。大连理：ｌ：火学专业学位硕十学位论文蛋白酶Ｋ属于丝氨酸蛋白酶【６】，是丝氨酸家族中活性最高的一种酶【１３］。丝氨酸蛋白酶类家族包括胰蛋白酶类和枯草杆菌蛋白酶类两大家族，一般的枯草杆菌蛋白酶类不含有二硫键，但是蛋白酶Ｋ的氨基酸序列及三维空间结构都与枯草杆菌蛋白酶类有高度的相似性，所以蛋白酶Ｋ也归为枯草杆菌酶类家族。但是正是由于这两个二硫键的存在，蛋白酶Ｋ比其他的枯草杆菌蛋白酶具有更高的稳定性【１４］。ｌ图１．１Ｆｉｇ．１．１蛋白酶Ｋ分子三维空间结构【ｌ副ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫＴｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒ１．１．３蛋白酶Ｋ的酶学特性蛋白酶Ｋ是枯草杆菌蛋白酶类中具有较高活性的一种丝氨酸蛋白酶，具有较广的切割活性，可以切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键。通过测定蛋白酶Ｋ在不同ｐＨ环境及不同温度条件下的水解活性，结果显示在ｐＨ范围为７．５－１２．０内蛋白酶Ｋ都具有较高的蛋白水解活性，一般条件下蛋白酶Ｋ使用的ｐＨ范围是７．５－９．０之间。蛋白酶Ｋ在２０－６０℃之间活性都可以达到８０％以上，但在３７℃时酶活性最高。蛋白酶Ｋ与其他蛋白酶的区别还在于该酶在含有ＴｒｉｔｏｎＸ．１００、尿素或ＳＤＳ的环境中仍能稳定存在且具有活性【ｌ６｜，这一特性使它的应用很广泛。蛋白酶Ｋ具有丝氨酸蛋白酶所具有的催化三联体Ａｓｐ３９．Ｈｉｓ６９．Ｓｅｒ２２４结构，，在这个结构中，Ｓｅｒ２２４的主要作用是进行亲核攻击，而Ｈｉｓ６９在不同的阶段可以作为质子受体或供体，Ａｓｐ３９的作用可能是将Ｈｉｓ６９正确定位来辅助Ｓｅｒ２２４进行亲核攻击【ｌ５１。分子动力学模型揭示了Ｈｉｓ６９与Ａｓｐ３９之间的静电作用要比Ｈｉｓ６９与Ｓｅｒ２２４之间的静电作用强，这也使Ｈｉｓ６９与Ａｓｐ３９之间的结合更稳定和牢固【ｌ‘Ｌ１８】，这种结构可能有助于电子的蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化传递，对三联体中咪唑集团的正确定位有重要的作用。而Ｈｉｓ６９与Ｓｅｒ２２４之间较弱的静电作用，可以使Ｓｅｒ２２４有较大的空间自由度，这有助于Ｓｅｒ２２４接受质子或进行亲核攻击，进而释放水解后的蛋白产物。蛋白酶Ｋ结构中含有两个Ｃａ２＋结合位点，虽然这两个结合位点与酶的活性中心有一定距离，但研究发现Ｃａ２＋对蛋白酶的活性具有一定的作用。用ＥＤＴＡ去除去ｃＥ＋后，发现蛋白酶Ｋ的活性只保留了原来活性的２０％，但是这种活性的降低具有一定的可逆性，当去除ＥＤＴＡ．Ｃａ２＋复合体重新加入Ｃａ２＋后，蛋白酶Ｋ活性可以恢复至原来的２８％，但不会全部恢复活性【１９１。除去Ｃａ２＋还会降低蛋白酶Ｋ的热稳定性，这是由于除去Ｃａ２十后提高了蛋白酶Ｋ结构的灵活性，从而也降低了蛋白酶Ｋ的热稳定性及底物结合能力，但并不会影响酶的催化活性【２０１。除了Ｃａ２＋会影响蛋白酶Ｋ的活性及稳定性外，甘氨酸对蛋白酶的活性也有一定影响。在蛋白酶Ｋ的４０个保守区域中，其中有１３处是甘氨酸结合位点。根据研究报道，甘氨酸突变或缺失对蛋白酶的催化活性和底物特异性有很大的影响，这主要是因为甘氨酸对蛋白酶Ｋ结构的灵活性尤其底物结合部位的灵活性有很大作用【２¨。蛋白酶Ｋ三级结构呈球状，其内部结构是刚性的，比较稳定，而外部则是由多种环状结构构成，尤其在底物结合区。这种结构可以呈现出相当多的构象变化，有助于底物结合及催化，使得蛋白酶Ｋ比其他的枯草杆菌蛋白酶具有更广的底物特异性，这也符合底物契合模型理论。１．１．４蛋白酶Ｋ的应用（１）在核酸提取中的应用核酸分离纯化技术是分子生物学与生物化学实验中最常用的一项技术。在真核生物基因组中，ＤＮＡ通常缠绕在由组蛋白和其他非组蛋白形成的染色体上，并且被核纤层包裹，很难释放出来。由于蛋白酶Ｋ较高的水解活性，可以降解与核酸紧密结合的蛋白质，在核酸的分离纯化中起到重要的作用【２２埘］。蛋白酶Ｋ在较高温度及含有尿素、ＥＤＴＡ、及去垢剂如１％ＴｒｉｔｏｎＸ一１００或０．５％ＳＤＳ等的环境中仍具有酶活性，这在提取高分子量核酸时具有很好的效果【２５，２６】。由于蛋白酶Ｋ对核酸酶具有水解作用［２７，２引，所以在核酸提取过程中，蛋白酶Ｋ可以用来抑制核酸的降解。尤其对于提取ＲＮＡ作用更显著，因为ＲＮＡａｓｅ普遍存在于环境中，而ＲＮＡ极不稳定，特别容易被降解。ＲＮＡ的质量对于ｃＤＮＡ合成及蛋白的转录翻译、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印记杂交分析等实验的成败非常重要【２９】。ＳＤＳ可以抑制蛋白酶的活性，通常认为提取ＲＮＡ时，加入ＳＤＳ可以起到保护ＲＮＡ的作用，但是研究发现，ＳＤＳ对核酸酶的抑制作用不会使其彻底失活，当体系中除去ＳＤＳ后，ＲＮＡ还会被降解。由于蛋白酶Ｋ在含有ＳＤＳ的环境中也具有活性，所以提取ＲＮＡ时加入一定量的蛋白酶Ｋ大连理工大学专业学位硕士学位论文可以起到降解ＲＮＡａｓｅ的作用，对防止ＲＮＡ被降解具有明显的作用。并且在含有ＳＤＳ时，蛋白酶Ｋ的降解效果会更明显，这主要是因为ＳＤＳ并不会提高酶的活性，而是改变了底物的构象，使其更易被蛋白酶Ｋ降解【３０】。（２）在原位杂交中的应用在原位杂交技术中，蛋白酶Ｋ通常用来处理杂交前的标本，消化包围靶ＤＮＡ的蛋白质，以便于检测探针的穿透，提高检测的敏感性【３ｌ’３３１。但是蛋白酶Ｋ的浓度和消化时间都会影响杂交效果。浓度过高或消化时间过长，都会破坏细胞结构，出现细胞核消失及脱片等现象，影响核酸的结合。如在斑马鱼整体原位杂交实验【ｊｌｊ中对于４８ｈ胚胎用蛋白酶Ｋ消化３ｍｉｎ要比传统消化２０ｒａｉｎ的效果要好，组织比较完整，杂交信号高。若浓度过低或消化时间过短，则靶核酸不能有效地暴露，核酸结合效果也不好。如在用原位杂交技术及原位ＲＴ．ＰＣＲ技术检测苹果茎痘病毒在梨树组织中的分布时，利用蛋白酶Ｋ消化１０ｍｉｎ和１５ｍｉｎ的组织显色后，呈一片蓝色，说明消化不足；处理２５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ和４０ｍｉｎ的组织形态模糊，说明消化过度；处理２０ｍｉｎ的效果较好。由于蛋白酶Ｋ的活性与温度有很大关系，所以消化时间也和温度有关，蛋白酶Ｋ的最适温度为３７℃，在这一温度下消化时间较短，高于或低于这一温度，都会使消化时间增加。很多研究对蛋白酶Ｋ的浓度及消化时间进行了优化，但是由于组织结构的不同，也不能一概而论。（３）用于病毒的灭活现在对生活中污水的处理一般利用消毒剂如次氯酸钠、过氧化氢、过氧乙酸等。但是这些化学消毒剂对身体有一定害处，并且存在不便运输，对设备损害严重等问题【３４，３５】。病毒的外层结构主要是衣壳蛋白，衣壳蛋白保护病毒不受外界环境的影响，并且也决定病毒感染的特异性。蛋白酶可以破坏病毒衣壳蛋白，从而干扰病毒与宿主细胞的结合。有研究［３６】比较了蛋白酶Ｋ与工业蛋白酶对病毒的灭活能力，结果显示在适宜条件下，浓度为６７．５Ｕ／ｍＬ的蛋白酶Ｋ分别处理纯水和生活污水１ｈ，对病毒的灭活率分别为９９．４％和４９．４％，处理３ｈ的灭活率分别为＞９９．９％和８１．１％。而浓度为７５Ｕ／ｍＬ的工业蛋白酶对纯水处理１ｈ，病毒灭活率为７４．４％。这说明在污水处理方面蛋白酶Ｋ与其他工业蛋白酶相比还是具有很大优势。蛋白酶Ｋ不仅可以处理污水中的病毒，在农业生产中也可以作为生物防治剂防治病毒虫害【３７】。蛋白酶Ｋ作为消毒剂本身无害，而且不会产生有害的产物，是一种高效环保的方法。（４）在生物检测中的应用在研究传染性海绵状脑病和羊瘙痒病时，蛋白酶Ｋ可以用来检测脑组织样品中的致病性朊病毒蛋白。朊病毒（（ｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰ）是传染性海绵状脑病的病原体，正常情况下，该病原体在哺乳动物细胞内没有致病性，为细胞型朊病毒蛋白（（ｃｅｌｌｕｌａｒｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰＣ），当ＰｒＰＣ结构发生改变时，会形成病毒型朊病毒（ｓｃｒａｐｉｅｐｒｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＰｒＰＳｃ）。ＰｒＰＣ与ＰｒＰＳｃ的区别就在于在标准条件下，ＰｒＰＣ可蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化以被蛋白酶Ｋ完全消化，而ＰｒＰＳｃ只能部分被消化。因此可以检测经蛋白酶Ｋ消化后的组织，如果有没被消化的ＰｒＰＳｃ存在，则说明患有朊病毒病【３文３９］。（５）在其它行业的应用由于蛋白酶Ｋ较高的水解活性及较广的底物特异性，蛋白酶Ｋ在洗涤行业及皮革制品行业也具有较高的应用价值。另外，蛋白酶Ｋ还可以用于肉类的嫩化。蛋白酶Ｋ可以水解肉中的肌纤维及结蹄组织中的蛋白质，改变蛋白质的空间结构，使部分肽键断裂，肉质吸水膨胀，质地变嫩。１．１．５蛋白酶Ｋ的生产现状及研究进展目前商业上供应的蛋白酶Ｋ主要是通过林伯氏白色念球菌分泌得到，培养基中加入外源蛋白如大豆粉、奶粉或ＢＳＡ等作为氮源时，在菌体进入生长稳定期后就会分泌多种蛋白酶如蛋白酶Ｔ、蛋白酶Ｒ和蛋白酶Ｋ等ｍ】。但是培养基中的葡萄糖和氨基酸会抑制蛋白酶的表达，所以只有当培养基中的葡萄糖及氨基酸消耗尽后，才会分泌蛋白酶。传统的蛋白酶Ｋ生产方法存在很多的缺陷，例如，林伯氏白色念球菌生长缓慢，并且通气搅拌会破坏茵体的菌丝，难以高密度发酵。林伯氏白色念球菌分泌的蛋白酶Ｋ较少，还会分泌其他的蛋白酶，增加了下游分离纯化的难度。传统的分离纯化方法一般经过超滤．阳离子柱．超滤．阴离子柱等过程，纯化步骤复杂，导致酶收率较低，目前工业生产蛋白酶Ｋ的产率为Ｏ．３—０．５∥Ｌ发酵液。蛋白酶Ｋ的生产成本较高，这对蛋白酶Ｋ的大规模应用带来了一定的限制。由于对林伯氏白色念球菌的基因操作要比对酵母菌、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等常用的基因工程菌困难。随着基因工程技术的不断发展，利用基因工程技术，通过对蛋白酶Ｋ基因的改造，实现高效表达，简化分离纯化工艺是现阶段的研究重点。为了提高蛋白酶Ｋ的表达量，很多科研学者对改变蛋白酶Ｋ宿主菌做了多次尝试。Ｇｕｎｋｅｌｔ４１］等通过提取林伯氏白色念球菌的ＲＮＡ，反转录得到ｃＤＮＡ，然后将蛋白酶Ｋ的ｅＤＮＡ转入大肠杆菌体内，实现了蛋白酶Ｋ的胞内表达，可以检测到活性，但表达量极低。酵母表达系统与原核表达系统相比具有很多优势，如分泌表达，便于分离纯化；能够进行蛋白翻译后的加工修饰；表达量较高等特点。并且林伯氏白色念球菌本身是一种真核生物，所以利用酵母表达系统更有利于蛋白酶Ｋ的表达。２００８年，ＲａｉｎｅｒＭｕｅｌｌｅ［１２】等构建－］＂ｐＰＩＣＺａＡ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ及ｐＰＩＣ９Ｋ－ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ表达载体，转入毕赤酵母体内，实现了蛋白酶Ｋ阿分泌表达，证明了蛋白酶Ｋ可以在酵母体内表达。这为以后商业化生产蛋白酶Ｋ提供了新思路。