槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

2024年4月2日发(作者：繁衍什么意思)

第39卷第4期中山大学学报（医学版）

2018年7月JOURNALOFSUNYAT⁃SENUNIVERSITY（MEDICALSCIENCES）

Vol.39

July2018

No.4

槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

肖洁，尹松梅，谢双锋，李益清，聂大年，马丽萍，王秀菊，吴裕丹，刘红云

（中山大学孙逸仙纪念医院血液内科，广东广州510120）

摘要：

【目的】观察槲皮素对急性髓系白血病HL-60细胞凋亡与自噬的影响及腺苷酸活化蛋白激酶

（AMPK）活性的变化，探讨槲皮素抗白血病的分子机制。【方法】流式细胞仪、电镜、蛋白质印迹法检测槲皮素孵

育HL-60细胞24、48h后细胞凋亡与自噬的水平；检测槲皮素作用后HL-60细胞AMPK、p-AMPK的表达；流式、

蛋白质印迹法检测不同浓度槲皮素与AMPK小分子抑制剂CompoundC共同孵育HL-60细胞后AMPK活化的情

况及细胞凋亡、自噬的变化。【结果】槲皮素可诱导HL-60细胞发生凋亡，且细胞凋亡率与槲皮素浓度、作用时

间呈正相关。槲皮素浓度越大，细胞凋亡率越高（P=0.000）；随着作用时间的延长，细胞凋亡率进一步增加（P=

0.000

荧光标记自噬体后用流式细胞仪对荧光强度进行检测，

）；不同浓度槲皮素（25和50μmol/L）与HL-60细胞共同孵育

结果发现槲皮素作用后细胞内绿色荧光强度明显较对照

24h及48h后，电镜观察到自噬体形成；绿色

组增加（P=0.001）；Westernblot检测LC3Ⅱ/Ⅰ比值增高（P<0.001）；证实槲皮素能够诱导HL-60细胞发生自

噬。槲皮素能够浓度依赖性的激活AMPK活性，使得AMPK的磷酸化水平增高（P=0.001）。槲皮素与Compound

C

皮素

联合用药组与单用槲皮素组比较，

+CompoundC组与单用槲皮素组比较，

p-AMPK

细胞凋亡率下降

的表达降低，Compound

（P<0.001

C能够阻断槲皮素诱导的

）；抑制AMPK的活性后，

AMPK

槲皮素诱导细胞

磷酸化。槲

凋亡的作用减弱。槲皮素+CompoundC组LC3Ⅱ/Ⅰ比值低于单用槲皮素组（P<0.001）；抑制AMPK的活性后，槲

皮素诱导细胞自噬的作用减弱。【结论】槲皮素通过诱导HL-60细胞凋亡与自噬发挥抗白血病作用，AMPK可能

是槲皮素诱导细胞凋亡与自噬的重要信号分子。

关键词：

槲皮素；急性髓系白血病；凋亡；自噬；腺苷酸活化蛋白激酶

中图分类号：R733.71

文献标志码：

A

文章编号：

1672-3554（2018）04-0501-09

QuercetinModulateAMPKActivityandInduceApoptosisandAutophagyinHL-60Cells

XIAOJie

1

，YINSong-mei

1

，XIEShuang-feng

1

WUYu-dan

，LIYi-qing

1

，NIEDa-nian

1

，MALi-ping

1

，WANGXiu-ju

1

，

1

，LIUHong-yun

1

（DepartmentofHematology，SUNYat-nMemorialHospital，SUNYat-nUniversity，Guangzhou510120，China）

Abstract：

【Objective】Toexploretheanti-leukemiamechanismofquercetinthroughobrvingapoptosisand

autophagy

effect

cytometry

ofquercetin

ofHL-60

，Western-blot

on

cells

apoptosis

andexamining

andelectron

andautophagy

theexpressions

microscopy.

in

The

human

proteins

acute

ofAMP-

expression

myeloid

activated

leukemia

protein

ofAMPK，

HL-

kina

p-AMPKin

60cells

（AMPK

HL-60

were

）.

