宇文皓月
——羟胺三氯化铁法
实验目的
1. 掌握三氯化铁比色法的实验原理、分析步调及酶测定的临床意义。
2. 了解罕见全血胆碱酯酶活性测定方法的优缺点、注意事项。
3. 学会末梢血的收集。
实验原理
血液胆碱酯酶使乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸。未被胆碱酯酶水解而剩余的乙酰胆碱和碱性羟胺反应，形成红色羌酸铁络合物。颜色深度与剩余乙酰胆碱的量成正比。在波长520nm比色定量，由水解的乙酰胆碱的量计算胆碱酯酶活性。
试剂和资料
蒸馏水
盐酸溶液(1＋2)
碱性羟胺溶液
磷酸盐缓冲液(PH＝7.20)
三氯化铁溶液
氯化乙酰胆碱尺度液
分光光度计
10mL比色管
漏斗
恒温水浴箱，控温±0.5℃
采血针头
血色素吸管
采样、运输和保管
用血色素吸管，取指血20μL，注入比色管中(事先加入0.98mL磷酸盐缓冲液)，立即进行测定。
实验步调
A 样品管+0.98mL 磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min
+1.0mL乙酰胆碱应用液 37℃水浴 30min
B 对照管0.98mL磷酸盐缓冲液+0.02mL全血 37℃水浴 5min
+1.0mL水 37℃水浴 30min
C 尺度管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min + 1.0mL乙酰胆碱应用液37℃水浴 30min
D 空白管1.0mL 磷酸盐缓冲液 37℃水浴 5min +1.0mL水
37℃水浴 30min
水浴之后对A、B、C、D四个试管分别进行以下操纵：
1.加入 4.0mL 碱性羟胺溶液，充分振摇 2min；
2.加入 2.0mL 盐酸溶液，充分振摇 2min；
3.加入 2.0mL 三氯化铁溶液，充分振摇；
4.滤纸过滤，520nm比色。
实验结果
表1-1 520nm波长下样品的吸光度
样品编号 A B C D
吸光度 0.299 0.003 0.538 0.000
结果计算
①计算酶活性的绝对值
带入得： Xs==3.149μmol
Xs：水解乙酰胆碱的浓度，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
A：以试剂空白为参比的在波长520nm处样品管的吸光度值；
B：以试剂空白为参比的在波长520nm处对照管的吸光度值；
C：以试剂空白为参比的在波长520nm处尺度管的吸光度值。
②计算酶活性的相对值
Y==197
Y—酶活性的相对值，%；
Xs—被测血样中酶活性的绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)；
Xc—正凡人血中酶活性绝对值，μmol(0.02mL·37℃·30min)。Xc=1.60μmol(0.02mL·37℃·30min)
讨论
1.由于未在网上查到北京市居民胆碱酯酶活性的参考尺度，遂以课件上浙江地区健康人胆碱酯酶活性绝对值作为参考。即：女：3.19 ± 0.398 μmol ；因3.149μmol在3.19 ± 0.398 μmol的区间内，故该样本的胆碱酯酶活性属正常范围。
2.各组所测数值偏差较大，可能与操纵差别如采血时间、振摇是否充分、加热时间等导致胆碱酯酶活性变更有关。
3. 采血要迅速，防止凝固及氧化；振摇要充分，同时防止液体溅出；比色时有以D管调零。
注意事项
1.采血前应准备好试管，提前加入磷酸盐缓冲液；
2.采血时严格消毒，用过的采血针放入利器筒中，棉签放入垃圾桶中，不成混放；
3.准确控制水浴的温度和时间，否则会影响实验结果；
4.加入三氯化铁显色后，20 min内比色。