大连理：１：大学专业学位硕士学位论文１．２酵母表达系统１．２．１酵母表达系统的优点随着基因工程技术的不断发展，形成了多种外源蛋白表达系统，如：原核表达系统，真核表达系统，真核表达系统包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、植物或动物个体等心】。每种表达系统都有各自的优势和不足，所以要根据所表达的外源蛋白的特性及应用目的来选择合适的表达系统。酵母表达系统已发展了多种酵母表达菌株，如巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ．Ｐ．ｐ）、乳酸克鲁维酵母（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ．Ｋ１）、酿酒酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．＆ｃ）和多形汉逊酵母（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ．Ｈｐ）。其中应用最早的是酿酒酵母，在制药行业具有广泛的应用价值，但是这种酵母具有一定的不足，如表达量低，不易高密度发酵，外源蛋白分子量不宜过大等缺点。为了解决以上问题，１９６９年Ｏｇａｔａ等发现了巴斯德毕赤酵母表达系统，并于２０世纪８０年代迅速发展，现在已广泛应用于多种外源蛋白的表达。据报道，到目前为止已有１０００多种蛋白利用该系统实现了表达。毕赤酵母表达系统具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，但它的外源蛋白表达量是酿酒酵母的十倍甚至百倍，再加上它作为真核表达系统的一些优势，使毕赤酵母表达系统逐步成为一种非常有用的蛋白表达系统。巴斯德毕赤酵母（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）是一种甲醇营养型酵母，巴斯德毕赤酵母表达系统已经发展成为一种比较完善的被广泛应用于商业化重组蛋白表达的真核宿主细胞表达系统。随着对毕赤酵母表达系统的研究越来越深入，越来越多的实验室和公司开始搭建毕赤酵母表达系统的平台。作为一种高效表达系统，毕赤酵母表达系统主要具有以下优点：（１）作为真核表达系统，可以对外源蛋白进行翻译后的加工修饰，使外源蛋白更接近天然活性，尤其对于真核生物蛋白。（２）具有强有力的基因启动子——醇氧化酶启动子（ＡＯＸ），这种启动子可以严格调控外源蛋白的表达。（３）毕赤酵母生长较快，易于培养，对培养条件要求低，生产成本低，便于工业化生产。（４）适合高密度发酵，且发酵工艺成熟，进行高密度发酵时细胞干重可以达到１５０ｇ／Ｌ以上【４３］。（５）表达量高，表达产物可以胞内或胞外表达，当外源蛋白含有信号肽序列时，就会实现分泌表达。并且毕赤酵母本身分泌很少的蛋白，加上毕赤酵母生长培养蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化基中主要是无机盐，含有极少量蛋白，所以分泌的外源的蛋白是培养基中蛋白的主要成分，这样大大简化了下游分离纯化工艺，提高了产物收率。（６）性状稳定，目的基因转入酵母体内后可以整合到酵母基因上，随着酵母的增殖而复制，不易丢失。研究比较深入，基因操作技术成熟。１．２．２毕赤酵母的生物学特性巴斯德毕赤酵母基因中含有一种醇氧化酶基因（ＡＯＸ），这种醇氧化酶可以代谢甲醇，所以毕赤酵母可以以甲醇为唯一的碳源，当以甘油、葡糖糖或乙醇作为碳源时，醇氧化酶基因几乎不表达。醇氧化酶基因包括ＡＯＸｌ和ＡＯＸ２两种基因。由于ＡＯＸｌ基因的启动子比ＡＯＸ２的启动子强很多，所以甲醇的代谢主要是依靠ＡＯＸｌ醇氧化酶。当表达载体与酵母基因组中的同源序列进行同源重组时，根据菌株及基因插入位点的不同，形成不同表型的转化子。（１）当转化子中含有ＡＯＸｌ基因时，菌体对甲醇的代谢效率较高，为甲醇利用型菌株（Ｍｕｔ＋）。（２）当菌体中不含ＡＯＸｌ基因，只含有ＡＯＸ２基因时，甲醇代谢由ＡＯＸ２醇氧化酶负责，由于这种酶表达量较低，所以利用甲醇比较缓慢，为甲醇利用缓慢型菌株（Ｍｕｔ８）。（３）当ＡＯＸｌ与ＡＯＸ２基因同时缺失时，酵母不分解甲醇，为甲醇不利用型菌株（Ｍｕｔ’）。毕赤酵母是一种需氧型微生物，最适生长温度为２８－３０℃，温度过高，对蛋白质表达有害，甚至会导致菌体死亡，一般不能超过３２℃。在培养基ｐＨ为３．０—８．Ｏ的范围内都可以生长，但最适生长ｐＨ为６．０－７．０。在ＹＰＤ培养基中，甲醇利用型（Ｍｕｔ十）和甲醇利用缓慢型（Ｍｕｔ８）在对数期增值一倍的时间约是２ｈ。当培养基中含有甲醇时，甲醇利用性在对数期增殖一倍的时间大约为４－６ｈ；甲醇利用缓慢型大约为１８ｈ。１．２．３巴斯德毕赤酵母表达系统宿主菌毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母。甲醇营养型酵母是指可以以甲醇为唯一碳源的酵母菌。这类酵母菌主要包括毕赤酵母属（Ｐｉｃｈｉａ）、球拟酵母属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、汉逊酵母属（胁ｎｓｅｎｕｌａ）、念珠酵母属（Ｃａｎｄｉｄａ）、克勒克酵母（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）等。其中可以作为外源蛋白表达的菌株主要是多形汉逊酵母（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ／）及巴斯德毕赤酵母（Ｐｐａｓｔｏｒｉｓ），而巴斯德毕赤酵母在酵母表达系统中应用最广泛。目前毕赤酵母表达系统中所用的菌株都是由ＮＲＲＬ．Ｙ１１４３０菌改造得到。为了便于重组菌体的筛选，将野生型菌株改造成为营养缺陷型，如ＧＳｌ１５与ＫＭ７１在组氨酸脱氢酶（Ｈｉｓ４）处有突变，自身不能合成组氨酸，为组氨酸缺陷型，在基本培养基中不能生长，而所有的表达载体都有Ｈｉｓ４基因，可以与宿主细胞互补，通过不含组氨酸的培养基来筛选阳性转化子。另外还有精氨酸缺陷型（Ａｒｇ’），在不含精氨酸的培养基中不大连理ｊＩ：大学专业学位硕十学位论文能生长，也可以用来筛选重组子。除了营养缺陷型菌株外，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司还开发出了蛋白酶缺陷型菌株，如ＳＭＤｌｌ６３、ＳＭＤｌｌ６５、ＳＭＤｌｌ６８等。这类菌株基因组中缺失蛋白酶Ａ基因（ｐｅｐ４）和蛋白酶Ｂ基因（ｐｒｂｌ）。利用这类菌株表达外源蛋白，减弱了蛋白酶对外源蛋白的降解作用，尤其适用于分泌型表达。在发酵培养时，细胞的高密度培养及少量菌体的破裂，都会导致发酵液中蛋白酶的增加，对分泌到培养基中的外源蛋白非常不利。常用毕赤酵母表达系统宿主茵如表１．１所示：表１．１常用毕赤酵母表达系统宿主菌Ｔａｂ．１．１Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｈｏｓｔｓｔｒａｉｎｓ１．２．４毕赤酵母表达系统载体种类目前已开发出了十几种毕赤酵母表达载体ｍ】，如表１．２所示。根据载体转入酵母体内的存在形式，可以分为游离型和整合型，主要是整合型。整合性载体携带目的基因整合到毕赤酵母基因组中，可以实现稳定表达。根据外源蛋白分泌部位可以将载体分为胞内表达载体和胞外表达载体。由于酵母自身分泌的蛋白很少，如果能够实现外源蛋白的分泌表达，则可以很方便的进行蛋白的分离纯化。对于一些自身含有分泌信号肽的外源蛋白，在任何酵母表达载体中都可以实现分泌表达。如果蛋白自身不含有分泌信号肽，要想实现分泌表达，则要依靠胞外表达载体。胞外表达载体在目的基因上游含有分泌信蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化号序列，如ｐＰＩｃ９Ｋ（如图１．２）。目前主要用的是ａ—ｆａｃｔｏｒ信号序列，该信号肽是源于酿酒酵母的交配因子（Ｏｔ—ｍａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ，Ｏｔ．ＭＦ），该信号肽不仅可以介导外源蛋白分泌到胞外，并且在分泌过程中还可以被自身的膜蛋白酶Ｋｅｘ２自动切割掉，不会使外源蛋白增加额外的氨基酸。除了ａ—ｆａｃｔｏｒ信号肽外，还有ｉｎｖｅｒｔａｓｅ信号肽ＳＵＣ２和酸性磷酸酶信号肽ＰＨＯ等。ＣｏｍｍｅｎｔｓｆｏｒｐＰＩＣ９Ｋ：９２７６ｎｕｃｌｏｏｔｉｄｅｓ５‘Ａｏｘｌｐｒｏｍ醴ｅｒｆｒａｇｍｅｎｔ：ｂａｓｅｓ＇－９４８５’ＡＯＸｌｐｎｍｅｒＳ跳：ｂａｓｅｓ８５５．８７５“．Ｆａｃｔｏｒｓｅｃｒｅｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ（ｓＬｂａｓｅｓ９４９－１２１８ｏ．ＦａｃｔｏｒＤｎｍｅｒｓｉｔｅ：ｂａｓｅｓ＂５２．１１７２Ｍｕ协ＤｌｅＣｔｏｎｉｎ０３。ＡＯ×７Ｓ酏：ｂａｓｅｓ１１９２．１２４＇ｉ，＇３’ＡＯＸｌＤｎｍｅｒｓｉｔｅ：ｂａｓｅｓｊ３２７—１３４７Ｉｒａｎｓｃｔｌ酬Ｏｎ１２５３．１５８６ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ仃＾ｒ）：ｂａｓｅｓＨ１３４ＯＲＦ：ｂａｓｅｓ４５１４—１９８０Ｋａｎａｍｙｃｉｎｇｅｎｅ：ｂａｓｅｓ５７４Ⅻ９２８３’＾Ｃ＊７ｆｒａｇｍｅｎｔ：ｂａｓｅｓ６１２２．６８７９ｐＢＲ３２２ｏｒｉｇｉｎ：ｂａｓｅｓ７９６１—７２８８Ａｍｐｉｃｉｌｔｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｇｅｎｅ：ｂａｓｅｓ８９６＆．８１０６图１．２Ｆｉｇ．１．２ｐＰＩＣ９Ｋ质粒图谱ｇｅｎｅｍａｐｏｆｐＰＩＣ９Ｋ除了信号肽以外，酵母表达载体中还含有其他的一些主要元件，如启动子、多克隆位点、筛选标记等。（１）启动子毕赤酵母最常用的启动子为醇氧化酶启动子ＡＯＸ，醇氧化酶基因包括ＡＯＸｌ和ＡＯＸ２两种基因。其中ＡＯＸｌ是一种强启动子，可以实现外源蛋白的高效表达【４５，４６］，并且还能精确调控外源蛋白的表达。因为ＡＯＸｌ醇氧化酶对甲醇的代谢效率很高，含有ＡＯＸｌ启动子的转化子，可以通过调节甲醇的浓度控制外源蛋白的表达及表达量。如果载体上仅含有ＡＯＸ２启动子，则对甲醇的代谢降低，只依靠甲醇难易维持菌体的正常生长，在菌体生长阶段可以添加一些替代性碳源，如甘露醇、山梨醇等。这些碳源不会抑制ＡＯＸ酶的诱导表达，还会维持菌体的正常生长【４７，４８】。除了ＡＯＸ醇氧化酶启动子之外，三磷酸甘油醛脱氢酶（ＰＧＡＰ）启动子也是酵母常用的一种较强的表达启动子。如果使用该启动子，在诱导外源蛋白时可以不大连理工大学专业学位硕士学位论文使用甲醇作为碳源。通过比较不同的碳源的表达效果，发现蔗糖作为碳源的表达效果最好【４引。除了上述描述的启动子之外，ＹＰＴｌ启动子（ＧＴＰａｓｅ基因启动子）、ＰＦＬＤｌ启动子（甲醛脱氢酶启动子）和ＤＨＡＳ启动子（二羟基丙酮合成酶启动子）也是高效表达的启动子。并且这些启动子也可以由甲胺或甲醇为唯一碳源诱导表达。（２）筛选标志毕赤酵母表达载体的筛选基因一般为组氨酸脱氢酶基因，由于表达宿主菌为组氨酸缺陷型，只有当含有目的基因的载体转入宿主菌中时，宿主菌才可以在组氨酸缺陷型培养基上生长。