detected

【Methods

cells

by

】

flow

The

n-blotandflowcytometrywereudtotesttheAMPKandp-AMPK

incubated

expressions

inhibitor

andthechangofapoptosisandautophagyinHL-60cells，

were

microscopy

both

（Compound

the

inHL-60

majorfactors

C）.【Results】Quercetininducedcellapoptosis.

which

Thequercetin

wereincubated

concentrations

withquercetin

andtime

and

of

AMPK

action

cellswhich

affecting

were

the

incubated

apoptosis

with

of

different

HL-60

concentrations

ophagosomes

ofquercetin（25

were

，50

obrvated

μmol/L）for

by

24

electron

hand

收稿日期：2018-03-12

基金项目：广东省基础与应用基础研究专项（2016A030313270）；广东省医学科研基金（A2016070）

作者简介：肖洁，博士，主治医师，研究方向：血液肿瘤的防治，E-mail:xiaojie3@；尹松梅，通信作者，E-mail:yinsongmei@

502

中山大学学报（医学版）第39卷

48

control

significant

groups

difference

andthe

of

different

autophagy

concentration

fluorescence

quercetin

intensitywhich

groups

were

（P=

analyzedbyflowcytometryweresignificantamongthe

phosphorylation

among

Compound

of

the

AMPK

control

in

group

HL-60

and

cells

thedifferentconcentrationquercetin

0.001）.

groups

Thedifference

（P<0.001

ofLC3Ⅱ/Ⅰ

）.Quercetin

ratios

activated

werealso

the

inducedby

C

quercetin

，CompoundCcannotonlyinhibit

（P=

the

0.001

phosphorylation

）.WhileHL-60

ofAMPK

cellswere

，but

incubated

alsothe

both

apoptosis

with

and

quercetin

autophagy

and

modulatedtheactivity

in

ofAMPK.

HL-60cells.【Conclusions】QuercetininducedapoptosisandautophagyinHL-60cellsthrough

Keywords：quercetin；acutemyelocyticleukemia；apoptosis；autophagy；AMP-activatedproteinkina