但是也会出现假阳性转化子现象，因为酵母基因组中的ＨＩＳ４位点与载体上的ＨＩＳ＋基因进行基因重组时会出现营养缺陷型的恢复突变，即使宿主菌中不含有表达载体，也会在营养缺陷型培养基中生长，假阳性转化子的比例会占总转化子的１０％一５０％，利用电转化时，比例会更高一些。一般情况下，目的基因拷贝数的的增加可以增加外源蛋白的表达量。有些载体如ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣ３．５Ｋ中含有卡那霉素抗性基因，这一基因会使宿主菌对Ｇ４１８抗生素产生抗性。一般拷贝数越多，对Ｇ４１８的耐受性越高，所以可以通过提高Ｇ４１８浓度筛选高拷贝转化子。但是由于这些载体分子量较大，体外克隆较困难，并且转化宿主菌后遗传稳定性差，后来又寻找到了新的抗性基因——Ｓｈｂｌｅ基因，开发了ｐＰＩＣＺ系列载体。该基因可以使宿主菌产生ｚｅｏｃｉｎ抗生素抗性，含有ｚｅｏｃｉｎ抗性的载体只有５＇ＡＯＸ的启动子序列，ＡＯＸｌ转录终止序列和Ｓｈｂｌｅ基因序列，载体分力量较小，多克隆位点较多，体外操作简单，且转化子遗传稳定性较高ｉ（３）其他元件多克隆位点是载体所必须的元件，用于外源基因的插入。有些载体中还含有３＇ＡＯＸ终止序列，有利于３’端的加工和形成ｍＲＮＡＰｏｌｙＡ结构。表１．２毕赤酵母表达系统常用载体‘５０，５１】Ｔａｂ．１．２Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化表１．２续Ｔａｂ．１．２Ｃｏｎｔ１．２．５影响外源基因高效表达的因素不同外源基因在毕赤酵母中的表达水平存在很大差异，根据一些文献报道，最高可以达到１２∥Ｌ【５２１，而最低的只有１ｍｇ／Ｌ，这种表达量的差异主要是由于外源基因自身序列及诱导表达条件引起的，而后者的影响更显著【５３】。诱导表达条件包括诱导剂浓度、发酵温度、培养基ｐＨ及诱导时间等。因此，提高外源蛋白的表达量，首先要对外源基因密码子进行优化，使其成为毕赤酵母偏爱的密码子，其次对培养条件也要进行优化。下面对这些因素进行详细讨论。（１）密码子优化生物体内的密码子具有简并性，即一个氨基酸可以由多个密码子编码，这些密码子称为同义密码子。不同物种对密码子的使用具有偏爱性，也就是不同生物合成蛋白时使用密码子的频率不同。造成这种现象的原因可能与ｔＲＮＡ丰度有关，ｔＲＮＡ丰度即ｔＲＮＡ的数量。对于生物体来说，偏爱密码子对应的ｔＲＮＡ数量一般会较高，而稀有密码子对应的ｔＲＮＡ的数量相对较低。ｔＲＮＡ丰度越高则所对应的密码子的使用频率越高【５４１。由于不同生物的偏爱密码子不同，如果外源基因中某些密码子对于毕赤酵母是稀有密码子，可能会成为转录翻译过程中的瓶颈，从而影响外源基因表达量。许多数据证明，优化外源基因密码子对提高外源蛋白表达量有显著的作用，可以提高几倍甚至数十倍【５孓５８Ｊ。因此在保证氨基酸序列不变的前体下，对外源基因序列进行改造，尽量使用毕赤酵母偏爱密码子，可以获得高表达量的转基因菌株。对毕赤酵母密码子的偏好性有不同的算法【５巩圳，很多研究也也给出了酵母稀有密码子及偏爱密码子表，可以根据这些算法及偏爱密码子统计表对目的基因密码子序列进行改造。另外，还可以通过一些密码子优化网站对密码子序列进行改造。大连理工大学专业学位硕士学位论文（２）ｐＨ毕赤酵母在ｐＨ３．０—８．０之间都可以生长，但不同外源蛋白的表达量、活性及稳定性可能会受到ｐＨ的影响。选择合适的ｐＨ进行诱导，对提高外源蛋白表达量具有显著的作用。例如，利用酵母表达系统表达人血清白蛋白时，ｐＨ６．０时表达量最高１６¨，但细胞因子生长抑制肽在ｐＨ３．０时表达量最高卿。（３）温度酵母最适生长温度为２８－３０℃。一般来说，低温可以抑制蛋白酶的降解，并有还助于蛋白的正确折叠【６３ｌ。也有报道表明，降低温度可以削弱甲醇对菌体的毒性作用Ｍ】。但是温度过低，菌体生长缓慢，表达量低。温度过高，对蛋白表达有害。外源基因的最适表达温度一般为２５－３０℃。（４）诱导剂浓度由于毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可以以甲醇为唯一的碳源。甲醇可以诱导醇氧化酶启动子，从而启动外源基因的表达，所以甲醇的浓度对菌体的生长及外源蛋白的表达都有较大的影响。甲醇浓度过高，不利于酵母生长，会导致生长停止甚至死亡。但甲醇浓度较低，碳源不足，又会影响菌体活性，降低外源蛋白的表达量。为了减少甲醇对菌体的毒害作用，现在逐步采用混合流加方式，即甘油或山梨醇等碳源与甲醇一起作为菌体的碳源，汪志浩等【６５Ｊ研究发现，利用混合流加的方式可以提高碱性果胶酶的表达量，尤其甲醇与山梨醇的混合流加效果更为显著。混合流加方式既为菌体生长提供了所需的碳源，减少了甲醇的用量，提高了菌体的活性还添加了外源蛋白表达所需的诱导因子，增加了表达量。（５）溶氧量因为毕赤酵母属于好氧型菌体，通氧量的增加可以有助于茵体生长及目的蛋白的表达。研究发现，发酵罐发酵的表达量要比摇瓶发酵的表达量高１０－１００倍，主要原因就是发酵罐培养可以将通氧量控制在合理的范围之内，使菌体供养充足，能够实现菌体的高密度发酵，从而提高了外源蛋白的表达量ｍＪ。１．３本实验的研究目的及意义蛋白酶Ｋ作为一种重要的丝氨酸蛋白酶，不仅在生物科研方面应用广泛，在食品及饲料加工、医药行业、环境保护、资源和能源开发等领域都具有较高的应用价值。面对日益增加的需求，提高蛋白酶Ｋ产量，降低生产成本成了现阶段研究的重点。利用基因工程技术实现外源基因的高效表达成为目前生产外源蛋白的一种重要的手段。在这些外源基因表达系统中，酵母表达系统由于具有很多优于其他表达系统的特点，如可以分泌表达，能够对外源蛋白进行翻译后的加工修饰，表达量高，成本低等，逐步成为一种重要的外源蛋白表达工具。本研究为了提高蛋白酶Ｋ的产量简化分离纯化工艺，利用毕赤酵母表达系统表达蛋白酶Ｋ。实验通过优化蛋白酶Ｋ密码予序列，利用人工合成的方法获得目的基因，并蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化构建了ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ酵母表达载体，转入毕赤酵母体内，实现了蛋白酶Ｋ在酵母中的分泌表达，并优化了蛋白酶Ｋ表达条件及纯化工艺，为蛋白酶Ｋ的大规模生产提供了依据。大连理工大学专业学位硕士学位论文２目的基因的获得及ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表达载体的构建引言由于不同物种的偏爱密码子不同，如果外源基因中某些密码子对于毕赤酵母是稀２．１有密码子，可能会成为转录翻译过程中的瓶颈，从而影响外源基因表达量。本章主要利用密码子优化软件对蛋白酶Ｋ密码子进行优化，使其均成为毕赤酵母偏爱密码子，然后利用基因合成的手段合成目的基因。为了便于下游蛋白酶Ｋ的分离纯化，在目的基因Ｃ端添加了六个组氨酸标签，利用亲和层析的方法就可以将目的蛋白纯化出来。目的基因Ｎ端保留了蛋白酶Ｋ自身的信号肽，由于蛋白酶Ｋ成熟后，信号肽会自动被切割掉，所以为了避免组氨酸标签被切掉，将组氨酸标签添加到目的基因Ｃ端。ｐＰＩＣ９Ｋ载体是酵母表达系统中常用的一种分泌表达载体。利用这种表达载体，可以实现外源基因的分泌表达，省去了收集及破碎菌体的过程，并且毕赤酵母本身分泌很少的蛋白，非常有利用蛋白的分离纯化。蛋白酶Ｋ本身就是一种分泌蛋白，分泌表达有助于蛋白酶的转录翻译。。本章将合成的蛋白酶Ｋ克隆到ｐＰＩＣ９Ｋ载体上构建酵母表达载体，在毕赤酵母中实现分泌表达。２．２实验材料与试剂２．２．１材料和试剂大肠杆菌（ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｐＰＩＣ９Ｋ载体ＤＮＡ限制性内切酶ＤＮＡｍａｒｋｅｒＴ４ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ本实验室保存本实验室保存宝生物工程有限公司（大连）宝生物工程有限公司（大连）宝生物工程有限公司（大连）ＤＮＡ连接酶ＤＮＡ凝胶回收试剂盒质粒ＤＮＡ小提试剂盒琼脂糖氯化钠宝生物工程有限公司（大连）天根生物科技（北京）有限公司生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）胰蛋白胨酵母膏琼脂粉无菌双蒸水生工生物工程股份有限公司（上海）生工生物工程股份有限公司（上海）本实验制备蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化２．２．２实验仪器超净工作台上海净化设备厂ＰＣＲ仪宝生物工程有限公司（大连）凝胶成像系统上海新振仪器有限设备有限公司恒温振荡仪常州国华电器有限公司电热恒温培养箱上海跃进医疗器械厂电泳仪Ｅ．ＣＡｐｐａｒａｔｕｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ２．２．３主要溶液剂配制方法表２．１主要溶液及配制方法Ｔａｂ．２．ＩＴｈｅｍａｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｍｃｔｈｏｒｄｓ溶液配制方法胰蛋白胨１０９；酵母膏５９；氯化钠１０９：加水定ＬＢ培养基（１Ｌ）容到１Ｌ，完全溶解后调ｐＨ至、７．０。１２１＂Ｃ高压蒸汽灭菌２０ｍｉｎ。固体ＬＢ培养基需加１．５％琼脂粉。Ｔｒｉｓ１×ＴＡＥ４．８４９：Ｎａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２００．７４４９；用醋酸调硼到８．５质粒提取试剂：溶液Ｐ１１０ｒａｍＥＤＴＡ，５０ｒａＭ葡萄糖，２５ｍ＾ＩＴｒｉｓ－ＨＣｌｐＨ＝８．０溶液Ｐ２Ｉ％ＳＤＳ０．２ＭＮａ０ＩＩ溶液Ｐ３３Ｍ醋酸钾；２Ｍ冰醋酸２．３实验方法２．３．１蛋白酶Ｋ密码子的优化及人工合成参照ＧｅｎＢａｎｋ中蛋白酶Ｋ基因序列（ＧｅｎｎＢａｎｋ：ＤＤ０３１２７２．１），利用密码子优化软件（ｈｔｔｐ：ｌｌｇｃｕａ．ｓｅｈｏｅｄｌ．ｄｅ／）分析，发现蛋白酶Ｋ基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，利用密码子优化软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）对蛋白酶Ｋ基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶Ｋ的基因序列。在序列的５’端加上ＥｃｏＲＩ酶切位点，３’端加上六个组氨酸标签后再加ＮｏｔＩ酶切位点。然后将优化构建的基因序列送上海生工公司合成。合成的基因连到ＰＵＣ５７Ｔ．载体上。火连理Ｔ大学专业学位硕十学位论文２．３．２ｐＰＩＣ９Ｋ载体及目的基因的双酶切用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ两种限制性内切酶分别双酶切ｐＰＩＣ９Ｋ载体及ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ质粒，酶切体系如下：表２．２Ｔａｂ．２．２ｐＰＩＣ９Ｋ载体双酶切体系体积１０ｌ儿ｐＰＩＣ９Ｋｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｒｍ成分ｐＰＩＣ９Ｋ载体ＥｃｏＲＩ０．５吐０．５１１ＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡｄｄＩ－１２０２皿２皿５１ｌＬＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ质粒双酶切体系表２．３Ｔａｂ．２。３ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｒｍ成分ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ质粒ＥｃｏＲ体积１０１也Ｉ０．５皿０．５ｐＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡ２ｌ止ＥｒＩＥｄｄＨ２０５ｌ儿３７℃温育５ｈ后，进行琼脂糖凝胶电泳。２．３．３酶切产物的回收将酶切产物进行１％琼脂糖凝胶电泳。回收９３００ｂｐ大小的ｐＰＩＣ９Ｋ片段及１２００ｂｐ大小的蛋白酶Ｋ目的基因片段。酶切产物纯化步骤如下：①在紫外灯下切下含有目的基因的琼脂糖凝胶块（尽量去除多余的凝胶，凝胶体积不要太大，＋以免影响回收效果），将胶块切碎，加快溶胶过程。将胶块收集到１．５ｍＬ离心管中。②向离心管中加入５００ｐＬ的溶胶试剂ＢｕｆｆｅｒＧＭ。室温下静置一段时间，使胶块完全融化。若胶块过大，可以在３７℃下加热，期间应间断混合，加快胶块融化。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化③将试剂盒中的ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上。④将上述溶液加入到ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ，弃滤液。如果想提ｍｉｎ，弃滤液。高回收率，可以将滤液重新加入ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中，重新离心一次。⑤向ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中加入７００⑥重复步骤⑤一次。⑦将Ｓｐｉｎ⑧将Ｓｐｉｎ⑨ｒｔＬＢｕｆｆｅｒＷＢ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１Ｃｏｌｕｍｎ安置于ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＴｕｂｅ上，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。Ｃｏｌｕｍｎ安置于新的１．５ｍＬ离心管中，室温静置３－４ｍｉｎ，晾干ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ中的乙醇。向ＳｐｉｎＣｏｌｕｍｎ膜的中央加入３０ｌｌＬ双蒸水或ＥｌｕｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ，室温静置１ｍｉｎ。０００⑩１２２．３．４ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ，洗脱ＤＮＡ。ｐＰｌＣ９Ｋ载体与目的基因的连接将回收的ｐＰＩＣ９Ｋ载体与蛋白酶Ｋ基因连接，连接体系如下：表２．４蛋白酶Ｋ与ｐＰＩＣ９Ｋ连接体系Ｔａｂ．２．４ＬｉｇａｔｅｓｙｓｔｅｍｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫａｎｄｐＰＩＣ９Ｋ成分１０×ｌｉｇａｔｅＢｕｆｆｅｒＴ４ＤＮＡｌｉｇａｔｅ体积１１３１ｌＬｌｌＬ１１ＬｐＰＩＣ９Ｋ载体蛋白酶Ｋ目的基因５ｇＬ将上述物质加入到０．５ｍＬ离心管中，混匀。于１６。Ｃ连接过夜。２．３．５￡ｃｏｌ，０８５Ｑ感受态的制备①用接种针挑取大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＤＨ５ａ菌液，在ＬＢ固体培养基中划线。置于３７℃恒温箱培养过夜。②挑取大肠杆菌ＤＨＳａ单菌落接种于ＬＢ液体培养基中。３７。Ｃ，１７０ｒｐｍ振荡培养过夜。③将菌液按１％接种于５０ｍＬＬＢ液体培养基中，３７℃，１７０ｒｐｍ振荡培养至ＯＤ６００为０．２－０．４。④无菌条件下将菌液分装至５０ｍＬ离心管中，冰上放置３０ｍｉｎ，使其彻底低温。４℃，２０００—２２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，倒置１ｍｉｎ，使培养基流尽。大连理：ｊ：大学专业学位硕士学位论文⑤向菌体中加入３０ｍＬ预冷的０．１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２溶液，悬浮菌体，置于冰上冰浴３０ｍｉｎ。⑥４℃，２０００－２２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清．再次加入２ｍＬ预冷的０．１ｍｏｌ／ＬＣａＣｌ２溶液和２ｍＬ５０％甘油，混匀后每２００ｐＬ一管分装至１．５ｍＬ离心管中，一８０℃保存备用。２．３．６连接产物的转化及鉴定（１）连接产物的转化利用热激法将ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ连接产物转化ＤＨ５ａ感受态细胞，具体操作如下：①所有的连接产物都加入到２００ｌｌＬ感受态细胞中，混匀后，冰浴３０ｍｉｎ。②置于４２℃中热激６０－９０ｓ，立即放于冰上冰浴２ｍｉｎ。③无菌条件下向转化体系中加入１ｍＬ无抗性的ＬＢ培养基，混匀后置于３７℃摇床中，振荡培养１．５ｈ。④４０００ｒ／ｍｉｎ离心３ｍｉｎ，弃掉８００ｌｌＬ上清，将剩余的上清及菌体吹打混匀后涂布到含有１００ｍｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ固体培养基中，置于３７℃恒温箱中培养过夜。（２）质粒ＤＮＡ的提取从长出菌落的ＬＢ固体培养基中挑取单茵落接种于含有１００ｍｇ／ｍＬ氨苄青霉素的ＬＢ液体培养基中，３７℃振荡培养过夜。利用质粒小提试剂盒中的方法进行质粒ＤＮＡ的提取。步骤如下：①柱平衡步骤：向吸附柱ＣＰ３中加入５００ｌｌＬ平衡液ＢＬ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。倒掉收集管中的滤液，将吸附柱重新放回收集管中。②取１ｍＬ过夜培养的菌液，加入离心管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。尽量吸去上清。③向菌体中加入２５０ｌｌＬ溶液Ｐ１（已加入ＲＮａｓｅ），吹打悬浮菌体。④向离心管中加入２５０ｌｌＬ溶液Ｐ２，温和的上下翻转６—８次使菌体充分裂解。⑤向离心管中加入３５０ｌｌＬ溶液Ｐ３，立即上下翻转６－８次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ。⑥将上清转移到吸附柱ＣＰ３中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｒａｉｎ，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。⑦向吸附柱中加入６００ｌａＬ溶液ＰＷ（已加入乙醇），１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１ｍｉｎ。倒掉废液。⑧重复步骤⑦。蚩白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化⑨将吸附柱放回收集管中，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。⑩将吸附柱放到一新的离心管中，静置３－４ｍｉｎ。向吸附柱膜的中央加６０ｌｌＬ无菌水或ＥＢ缓冲液。室温静置２－３ｍｉｎ。１２（３）限制性内切酶酶切鉴定用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ两种限制性内切酶对提取的质粒进行鉴定。酶切体系如下：０００ｒ／ｍｉｎ离心２ｍｉｎ。表２．５Ｔａｂ．２．５ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒双酶切鉴定体系ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ成分质粒ＥｃｏＲＩ体积１０ｌｌＬ０．５皿０．５ｐＬ２ｐＬ２ｐＬＮｏｔＩ１０×ＨＢＳＡｄｄＨ２０５１ｌＬ将上述物质加入到０．５ｍＬ离心管中，混匀后，３７。Ｃ放置６—７ｈ。２．４实验结果与讨论２．４．１优化后蛋白酶Ｋ密码子序列利用密码子优化软件（ｈｔｔｐ：／／ｇｃｕａ．ｓｃｈｏｅｘｉｌ．ｄｅ／）对ＧｅｎＢａｎｋ中蛋白酶Ｋ基因序Ｎ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＤＤ０３１２７２．１１进行分析，发现蛋白酶Ｋ基因中有多处是毕赤酵母的稀有密码子，其中有１１处是极稀有密码子。利用密码子优化软件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｃａｔ．ｄｅ／）对蛋白酶Ｋ基因进行密码子优化，在不改变氨基酸序列的前提下，获得优化后的蛋白酶Ｋ的基因序列。基因序列如下：大连理．Ｊ：大学专业学位硕十学位论文．－－Ｔ：ＣＡＧ：Ｔ０：：Ｓ；国：五．醯０Ａ：啬ｏＡＡＧ嚣５：：ｏ一－－ＡＴＴ暑；。：０３ＡＡ３：：ＡＳＡ０３：Ｇ矗Ａ矗：ＳＳ！：暑ｏ：醯：强复Ａ：Ａ：：０：：ＡＡｇ：Ｔ：；溶Ｇ鑫Ａ珏ｇ五：ｒ鑫：咒ＴＧ：：：ｏｏ搿占口ＡＹＡＡ五ＮＶ甚Ｚ孓ＶＡＺ五Ａ鑫Ａｏ暑∞Ｇ∞Ａ工ＳｅＡＡＡＡ６醵∞口ｇ∞ＡＡＧＣｏＡ舀ＡＣ强ｏＧ：工：ＡｏＡＡＧＡＡｏｇｒｒｒＴ：ｒ：：ｇｇＴ：了Ｃ３嚣Ｇｏ：Ａ∞＿ｒＴＧＧＡ０３ＡＡＡＡＣＡＴＧＧ：曙ＡＧＡＧ：：口ＧＡＧＡＧＣ工ＣＡＣ：￡ＡＢＡＣＧ：？工Ｍ盖ＭＡＹ量ＺＡ：Ｎ五ＡＫＭｚＶＹＲ￡ＶＧＡ五工Ａｏ订：ＧＡＡｏＡＡＧＡ：３０：ＧｒｒＧｒＺＡ：！ＡｚＣ醯ＣＧＣｒＧ矗ＣＡＡＡ嚣ＡＡＣＳｏ工ｏ：艋ＧｏＤＮＶＶＲＮＴＺＹＲＧＶＡＤＶＷＧＳｒｒ：Ｇ暑ｏ￡Ａ６ＡＡ士ＣＴＣ玎∞Ａｇ：Ｔ∞ｏ：ＡＧｇ强唧Ｃ强ＣｎＡｏｒＡｏ：Ａｏ强ＣＧＡＡ芏：了Ｙ：０Ｄ五Ｖ工ＡＮＹＬＤＡＡＧＣＴ５ＧＴｏＡＡＧＧＴＴＣｎＧｒＧｒｒｒＡＣｇｒＺ玎Ｃ６ＡＣＡＣｒＧＧＺＡｒＣＧＡＡＧＣｒｒＴＧ强ｏｏＡＡＧＡｏＡＡＲＧＤＹＹ￡ＹＴＴｏＧＡＡＧＧＴＡＧ矗５ＣＴＣＡＡＡ工ＧＧｒ！ＡＡ￡通Ｃｒ：ＡＣ了ＡＣＴＡＣｚＣ，叮ＣＴＡＧＡ强ＣＳＧｒＡＡＣＧｇｒＣＡＣ５ＧＺＡＣｒＣＡＣＴＧＴＧＣＴＧＧ强口Ｇ玎ＧＧＴＴＣｔＡ＝ＧＡＡＣＴＴＡＣＧＧＴＧｒ！ＧＣＺＡＡＧＡＡＧＡＣ士ＱＧ？ＣＶＭＧＶＹＶＸＶＡＲ甚Ｑ、ＥＮＸＲＡＣｖｏＡＶ？ｔＧＤＹ￡囊Ａ订Ｇ订ＣＧｌＥ；ｒＧＴＴＡ甬，．ＣｖＧｒＩ＇Ｔ＇Ｉ－ＩＧＧＡＣＧＡＣ昼五ＣＧＧ靠Ｃ工屯丽ＣＡＡｚＡＣＴＣｌＡＣｌ麓３ｔ：ＡｒＣＬＱＧＣＴｏＧ昱丑ＹＧＧ口ＶＫＴ＿矗？ＧＧＡＣｒＴＣＧｒｒｃ；Ｃ玎ＣＴＧＡｏＡＡＧＡＡＣＡＡＣＡＧＡＡＡｃｚｃ嚣ＣＣＡＡＡＧＧＧ！Ｇ曩Ｇ：Ｉ’ＧＶＶＡＭＤＦＶＡＤＫＮＨＲＮＫＧＣＴ工ＣＴＴＴＧｒＣ！