［JSUNYat⁃nUniv（MedSci），2018，39（4）：501-509］

急性髓系白血病是成年人血液系统最常见的人AMPKalpha1+AMPKalpha2单克隆抗体、兔抗

恶性肿瘤之一。为提高急性白血病的治愈率，延人单克隆

长患者生存，要不断寻找针对肿瘤细胞的新型药

物。槲皮素摩尔分子质量为

pha2（phospho

AMPK

T172

alpha

）抗体、

1（phospho

兔抗人LC3B

T183）

抗体、

+AMPK

鼠抗人

al⁃

O

302.238g/mol，分子

式为C

GAPDH

157

物，几乎无毒性，

H

10

。其是一种植物来源的黄酮类化合

因其强抗氧化性和抗癌功效，多

1.2细胞分离与培养

单克隆抗体购自英国Abcam公司。

年来受到广泛关注。槲皮素被认为是一种“分子

靶向药物”，可以干扰肿瘤细胞的信号转导通路，

3%

37℃

谷

HL-60

、

氨

5%

酰

细胞复苏后，接种于含10%胎牛血清、

调节分子转导通路的关键靶点使细胞死亡

［1-2］

。

CO

胺的RPMI1640完全培养基中，置于

2

换液

细胞培养箱中培养，每2～3d传代

凋亡和自噬的调控与肿瘤发展密切相关，而腺苷

酸

1.3

1

研究方法

次，取处于对数生长期的细胞进行实验。

AMPK

活化蛋白激酶（AMP-activatedproteinkina

1.3.1

凋亡细胞

流式细胞仪

取浓度为

AnnexinV-FITC+Pl

0、25、50和100μmol/L

染色法检测

槲皮

谢异常可诱发细胞凋亡及自噬。前期的研究结果

）是调控细胞能量代谢的关键分子，能量代

，

素孵育

证实槲皮素能够诱导HL-60细胞内Bcl-2的表

达，升高Bax的表达，使Bax同源二聚体形成增多，

10min（

24

r=

、

15

48

cm

h的

），

HL-60

PBS洗涤两次后重悬，

细胞，2000r/min

调整细

离心

胞密度为

激活凋亡信号通路下游靶蛋白Caspa-3，诱导凋

亡

［3］

。而槲皮素对急性髓系白血病自噬的影响目

μLAnnexinV-FITC

1×10

6

/mL

，2.5

。取细胞悬液

μLPI。避光孵育

50μL，

30

加入

min

5

流式细胞仪测定细胞凋亡率。早期凋亡细胞

，

前尚未见相关研究报道。本研究将槲皮素作用于

HL-60

nexinV-FITC

影响，观察槲皮素孵育后

细胞，观察其对HL-60

HL-60

细胞凋亡及自噬的

细胞腺苷酸活化

FITC

（

An⁃

蛋白激酶（AMPK）的活性变化，探讨槲皮素诱导

1.3.2

（+）

透射电镜检测槲皮素对

PI（+）

+

。

）PI（-），晚期凋亡细胞AnnexinV-

影响

收集对数生长期的HL-60

HL-60

细胞，

细胞自噬的

凋亡与自噬可能的分子机制。

min

1000r/

1材料与方法

重悬细胞，

离心5min（

10

计数，

r

接种于

=15cm

6

）

孔板，

，去上清。完全培养基

每孔接种细胞1×

6

个。槲皮素设高浓度组（50μmol/L）、低浓度组

（25μmol/L）。在相同实验条件下，各处理组细胞

1.1

在培养箱中共同孵育24h及48h，每组设3个平

人急性髓细胞白血病细胞

细胞株与主要试剂

HL-60购于中国医

行孔。1000r/min离心5min（r=15cm），收集细

学科学院血液学研究所。槲皮素、3-Methyladenine

胞，

购自美国SigmaChemical公司；Compoundc购自德

国Merck公司；RPMI1640培养基购自美国Gibcol

30%

2.5%戊二醛4℃固定，1%

次

、50%、70%、80%、90%、95%

锇酸固定

的酒精各

20

1次，

min

每

。

公

AnnexinV-FITC

司；自噬检测

试剂盒购自美国

试剂盒购自英

Bender

国Abcam

公司；

公

鼠抗

司；

3

2

丙酮浸泡

5min；100%

次，每次1

1

h

h

丙酮2次，每次10min。1/3树脂+2/

，

；

第

2/3

3次过夜。用环氧树脂以倒扣包

树脂+1/3丙酮浸泡1h；纯树脂

第4期

肖洁，等.槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

埋法进行包埋。在烤箱中70℃聚合24h。常规

修块，

AMPK

503

200

超薄切片机切片。超薄切片厚子抑制剂

蛋白的表达变化。并观察加入

CompoundC后槲皮素对细胞内

AMPK

AMPK

小分

1h。双蒸水洗

～300网孔的镍网上。置

3次，每次10

1%

min。

H

80nm，载于

2

5%

O

2

内

醋酸铀

10min

（双

至

及