ＴＴＧＧ口ＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＣＴＴＣ玎ＣＴＧｚｔＡＡＣＴＣＴＧＣｒＧＣＴＧＣｔＡＧ舡ＴＧＧＬＮＹＣＡ五］ｒＣｒｒＣＴＧＧＴＧＴ了薯了ＧＧＴＴＧＣＴＧｒＴＧＣＴＧＣＴＧＧＺＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＣＴＧＡＣＧＣ工ＡＧＡ醯ＣｒＡＣＴＣｒＣＣＡＧＣ玎Ｃ工Ｇ矗ＡＣ￡Ａ工ＣＴＧｒｒ工ＧＴＡ口Ｇｒ芏ＧＧＴＧＣｎＣ？ＧＡＣＡＧＡ工ＡＣＧＡＣＡｆ；ＡＡＧＡ工Ｃ＇ＦＴＣＴＴＴＣＴＣ芏ＡＡＣＺＡＣＧＧｒｒＣｒＧｒｒｒＴＧＧＡＣＡ？ＣｒｒＣＧ甜ＣＣ＾ＧＧ工ＡＣＴＧＡＣＡ：ｒＣｒ？ＧｚＣＴＡＣ前ＧＧ矗工ＣＧＧＴＧＧ订ＣＴＡＣ：盈＿Ｇ函ＺＣ：Ｔｊ口ＣＴＣｒＧＧＺＡＣＴ！ＣＺＡ士ＧＧＣＴＡＣｔＣＣＡＲＬＡ口ＹＬＧＭＥ８ｖ５ＡＶＮＧＮＮＡＡＡＤＡＡＡＲＲＧＡＦＷＧｖｖＶＡＡＴＬＧＶＤＮＤＲＮＲＣＹＧＡＴＨ６ＶＲＭＦＤ工ＣＡＣｍＧｏｒＧＧｒ丁了ＧＧＣＴＧＣｒ工ＡＣｒ工Ｇ各ｒＧＡｏｒｒｒＧＧＧＴ：ＡＡＧ啦ＡｃｚｒＧＣ了ＧＣｒｒＣｒＧＣ：工工ＡＹＬＧＧ工工ＭＡＡ！ＧＺＡＧＡ工ＡＣＡｚＣＧＣｒ６ＡＣＡＣＴＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＧＴＧＡＣＴＴＧｒＣＺＡＡ￡酊Ｃ００Ａ玎ＣＧＧＴＡＣ：ｒＥＶＲＮＬＡＡＡＤＹＹＬＮＹＺＧＡＬＤＥＧＫＡＰＡＧＴｚＡＡＣｌ口Ｇ】习｝ｖ囡Ｌ工．ＧＧｃＴｒＡｃＡＡｃＡＡｏ嫩ｃｍｃｒｃＫＧ虻｝ｃＡｃ强ｃ∞ｃＡ‰砷ｊ：ＧＧｃｃＩ·－暑—＿五一Ｆ．互Ｎ口Ｅ丑丑丑基ＡＫｓ嚣图２．１优化后蛋白酶Ｋ基因序列Ｆｉｇ．２．１ＴｈｅｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｏｎｓ注：方框内序列分别为ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切位点，划线部分为六个组氨酸标签在这段优化的密码子序列中，保持氨基酸序列不变的情况下，共替换了２４７个碱基，优化后的密码子序列几乎全部是毕赤酵母的偏爱密码子。由于密码子序列对外源蛋白的表达量具有很大的影响，稀有密码子的存在会导致外源蛋自表达量降低甚至不表达，所以通过优化外源基因密码子序列提高蛋白表达量己成为一种高效表达的常用手段。密码子优化方法有多种，如定点突变技术、分段ＰＣＲ扩增技术及人工合成技术等。人工合成技术简便、快速、突变率低，尤其实用于稀有密码子较多的序列。本实验在优化后的密码子序列的前后两端分别加上ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ两种限制性酶切位点。为了利用亲和层析的方法进行纯化，在基因序列的Ｃ端加上了六个组氨酸标签。蛋白酶Ｋ基因的Ｎ端含有信号肽，在蛋白酶Ｋ成熟分泌到胞外的过程中，信号肽被切除，为了避免组氨酸标签被切除，应该将组氨酸标签加在蛋白酶Ｋ的Ｃ端。２．４．２ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ表达载体的构建及鉴定（１）ｐＰＩＣ９Ｋ载体及目的基因的双酶切．２１．蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化利用ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ两种限制性内切酶分别对ｐＰＩＣ９Ｋ载体及ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ质粒进行双酶切。酶切结果如图２．２：图２．２Ｆｉｇ．２．２ｐＰＩＣ９Ｋ载体及ＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ质粒双酶切图ＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｐＰＩＣ９ＫａｎｄＰＵＣ５７Ｔ－ＰｒｏＫ１：ｐＰＩＣ９Ｋ质粒２：经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切的ｐＰＩＣ９Ｋ质粒Ｂ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１：ＰＵＣ５７Ｔ—ＰｒｏＫ质粒２：经ＥｃｏＲＩ和ＮｏｔＩ酶切的ＰＵＣ５７Ｔ．ＰｒｏＫ质粒Ａ：Ｍ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ（２）将回收的ｐＰＩＣ９Ｋ载体与目的基因连接后，转化感受态细胞ＤＨ５ａ，挑取单菌落提取质粒，做酶切鉴定。酶切结果如图２．３所示：Ｖｌ二Ｉ２０００ｂｌｉ０００ｂｒ图２．３重组质粒ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ的酶切验证鉴定Ｆｉｇ．２．３ＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｄｉｇｅｓｔｅｄｂｙＥｃｏＲＩ／ＮｏｔＩＭ：ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒｌ：ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒２：双酶切ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒３：双酶切ｐＰＩＣ９Ｋ质粒．２２．大连理工大学专业学位硕士学位论文从图中可以看出，提取的质粒可以通过双酶切切出１２００ｂｐ大小的蛋白酶Ｋ基因，说明蛋白酶Ｋ目的基因已经连接到ｐＰＩＣ９Ｋ载体上。ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒构建正确。ｐＰＩＣ９Ｋ载体是一种分泌型酵母表达载体，利用该载体可以实现外源基因在酵母中的分泌表达。并且蛋白酶Ｋ本身是一种分泌蛋白，分泌表达有助于蛋白酶Ｋ正确的加工修饰。由于毕赤酵母本身分泌很少的蛋白，杂蛋白少，外源基因的分泌表达大大简化了后期的分离纯化工艺。２．５小－结１．利用密码子优化软件对蛋白酶Ｋ基因进行密码子优化，使其成为毕赤酵母的偏爱密码子，通过基因合成手段，获得优化后的蛋白酶Ｋ基因。２．将蛋白酶Ｋ基因连接到ｐＰＩＣ９Ｋ载体上，构建了ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ酵母表达载体。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化３３．１蛋白酶Ｋ在毕赤酵母中的分泌表达及条件优化前言毕赤酵母的发酵条件对产物的表达量具有较大的影响。不同外源蛋白所需的表达条件也有很大的差别，所以在进行诱导表达时，对发酵条件进行优化可以明显提高产物表达量。本章将前面构建好的ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ酵母表达载体利用电转化法转入毕赤酵母中，实现了蛋白酶Ｋ在酵母中的分泌表达。利用摇瓶发酵对发酵时间、诱导温度、ｐＨ、诱导剂浓度等条件进行了优化。利用优化的条件进行５Ｌ发酵罐发酵，蛋白酶Ｋ表达量可以达到２．２ｇ／Ｌ发酵液。３．２实验材料与试剂３．２．１材料与试剂毕赤酵母ＧＳｌｌ５Ｄ．山梨醇三氯乙酸（ＴＣＡ）本实验室保存上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司北京索莱宝科技有限公司ＭｅｒｃＫ公司上海化科实验器材有限公司ＳＩＧＭＡ公司ＢＣＡ蛋白定量试剂盒Ｈｉｓ－ＮＴＡ亲和层析柱９６孔板偶氮酪蛋白甘油甲醇天津市科密欧化学试剂有限公司天津博迪化工股份有限公司ＥＣＬ显色试剂盒鼠源抗Ｈｉｓ—Ｔａｇ抗体ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩＧｇ上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司上海生工生物工程股份有限公司３．２．２主要实验仪器电转仪电转杯（０．２ｃｍ）宁波新芝Ｂｉｏ．Ｒａｄ５Ｌ发酵罐上海百仑生物科技有限公司大连理：Ｆ大学专业学位硕士学位论文酶标仪美国分子仪器公司北京六一仪器厂北京六一仪器厂垂直电泳槽凝胶成像分析系统ＤＹＹ．２Ｃ电泳仪上海六一仪器厂上海亚荣生物仪器厂上海沪西分析仪器厂美国Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司ＴＳ．１平衡脱色摇床微型涡旋混合仪转膜仪恒温振荡仪电热恒温培养箱３．２．３主要试剂及配制方法常州国华电器有限公司上海跃进医疗器械厂表３．１主要溶液及配制方法Ｔａｂ．３．１Ｔｈｅｍａｉｎｓｏｌｕｔｉｏｎａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｉｇｎｍｅｔｈｏｄｓ试剂１０ＸＹＮＢ配制方法１３．４９ＹＮＢ溶于１００ｍＬ蒸馏水中，过滤除菌。４℃保存称取２０ｍｇ生物素溶解于１００ｍＬ蒸馏水中，过滤除菌后，４℃保存将２００ｇ葡萄糖溶于１Ｌ水中，过滤或高压除菌，４℃保存。１００５００×生物素１０×葡萄糖１０×甘油１Ｍ山梨醇ＹＰＤ液体培养基ＭＤ固体培养基ＢＭＭＹ培养墓ｍＬ甘油溶于９００ｍＬ水中，过滤除菌或高压灭菌，４℃保存。将１８２９山梨醇溶于１Ｌ双蒸水中，高压灭菌。２０ｇ葡萄糖，２０ｇ蛋白胨，１０ｇ酵母提取物，加蒸馏水定容至１Ｌ。固体培养基需加２％的琼脂粉。完全溶解后１２１℃灭菌１５ｍｉｎ。向８０ｍＬ水中加入２ｇ琼脂，１２１℃灭菌２０ｒａｉｎ，待温度降至６０℃时，在无菌条件下加入１０ｍＬ１０×ＹＮＢ，１０ｍＬ１０Ｘ葡萄糖，２００皿５００Ｘ生物素酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，磷酸氢二钾３ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾１１．８ｇ／Ｌ加水至８９０ｍＬ。１２１℃灭菌２０ｒａｉｎ，待温度降至６０℃左右时无菌条件下加入１００ｍＬｌ０×ＹＮＢ，１０ｍＬ甘油，１ｍＬ５００Ｘ生物素。ＢＭＧＹ培养基酵母提取物１０ｇ／Ｌ，蛋白胨２０ｇ／Ｌ，磷酸氢二钾３ｇ／Ｌ，磷酸二氢钾１１．８ｇ／Ｌ加水至８９５ｍＬ。１２１℃灭菌２０ｍｉｎ，待温度降至６０℃左右时无菌条件下加入１００ｍＬｌ０×ＹＮＢ，５ｍＬ甲醇，１ｍＬ５００×生物素。溶液Ａ４８ｇ丙烯酰胺，１．５ｇＮ，Ｎ一亚甲基双丙烯酰胺，用双蒸水定容至１００ｍＬ，室温下完全溶解后过滤，４℃保存。溶液Ｂ７５ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ８．８），４ｍＬＯ．１ｍｏｌ／ＬＳＤＳ，加超纯水定容至１００ｍＬ溶液Ｃ５０ｍＬ２ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ６．８），４ｍＬ０．１ｍｏｌ／ＬＳＤＳ，加超纯水定容至１００ｍＬ。．２５．蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化１０％过硫酸铵２×样品缓冲液考马斯亮蓝染色液Ｔｒｉｓ．甘氨酸电泳缓冲液脱色液ＴＢＳＴ缓冲液转膜缓冲液Ｏ．１ｇ过硫酸铵溶于１ｍＬ超纯水中，完全溶解后混匀，需现用现配。Ｏ．５４ｇ１ｇ溴酚蓝，５ｍＬ１ｍｏｌ／Ｌ％ｓ－ＨＣｌ缓冲液（ｐＨ６．８），１０ｍＬ甘油，５ｍＬ巯基乙醇，ＳＤＳ，加入双蒸水定容至５０ｍＬ，过滤后４℃保存。ｇ考马斯亮蓝Ｒ－２５０，１００ｍＬ冰醋酸，２５０ｍＬ异丙醇，加单蒸水定容至６５０ｍＬ，混匀。１．２ｇＴｒｉｓ碱，５．７６ｇ甘氨酸和０．４ｇＳＤＳ，加单蒸水定容至ｌ０００ｍＬ，混匀。３００ｍＬ乙醇，１００ｍＬ乙酸，加单蒸水定容至１０００ｍＬ，混匀。８．８ｇＮａＣｌ，２０ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ８．０）加８００ｍＬ去离子水，充分搅拌溶解后，加入０．５ｍＬＴｗｅｅｎ２０，加水定容到１Ｌ，４＂Ｃ保存。２．９ｇ甘氨酸、５．８ｇＴｒｉｓ．ＨＣｌ、Ｏ．３７ｇＳＤＳ溶解于８００ｍＬ去离子水中，充分搅拌溶解。加入２００ｍＬ甲醇。酵母裂解液０．１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ（．ｐＨ密．Ｏ），１％ＳＤＳ３．３实验方法３．３．１ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒的线性化及质粒的纯化（１）质粒的线性化按照２．３．６的方法提取ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ质粒。由于线性化质粒可以明显提高质粒与酵母基因组的同源重组效率，实验选用ＳａｌＩ限制性内切酶进行线性化。酶切体系如下：表３．２Ｔａｂ．３．２ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒酶切体系ｄｉｇｅｓｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍｏｆｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫｐｌａｓｍｉｄ成分ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ质粒ＳａｌＩ１０×ＨｄｄＨ２０体积３０ｐＬ３ｐＬ５ｐＬ２ｐＬ置于３７℃恒温箱中酶切过夜。（２）线性化产物的纯化①将酶切产物加灭菌水补足至５００ｌｌＬ体系，，加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，振荡混匀，１２００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。大连理工大学专业学位硕士学位论文②将上清转移至１．５ｍＬ离心管中，向溶液中加入１／１０体积的３ｍｏｌ／Ｌ的乙酸钠（ｐＨ５．２），混匀后加入两倍体积的无水乙醇，－８０℃放置１５ｍｉｎ或一２０℃放置３０ｍｉｎ。③１２００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，加入１ｍＬ７０％乙醇。颠倒数次再次离心。④弃上清，彻底风干沉淀物，向沉淀中加入３０ｌｌＬ双蒸水溶解沉淀。３．３．２毕赤酵母感受态的制备及转化（１）毕赤酵母感受态的制备①从斜面试管中取少量菌体接种于３０－５０ｍＬ液体培养基中，３０℃培养２４ｈ。②将菌液按１％一２％的量转接至新的１００ｍＬＹＰＤ液体培养基中，培养过夜。３０℃，２５０ｒ，保证通气性良好。③测ＯＤ６００达到１．０—１．５左右，冰浴放置１５ｍｉｎ，使培养基彻底冷却。此时将超纯水及山梨醇均放到冰上冷却。④将菌液分装至无菌的５０ｍＬ离心管中，４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，收集细胞。⑤弃上清，将离心管倒置１ｍｉｎ，使培养基完全流尽。向茵体中加入４０ｍＬ无菌超纯水，重悬细胞。４℃，４０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，收集细胞。⑥去上清，重复⑤两次。⑦弃上清，留菌体，向菌体中加入４０ｍＬ预冷的１ｍｏｌ／Ｌ山梨醇重悬细胞。４℃，４０００ｒ／ｒａｉｎ，离心５ｍｉｎ，收集细胞。⑧重复⑦一次。⑨弃上清，用５００ｌｌＬ１Ｍ山梨醇重悬细胞，使最终体积为１．３ｍＬ左右。注：山梨醇越少越好。⑩将做好的感受态细胞分装至离心管中，准备电转。（２）ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒的电转化①向感受态细胞中加入１０ｌｌＬ线性化的质粒，轻轻混匀。②将感受态细胞与质粒混合液加入到Ｏ．２ｃｍ的点转杯中，轻敲几下，使液体沉于杯底，擦干点转杯周围的水滴，放在点转仪上准备电转。③设置酵母参数，“劬西”“Ｓｃ０２”，点击Ｐｕｌｓｅ。④取出电转杯，立即加入１ｍＬ冰浴的１ｍｏｌ／Ｌ的山梨醇，用移液器吹打，在温和转移至１．５ｍＬ无菌的离心管中，３０℃静置孵育５－７ｈ。⑤离心１ｍｉｎ。弃掉部分上清，留２００ｌｌＬ左右的上清液，吹打混匀后涂至选择培养基上。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化⑥３０℃倒置培养２—３天，直到长出转化子。３．３．３高拷贝阳性转化子的筛选及ＰＣＲ鉴定（１）高拷贝阳性转化子的筛选高拷贝转化子可以提高产物的表达量，因为ｐＰＩＣ９Ｋ载体上含有含氨苄青霉素和卡那霉素抗性，高拷贝的插入可以提高转化子对Ｇ４１８的抗性，可以用Ｇ４１８筛选高拷贝转化子。将在ＭＤ选择培养基上生长的菌落挑到不含Ｇ４１８的ＹＰＤ平板上，并标上号。然后将菌落依次点种到含不同浓度的Ｇ４１８（０．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍ咖Ｌ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍ∥ｍＬ）的ＹＰＤ培养板上，３０℃培养３—４ｄ，筛选高拷贝阳性转化子。（２）酵母基因组的提取实验用玻璃珠法提取酵母基因组，步骤如下：①ｒ挑取在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上生长的菌落接种于３０ｍＬＹＰＤ液体培养基中，３０℃下振荡培养过夜。②ｒ取１ｍＬ菌液于１．５ｍＬ离心管中，１２０００ｒ／ｍｍ离心５ｍｍ，收集细胞。③ｒ弃上清，向菌体中加入１ｍＬ无菌水，将菌体吹打起来后，同上离心，清洗细胞。④ｒ弃上清，向菌体中加入７００ｌｌＬ的裂解液，将菌体吹打悬浮。⑤ｒ向茵体中加入干净的玻璃珠（约离心管的２／３体积）和２５ｌｌＬ的５ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ。⑥ｒ利用微型涡旋混合仪振荡１０ｍｉｎ。１２０００ｒ／ｍｍ离心２ｍｍ。⑦ｒ将上清液转移至新的１．５ｍＬ离心管中⑧ｒ加入等体积的苯酚／氯仿／异戊醇（２５：２４：１），高速振荡５ｒａｉｎ，１２０００ｒ／ｍｍ离心５ｍｉｎ，抽提ＤＮＡ。⑨ｒ取上清，向上清液中加入１ｍＬ预冷的无水乙醇，一８０℃下沉淀３０ｍｉｎ。⑩ｒ１２０００ｒ／ｍｍ离心５ｍｍ，弃上清，向沉淀中加入７０％乙醇清洗两次。⑨ｒ１２０００ｒ／ｍｍ离心２ｍｍ，弃上清，将沉淀彻底晾干后，向沉淀中加入５０ｌｌＬｌ卫缓冲液。提取的基因组通过１％琼脂糖凝胶电泳分析提取效果。（３）转化子的ＰＣＲ鉴定大连理工大学专业学位硕十学位论文挑取在５ｒａｇ／ｍＥＧ４１８浓度的ＹＰＤ平板上生长的阳性转化子菌株及空载ｐＰＩＣ９Ｋ转化的菌落接种在不含抗生素的ＹＰＤ液体培养基中培养到一定浓度后利用上述方法提取酵母基因组。用ｐＰＩＣ９Ｋ载体的通用引物进行ＰＣＲ扩增。引物序列如下：ＡＯＸ－Ｆ：ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣ从ＴＴＧＡＣＡＡＧＣＡＯＸ—Ｒ：ＧＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ转化子ＰＣＲ反应体系如下：ｌＯ×ｂｕｆｆｅｒｄＮＴＰ２１．ｔＬ２ｌａＬ０．２ｐＬ１ＵＬｌ１ＵｐＭｉｘｔｕｒｅＬＡＴａｑＡＯＸ—ＦＡＯＸ—ＲＬＬｕ阳性转化子基因组ｄｄＨ２０定容到２０ＬｐＰＩＣ９Ｋ空载体转化子ＰＣＲ扩增体系：１０×ｂｕｆｆｅｒｄＮＴＰ套ｍｘｔｕｒｅＬＡＴａｑＡＯＸ．ＦＡＯＸ二Ｒ２２ＬＬＵＵＯ．２ＵＬ１ＩｌＬ１ＵＬｌＵＬ阴性转化子基因组ｄｄＩ－１２０定容到２０ｕＬ反应条件如下：９４℃９４℃６０℃７２℃７２℃１６℃鼬ｍ．１ｎｍ．１ｎＯＳｍ．１ｎｏ厶ＬｆｕＣｙＣｅＳ协∞孙ｃ曼ｍ．１ｏ∞、ｌＬｒｊｎ通过１％琼脂糖凝胶电泳分析ＰＣＲ效果。３．３．４蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定及ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析．２９．蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化（１）蛋白酶Ｋ的诱导表达将经过ＰＣＲ鉴定正确的菌落接种到３５ｍＬＢＭＧＹ培养基中（２５０ｍＬ摇瓶），进行诱导表达，同时挑取一株空载体转化子作为对照进行诱导表达，具体步骤如下：①挑取单菌落接种至３０ｍＬＹＰＤ培养基中，２８℃一３０℃，２２０ｒ，振荡培养１６—１８０Ｄ６００＝４—６。ｈ，②将菌液接种于３５ｍＬＢＭＧＹ培养基中（２５０ｍＬ摇瓶），２８＂Ｃ一３０℃，２２０ｒ，振荡培养１６—１８ｈ，０Ｄ６００＝２—６。③５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，收集细胞。用２００ｍＬＢＭＭＹ培养基重悬细胞，接入１Ｌ摇瓶中，用４层纱布封口。２８—３０℃，２２０ｒ振荡培养。每２４ｈ补加１００％甲醇至终浓度为０．５％。④定期取样，１２测。０００ｒ离心５ｒａｉｎ，去茵体，上清用于酶活测定和ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳检（２）ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析由于蛋白酶Ｋ分泌到培养基中，浓度较低，直接进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳不易观察到条带，需要对样品进行浓缩。样品浓缩的方法有多种，本实验利用三氯乙酸（ＴＣＡ）沉淀法对样品进行浓缩。实验方法如下：①ｒ取菌液１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心５ｍｉｎ，收集表达上清。②ｒ取５００．１０００ｕＬ上清于ＥＰ管中，加入１／１０体积的１００％ＴＣＡ，颠倒１０次混匀。③ｒ样品冰浴大于０．５ｈ，过夜效果更好。④ｒ１２０００ｒ／ｍｉｎ，离心１０．２０ｍｉｎ，可见有棕黑色沉淀，倒掉上清，将ＥＰ管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。⑤ｒ加入２００ｕＬ冰冷的丙酮，用手指轻弹ＥＰ管，洗去管底和管壁残余的ＴＣＡ。