蒸水配制）染5min，然后用双蒸水洗。枸橼酸铅

1.3.6

p-AMPK

和蛋白质印迹法检测

流式细胞仪

表达影响的变化。

AnnexinV-FITC+Pl

CompoundC抑制

染色法检测

AMPK活

染色

1.3.3

5min

流式细胞仪检测自噬信号

，双蒸水洗净。透射电镜观察。

取6孔细胞培

性后槲皮素对凋亡及自噬的影响

实验分为对照

组、槲皮素（25μmol/L）组、槲皮素（50μmol/L）组、

养板，每孔细胞密度为1×10

6

cells/mL

（25

。实验分组

槲皮素（25μmol/L）

Rapa

为槲皮素（50μmol/L）组、槲皮素μmol/L）组、

μmol/L

异性抑制

）+Compound

+Compound

AMPK的活化后，

C组，观察采用

C组及槲皮素

槲皮素对凋亡及自噬

Compound

（

C

50

特

mmol/L

（1

）

μmol/L

、槲皮素

）

（

组、

50

Rapa

μmol/L

（1

）

μmol/L

+3-MA

）

（

+

5

3-MA

mmol/L

组

）

（

组

5

的影响，明确槲皮素诱导HL-60细胞凋亡与自噬

及槲皮素（25μmol/L）+3-MA（5mmol/L）组。在相

中的分子机制。

同实验条件下，各处理组细胞在培养箱中共同

孵育

1.4

计量资料的描述用均数

统计学方法

±标准差表示（x±s）。

min

缓冲液洗涤细胞

离心

24h

5

，

min

每组设

（r=

3

2次，

15

个平行孔。室温下，

cm

小心移除上清液。细胞重

）收集细胞。用1

1

×

000

检测

r/

多组计量资料间均数比较采用单因素方差分析或

者两因素方差分析，

悬于含有5%胎牛血清的250μL细胞培养基中。

在每个样本中加入自噬检测试剂250μL，混合后

LSD-t检验进行多重

若组间比较存在差异，

比较；所有数据应用

则采用

SPSS

避光，室温下孵育30min。室温下，1000r/min离

学意义。

19.0统计软件处理，检验水准定为P<0.05有统计

心5min（r=15cm），收集细胞，在1×检测缓冲液

中洗涤2次。用500μL新鲜1×检测缓冲液重悬

细

min

胞

。

。

1×

在

检测缓冲液中洗涤

40g/L多聚甲醛溶

3次。在流式分析仪

液中孵育细胞20

2结果

中，选择绿色（FL1）通道分析样本。

2.1

分别用

槲皮素对

0、25

HL-60

、50、100

细胞凋亡的影响

μmol/L槲皮素孵育HL-60

1.3.4

表达

蛋白质印迹法检测细胞中

收集终浓度为0、25、50、100

LC3Ⅱ/Ⅰ

μmol/L

蛋白的

细胞24h及48h后，流式细胞仪双染法检测凋亡

槲皮素

率。采用多因素方差分析进行统计后得出：槲皮

孵育48h的HL-60细胞提取总蛋白。测定蛋白浓

素可诱导HL-60细胞发生凋亡，且细胞凋亡率与

度

槲皮素浓度、作用时间均相关。槲皮素浓度越大，

PAGE

后每

细胞凋亡率越高（F=267.81，P=0.000）；随着作用

闭

后转移到

孔按50

PVDF

μg蛋

膜上，

白上样

5%

。

的脱脂奶

将蛋白经SDS-

时间的延长，细胞凋亡率进一步增加（F=214.47，

1∶

1

1

h

000

后，

，

加入含一抗的封闭液中

转膜条件：300mA恒

（

流

LC3

转

：稀释比例

37℃封

AMPK：稀释比例1∶1000，转膜条件：300

膜

mA

15

恒流

min；

P=0.000）；时间和药物浓度两因素存在交互效应

（

转膜62min；p-AMPK：稀释比例1∶1000，转膜条

件：300mA恒流转膜64min），4℃摇床孵育过

2.2

F=16.88

槲皮素对

，P=

HL-60

0.01；表

细胞自噬的影响

1，图1）。

夜。用

HRP标记的羊抗鼠

TBST将PVDF

IgG

膜洗

单抗或羊抗兔

3次后放入含

IgG

1∶

单抗封

10000

噬

2.2.1

将不同浓度的槲皮素

电镜观察槲皮素诱导

（25

HL-60

μmol/L、

细胞发生自

50μmol/L）

与

闭液中，室温轻摇1h。洗涤后进行发光鉴定，并

用凝胶分析软件对图象进行分析。

48

HL-60

察槲皮素作用前后的细胞，

h收集细胞，

细胞进行共培养，

经戊二醛固定

分别于培养后

发现槲皮素处理组细

（不吹悬）后，电镜观

24h及

1.3.5蛋白质印迹法检测槲皮素加或者不加

胞内可观察到双层膜泡结构，即自噬体（图2）。

AMPK

AMPK

抑制剂CompoundC

2.2.2

细胞内荧光强度

绿色荧光标记自噬小体，流式细胞仪检测

组、槲皮素

、p-AMPK

作用后HL-60细胞中

（25μmol/L

蛋白表达的变化