⑥ｒ１５０００９，离心１０—２０分钟，倒掉上清，将ＥＰ管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去ｂｕｆｆｅｒ，９５＂ｃａｎ热１０ｍｉｎ，一般沉淀会自动溶解，如果不残余在管口的液体。⑦ｒ加入２０－－５０ｕＬＬｏａｄｉｎｇ溶，用手指轻弹管壁或用２０ｕＬ枪头轻轻吸打，注意整个操作尽量不要碰到管壁，因为管壁可能沾有残余ＴＣＡ。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳步骤如下：①凝胶的制备实验采用１２％的分离胶及４％的浓缩胶体系，具体成分如下：１５ｍＬ１２％分离胶的制备：大连理ｊＩ：大学专业学位硕士学位论文ｄｄＨ２０４．９ｍＬ３０％单丙烯酰胺６．０ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ６．８１３．８ｍＬ１０％ＳＤＳ０．１５ｍＬ１０％过硫酸铵０．１５ｍＬＴＥＭ匣Ｄ０．００６ｍＬ将上述溶液充分混匀后加入制胶器中，约７ｍＬ，然后向制胶器中加入约ｌｍＬ的双蒸水，压平胶面。待分离胶完全凝固后，将水层倒出并用滤纸完全吸干。５ｍＬ５％浓缩胶的制备：ｄ姐２０３．４ｍＬ３０％单丙烯酰胺０．８３ｍＬ１ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．６３ｍＬ１０％ＳＤＳ０．０５ｍＬ１０％过硫酸铵０．０５ｍＬＴＥＭＥＤ０．００５ｍＬ将上述溶液完全混匀后加入制胶器中，插入梳子，待浓缩胶完全凝固后，拔出梳子即可进行电泳。②电泳：将凝固好的胶放入电泳槽中，加入１×电泳缓冲液，利用微量上样器上样。打开电源，将电压设为７５Ｖ，带样品被浓缩成一条直线时，将电压调为１５０Ｖ，电泳１．５—２ｈ。③染色待电泳结束后，将凝胶取出，放入染色盘中，加入考马斯亮蓝染色液，染色２ｈ左右。④脱色待胶染色完毕后，回收考马斯亮蓝染色液，加入脱色液，置于平衡摇床上进行脱色。每３０ｍｉｎ换一次脱色液，直到条带变得清晰可见为止。（３）ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析①将蛋白酶Ｋ样品进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳，方法如３．３．４所述。②ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳结束后，将胶块取下并进行适当修剪。用单蒸水冲洗干净。③根据胶块大小剪切适当大小的ＰＶＤＦ膜。⑤将ＰＶＤＦ膜在甲醇中侵泡２ｍｉｎ，然后置于转膜缓冲液中放置３０ｍｉｎ。⑥将滤纸板在转膜缓冲中侵泡一下，置于转膜仪工作面板上，排除气泡。然后依次放上ＰＶＤＦ膜和胶块，排除ＰＶＤＦ膜和胶块之间的气泡。最后放上滤纸板，加紧。⑦在１００Ｖ电压下转膜４０ｍｉｎ。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化⑧转膜结束后将膜在ＴＢＳＴ溶液中冲洗一下，然后用５％的奶粉封闭１ｈ。⑨用５％奶粉按１：１０００稀释鼠源抗ＨｉｓＴａｇ抗体，将稀释后的抗体与ＰＶＤＦ膜进行杂交１ｈ。杂交结束后，取出膜用ＴＢＳＴ清洗３次，每次１０ｍｉｎ。⑩用５％奶粉按１：２０００稀释二抗（ＨＲＰ标记的羊抗鼠ＩＧｇ），将二抗与ＰＶＤＦ膜杂交ｌｈ。杂交结束后，取出膜用ＴＢＳＴ清洗３次，每次１０ｍｍ。⑩将ＥＣＬ显色剂的Ａ、Ｂ液按１：１混合，加到ＰＶＤＦ膜上显色２ｍｉｎ。将ＰＶＤＦ膜用保鲜膜包住放入曝光盒中。在暗室中把胶片放入曝光盒中曝光２ｍｍ。取出胶片置于显影液中２ｍｍ，漂洗一下，置于定影液中２ｍｍ。将胶片冲洗干净，晾干。３．３．５蛋白酶Ｋ活性测定利用王辉嵋７１等蛋白酶活性测定方法，用偶氮酪蛋白（Ａｚｏｃ痢ｎ）作为底物测定蛋白酶活性。其原理为，在酶的作用下偶氮酪蛋白会释放发光团，通过分光光度法，在３４５处可以定量测定蛋白酶的活性。步骤如下：Ｉｌｎｌ①标准曲线的制作用蒸馏水将成品蛋白酶Ｋ酶粉配制成２０Ｕ／ｍＬ的标准酶液，按表３．３加入以下物质，混匀后于３７℃静止２ｈ。向０－１０组中依次加入１００ｐＬ混匀后室温静止３０处测定吸光值。表３．３标准曲线的绘制Ｔａｂ．３．３ＴｈｅｄｒａｗｉｎｇｏｆｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅＴＣＡ，ｎｎｌｍｉｎ。１２０００ｒ／ｍｍ离心１０ｍｍ，取上清，用酶标仪在３４５②发酵液酶活测定实验组将５０此２％偶氮酪蛋白溶液和２０止稀释一定倍数的发酵液上清混匀，３７℃保温２ｈ。加入１００ｇＬ三氯乙酸溶液（Ｏ．４ｍｏｌ／Ｌ），混匀后静置３０ｍｍ。离心（１２０００ｒ／ｍｍ，１０ｍｍ），取上清，用酶标仪在３４５ｎ／ｌ＇ｌ处测定吸光值。对照组为发酵液ｌｌＬ中先加入１００“Ｌ三氯乙酸，静置１０ｍｍ后，再加入５０２％偶氮酪蛋白溶液，其大连理工大学专业学位硕士学位论文余操作同上。根据标准曲线算出发酵液中蛋白酶Ｋ的活性，计算出的活性与稀释倍数的乘积就是蛋白酶Ｋ的酶活性。４５４３５３导ｎ《２５２ｌ５／１０．Ｓ二０一一～～～…～一一～～…ｒ一０２４６８１０１２１４１６酶活性（Ｕ／ｍＥ）图３：１酶活标准曲线Ｆｉｇ．３．１Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ３．３．６摇瓶中蛋白酶Ｋ表达条件的优化将重组毕赤酵母阳性转化子甘油菌接种到３０ｍＬＹＰＤ培养基中，３０℃，２００ｒ振荡培养至０１）６００为４－６之间。将菌液接种到ＢＭＧＹ培养基中，３０。Ｃ，２００ｒ振荡培养至００６００为２－６之间。无菌条件下，５０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清，用５０ｍＬＢＭＭＹ培养基悬浮菌体，进行诱导表达。（１）诱导时间的优化菌种接种到ＢＭＭＹ培养基中，２８℃条件下进行诱导表达，每天补加０．５％甲醇，定时取样，通过测定样品中蛋白酶Ｋ的活性，确定最佳诱导时间。（２）诱导温度的优化菌体接种到ＢＭＭＹ培养基中后，分别在２０℃、２５℃、３０℃条件下诱导表达，每２４ｈ补加Ｏ．５％甲醇，定时取样。通过测定样品中蛋白酶Ｋ的活性，确定最佳诱导温度。（３）诱导ｐＨ的优化蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化将茵体接种到不同ｐＨ（３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．Ｏ）的ＢＭＭＹ培养基中，每天补加Ｏ．５％甲醇，定时取样，通过测定样品中蛋白酶Ｋ的活性，确定诱导培养基最佳ｐＨ。（４）诱导剂浓度的优化将菌体接种到ＢＭＭＹ培养基中，每天补加不同浓度的甲醇（０．５％、０．７５％、１％、１．２５％、１．５％）进行诱导表达，定时取样，通过测定蛋白酶Ｋ的酶活性，确定最佳的诱导剂浓度。３．３．７发酵罐中蛋白酶Ｋ的诱导表达及浓度测定（１）发酵罐培养蛋白酶Ｋ的表达利用摇瓶优化的表达条件对重组毕赤酵母进行５Ｌ发酵罐发酵，并测定菌体生长曲线。用溶氧偶联法控制甲醇流加量，并用气象色谱检测发酵过程中的甲醇浓度。根据摇瓶培养优化的培养条件，发酵罐培养过程中，菌体生长阶段温度控制在２８℃，诱导表达阶段温度控制在２５℃，整个发酵过程中ｐＨ控制在７．０。上罐发酵培养基一般采用基础盐培养基（ＢＳＭ）。基础盐培养基主要成分为一些无机盐，对酵母菌生长会有一定限制。本实验尝试采用ＢＭＧＹ／ＢＭＭＹ培养基进行发酵。为了降低成本，培养基中没有添加无氨基酵母氮源ＹＮＢ（ＹｅａｓｔＮｉｔｒｏｇｅｎＢａｓｅｗｉｔｈｏｕｔＡｍｉｎｏＡｃｉｄｓ），但需向培养基中多加入一些生物素，并用５０％氨水和５０％磷酸调节ｐＨ，氨水还可以作为酵母生长的氮源。这种培养基也得到了很好的表达效果。（２）ＢＣＡ法测定蛋白酶Ｋ的浓度发酵结束后，利用ＢＣＡ法测定蛋白酶Ｋ的浓度。测定方法如下：标准曲线的制作：①根据样品数量，ＢＣＡ试剂Ａ液与试剂Ｂ液按５０：１的比例配制适量ＢＣＡ工作液，充分混匀。ＢＣＡ工作液室温２４ｈ内稳定。②用ＰＢＳ稀释蛋白标准品，取ｌＯ此稀释至１００止，使终浓度为Ｏ．５足到２０山。⑤各孔加入２００此ＢＣＡ工作液，３７℃放置３０标准曲线如图３．１所示。ｍｉｎ。ｍｇ／ｍｌ。③将标准品按０，１，２，４，８，１２，１６，２０此加到９６孔板的标准品孔中，加ＰＢＳ缓冲液补⑥利用酶标仪测定Ａ弱。处的吸光值，根据标准曲线计算出蛋白浓度。大连理：＝ｌ二大学专业学位硕十学位论文０．１６Ｏ·１４０．１２茧《０－０８０·０６０·０４０．０２０．２０．３０．４０．５蛋白浓度（ｍｇ／ｍＬ）图３．２Ｆｉｇ．３．２ＢＣＡ法测定蛋白浓度标准曲线Ｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ样品中蛋白酶Ｋ浓度的测定：阳性转化子发酵液及阴性转化子发酵液经１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，收集上清，用ｐＬＰＢＳ缓冲液稀释到合适的浓度，取２０此加入９６孔板中，再加入２００ＢＣＡ工作液，于３７℃温育３０ｍｉｎ，在５６２ｌｌｉｎ处测定吸收值，根据标准曲线计算出阳性转化子及阴性转化子中的蛋白浓度。蛋白酶Ｋ的浓度即阳性转化子发酵液中的蛋白浓度与阴性转化子发酵液中蛋白浓度之差。３．４实验结果与讨论３．４．１毕赤酵母的电转化及阳性高拷贝转化子的筛选（１）毕赤酵母的电转化酵母转化方式有多种，如ＬｉＣｌ法、原生质法、电转化法等。其中电转化法效率最高，并且操作简单，但出现假阳性的概率较高，所以还要通过抗性筛选及ＰＣＲ鉴定等。在转化之前先将质粒线性化有助于基因的同源重组，可以大大提高转化效率，实验中曾尝试用没有线性化的质粒及线性化的质粒分别做转化，结果表明，后者的转化效率是前者的数十倍甚至上百倍。线性化后的质粒中含有其他的杂质，会影响毕赤酵母的转化，所以要对线性化的质粒进行纯化。实验中尝试了利用酚／氯仿／异戊醇抽提法及胶回收试剂盒纯化法进行线性化质粒纯化，均得到了较好的纯化效果。实验发现，质粒的浓度及纯度对转化效率有很大的影响，当质粒浓度及纯度较高时，可以明显提高毕赤酵母的转化效率。（２）高拷贝转化子的筛选蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化将在ＭＤ组氨酸缺陷型的选择培养基上生长的菌落先挑到不含Ｇ４１８抗生素的ＹＰＤ平板上并编号如图３．３Ａ，共２００个菌落。然后将这些菌落依次点种到含有Ｏ．７５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上，在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上生长出了１７个菌落，如图３．３Ｂ。这些菌落还需通过ＰＣＲ扩增进一步鉴定。ＡＢ图３．３Ｆｉｇ．３Ｇ４１８筛选高拷贝阳性转化子Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｈｉｇｈ—ｃｏｐｙｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓｂｙＧ４１８Ａ：转化子在不含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基生长情况Ｂ：转化子在含５ｍｇ／ｍｌＧ４１８的ＹＰＤ培养基的生长情况（３）阳性转化子的ＰＣＲ鉴定提取在含５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的ＹＰＤ平板上长出的菌落及ｐＰＩＣ９Ｋ质粒转化的阴性转化子提取基因组，并进行ＰＣＲ扩增，扩增结果如图３．４所示。从Ａ图中可以看出，除１０号没有扩增出条带外，其他的都扩出了两条条带，一条约２．２ｋｂ的片段（菌株上的野生型ＡＯＸｌ基因），另一条约１７００ｂｐ的片段（目的基因ＰｒｏＫ（１２００ｂｐ）和载体上ＡＯＸｌ（４９２ｂｐ）之和）。空载体转化子也扩增出了两条带，一条约２．２ｋｂ的片段为菌株上的野生型ＡＯＸｌ基因，另一条约５００ｂｐ的片段是未插入任何序列的空载体上ＡＯＸｌ（４９２ｂｐ）基因片段。若ＰＣＲ产物有２条带，一条为ＡＯＸｌ基因的２．２ｋｂ条带，另一条为目的条带，说旺ＪｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ质粒已经整合到毕赤酵母基因组中，并且是Ｍｕｔ＋（甲醇利用型），可以以甲醇为唯一碳源进行诱导。大连理：［大学专业学位硕士学位论文图３．４Ｆｉｇ．３．４转化子的ＰＣＲ扩增分析ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓａｎｄｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｌｒｏｌＡ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１－１７：ｐＰＩＣ９Ｋ－ＰｒｏＫ转化子ＰＣＲ扩增结果Ｂ：Ｍ：ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ１～６：ｐＰＩＣ９Ｋ转化子ＰＣＲ扩增结果３．４．２蛋白酶Ｋ的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定及活性测定将经过ＰＣＲ鉴定正确的转化子接种到诱导培养基中进行诱导表达，由于ｐＰＩＣ９Ｋ是一种分泌表达载体，所以只需对发酵液进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析即可。诱导表达１４４ｈ后收集发酵液，离心去菌体后，取４５０儿上清经１００％ＴＣＡ浓缩后进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳鉴定。结果如图５，从图中可以看出ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ载体转化的酵母在２９ＫＤａ左右有一条条带，与成品蛋白酶Ｋ大小相似，而ｐＰＩＣ９Ｋ空载转化的酵母没有类似的条带。用偶氮酪蛋白法测定的发酵液也有活性，说明蛋白酶Ｋ在酵母体内实现了分泌表达。卜１孙㈨１）一＿簟图３．５蛋白酶Ｋ的诱导表达Ｆｉｇ．３．５ＴｈｅＳＤＳ·ＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｙｅａｓｔＭ：ｐｒｏｔｅｉｎｍａｒｋｅｒ１：对照组发酵液上清２：阳性转化子发酵液上清３：成品蛋白酶Ｋ（购自大连宝生物公司）蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化３．４．３蛋白酶Ｋ样品的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析为确定表达的蛋白为蛋白酶Ｋ，利用ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ进行分析。结果如下图所示。图３．６蛋白酶Ｋ的ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析Ｆｉｇ．３．６ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ在蛋白酶Ｋ的Ｃ端加上了六个组氨酸标签，所以利用抗Ｈｉｓ．Ｔａｇ抗体进行杂交，结果显示，片段具有很好的特异性，且大小正确，说明目的蛋白即为蛋白酶Ｋ。３．４．４诱导时间对蛋白酶Ｋ表达量的影响随着菌体的生长，目的产物的表达量逐渐增加，当菌体生长到一定程度后，产物分泌减少，而菌体的代谢产物增加，并且菌体裂解会释放一些蛋白酶，对产物的活性及稳定性具有一定的影响。因此诱导时间也是影响产物表达量及稳定性的关键因素。实验在２８℃，甲醇浓度为０．５％的条件下诱导表达１６８ｈ，每２４ｈ取一次样，通过测定酶活浓度比较蛋白酶Ｋ的表达量。如图３．７所示，通过数据统计分析发现，不同诱导时间下，蛋白酶Ｋ的表达量差异显著。在１２０ｈ之前，酶活浓度逐渐升高，说明产物量逐渐增加，在１２０ｈ时蛋白酶Ｋ酶活浓度最高，表达量最高，之后表达量略有降低，但不明显，可能与蛋白酶Ｋ本身性质稳定有关。因此在１２０ｈ左右收获产物可以得到较高的表达量。大连理工大学专业学位硕士学位论文６５３２山０拍船７＂２∞１２０’４４’∞ｌｎｄｕ穗Ｉ∞ｌｉｍｅ（ｈ）图３．７诱导时间对表达量的影响Ｆｉｇ．３．７ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．５诱导剂浓度对蛋白酶Ｋ表达量的影响毕赤酵母是一种甲醇利用型酵母，可以以甲醇为唯一碳源，并且ｐＰＩＣ９Ｋ—ＰｒｏＫ转化子是Ｍｕｔ＋型，需要甲醇作为诱导剂。甲醇浓度过低会影响菌体生长及产物的表达，但浓度过高会对菌体细胞产生毒害作用，也会影响产物的表达。所以要对甲醇浓度进行优化。通过测定在不同诱导剂浓度下表达的蛋白酶Ｋ的活性浓度来比较蛋白酶Ｋ的表达量。图３．８为测定诱导第１２０ｈ的发酵液的酶活性浓度，从图中可以看出，不同诱导剂浓度下蛋白酶Ｋ的表达量没有显著差异，在０．７５％时蛋白酶Ｋ表达量略有升高，所以实验选用０．７５％的甲醇浓度作为以后的诱导浓度。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化图３．８诱导剂浓度对表达量的影响Ｆｉｇ．３．８ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｃｅｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０１１ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．６诱导ｐＨ对蛋白酶Ｋ表达的影响酵母在ｐＨ２．８－８．０条件下均可以生长，不同ｐＨ条件下茵体的生长状态及活性仍存在差异，并且ｐＨ对目标产物的稳定性也有一定的影响。实验利用不同ｐＨ的磷酸缓冲液作为培养基的缓冲体系配ｆｌ；ＵｐＨ为３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０的诱导表达培养基，在甲醇浓度为０．７５％的条件下进行诱导表达，通过测定发酵液中蛋白酶Ｋ的活性浓度比较产物的表达量，结果如图３．９所示。从图中可以看出，不同ｐＨ条件下，蛋白酶Ｋ的表达量差异显著，在ｐＨｉ７．０时酶活性浓度最高，表明此ｐＨ条件下蛋白酶Ｋ的表达量最高。实验发现，在ｐＨ为３．０或４．０时菌体生长缓慢，在ｐＨｉ５．０－８．０时菌体能够正常生长，但ｐＨ为７．０时活性最高，可能由于ｐＨ也会影响蛋白酶Ｋ的活性。通过数据分析，选用ｐＨ７．０为诱导条件。大连理工大学专业学位硕士学位论文６５‘３２ｍ∈＾ｚｕ山１２３‘６ｅ７８９ｐＨｏｆ盯埒曲ｕｍ图３．９ｐＨ对蛋白酶Ｋ表达量的影响Ｆｉｇ．３．９ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｐＨｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．７诱导温度对蛋白酶Ｋ表达量的影响温度是影响产物表达量的一个重要因素，对外源蛋白的活性及稳定性也有很大影响。毕赤酵母最适生长温度为２８—３０℃，研究报道，在１５－３０℃之间均可以进行外源基因的诱导表达。温度升高，会提高外源蛋白的表达，但是较高的表达效率会导致蛋白折叠错误，还会使菌体死亡。降低温度可以诫缓菌体的生长代谢及产物的表达，提高外源蛋白折叠的正确率，但是会降低产物的表达量。因此选择合适的诱导温度对提高外源蛋白的表达量是至关重要的。实验测定了在２０℃、２５℃和３０℃下诱导的蛋白酶Ｋ的活性（如图３．１０），通过比较活性的高低确定蛋白酶Ｋ表达量的大小。从图中可以看出，不同温度下，蛋白酶Ｋ的表达量差异显著，在２５℃下蛋白酶Ｋ的表达量最高；在２０℃下，菌体生长缓慢，蛋白酶Ｋ表达量较低；２８℃下，菌体生长较快，但测得的酶活性稍低于２５℃诱导下的酶活性，可能与蛋白酶Ｋ的稳定性有关。蛋白酶Ｋ的密码子优化及其在酵母中的表达与分离纯化７６５４３２，Ｏ１５加筠Ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（℃）图３．１０温度对蛋白酶Ｋ表达量的影响Ｆｉｇ．３．１０ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐｒｏｔｅｉｎａｓｅＫ３．４．８发酵罐发酵表达蛋白酶Ｋ利用前面摇瓶发酵优化的表达条件进行５Ｌ发酵罐发酵，菌种接入发酵罐后每小时取一次样，测定样品的茵体浓度，绘制标准曲线，如图３．１１所示。从图中可以看出，菌体生长２０ｈ后，生长进入稳定期，此时开始诱导蛋白酶Ｋ的表达。在菌体生长阶段，温度设为２８℃，ｐＨｉ７．０，通气为０．９ｖ／（ｖ·ｒａｉｎ），转数为３３０ｒ。上罐１６ｈ左右，溶氧ＤＯ突然上升，说明发酵罐内原有的甘油已消耗尽，补加甘油使菌体继续生长至菌体浓度不再增加。此时菌体密度０１）６００吸光值为２０左右，停止补加甘油，饥饿２０ｍｉｎ后，开始补加甲醇诱导。诱导时，温度设为２５℃。甲醇的补加和ＤＯ偶联，当溶氧高于３５％时，补加甲醇，并利用气象色谱检测甲醇浓度，使其浓度处于０．７５％一１．Ｏ％之间。利用优化的条件，蛋白酶Ｋ的表达量可以达到２．２ｇ／Ｌ。在相同的条件下，发酵罐诱导蛋白酶Ｋ的表达量是摇瓶诱导蛋白酶Ｋ表达量的６—７倍左右，这可能由于发酵罐发酵比摇瓶发酵的通氧量更充足。·溶氧量是影响高密度发酵的关键因素。溶氧量主要取决于通气量、搅拌功率及罐压等因素，因此可以通过提高通气大连理．Ｔ．大学专业学位硕士学位论文量，增加搅拌功率等方法增加溶氧。但是溶氧过高会导致茵体氧中毒，从而抑制菌体的生长繁殖。图３．１１毕赤酵母生长曲线Ｆｉｇ．３．１１ｔｈｅｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｏｆｙｅａｓｔ３．５小结利用电转化法将上一章构建的ｐＰＩＣ９Ｋ．ＰｒｏＫ质粒导入酵母体内，并利用营养缺陷型培养基及ＰＣＲ鉴定筛选阳性转化子，利用含Ｇ４１８的ＹＰＤ培养基筛选高拷贝转化子，最后筛选出１７个能够在含有５ｍｇ／ｍＬＧ４１８的培养基上生长的阳性转化子。诱导表达后通过ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析及酶活测定，确定了蛋白酶Ｋ在毕赤酵母中能够分泌表达。通过对蛋白酶Ｋ诱导条件的优化，实现了蛋白酶Ｋ的高效表达，在５Ｌ发酵罐中蛋白酶Ｋ的表达量可以达到２．２∥Ｌ发酵液。