）组及槲皮素

实验分为对照

雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）是

（50μmol/L）

目前实验常用的自噬诱导剂。本实验将细胞分为

组，观察槲皮素孵育48h后细胞内AMPK、p-

空白对照组、阳性对照组（1μmol/LRapa）、低浓度

504

中山大学学报（医学版）第39卷

表1

槲皮素对HL-60细胞凋亡的影响

Table1

TheapoptosisratesofHL-60cellsincubationwithquercetin（n=6）

0

Quercetin/(μmol/L)

24

25100

FP

48

h

5.09±

0.52

0.85

14.18

30.80

±

±

3.37

1.06

26.20

50

32.26

75

h

4.82±

40.22

±

±

1.51

0.9950.18

±

±

2.63

4.20

41.29

67.50

±

±

4.28

4.38203.92

80.040.00

0.00

A

B

80

Quercetin0255075

1）1

100

）

μmol/L

s

60

24

48

h

h

n

a

e

m

%

l

/

e

60

t

1）

a

r

s

）

1）

a

n

i

g

40

r

a

i

m

s

o

40

1）

1

d

t

p

e

t

o

a

p

A

20

m

20

i

t

s

0

1）

E

24h48h

C

0

D

0

Quercetin/

2550

（μmol/L

75

）

100

（

24

+）

h

.

（

The

a：

A）

Quercetin

and

apoptotic

48h

0

（

rates

μmol/L

B）.The

ofHL-60

，

early

b：Quercetin

apoptosis

cellswere

25

was

detected

μmol/L

defined

by

，c

as

flow

：Quercetin

PI（

cytometry

-）AnnexinV-FITC

afterthecells

50μmol/L，d：

（

Quercetin

+）

incubated

；thelate

with

75μmol/L

apoptosis

quercetin

，e

was

（

：Quercetin

defined

0，25，

as

50

100

PI

，

μmol/L.

（

75

+）

，100

AnnexinV-FITC

μmol/L）for

C：Apoptosis

rates

jor

rreprentsmeanvaluesof

cant

factors

between

which

the

affected

twofactors

the

，

apoptosis

quercetin

of

concentrations

HL-60cells，

图1槲皮素作用

and

1）P

times

<0.001.

rcetinconcentrationisoneofthema⁃

24

of

h

action

D：

及48

，

Interaction

h

P

后

<0.01.

effectcontourmapshowsthattheinteractionixtremelysignifi⁃

HL-60细胞凋亡率变化

Fig.1TheapoptosisratesofHL-60cellsincubationwithquercetin

槲皮素（25μmol/L）组、高浓度槲皮素（50μmol/L）

组。将细胞与药物共同作用24h，加入自噬检测

pa

均荧光强度差异显著

）组、Rapamycin（1μmol/L

（F=30.13

）+3MA

，P

（

=

5

0.001

mmol/L

）。各组

）组平

试剂，采用流式细胞仪检测上述各组细胞中平均间多重比较得出以下结论：Rapa可诱导细胞发生

自噬荧光强度，采用单因素方差分析进行统计，结自噬，与空白对照组比，细胞内平均自噬荧光强度

果发现对照组、1μmol/L雷帕霉素（Rapamycin，Ra⁃高于空白对照组（P=0.001）。3-MA预处理细胞

第4期

肖洁，等.槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

505

Quercetin25μmol/LQuercetin50μmol/L

槲皮素（50μmol/L）组与空白组比较，差异有统计

学意义（P<0.001）。加或不加自噬抑制剂3-MA

（5mmol/L），槲皮素诱导的细胞自噬有明显变化，

自噬抑制剂3-MA能够抑制槲皮素诱导的细胞自

24h

噬

2.2.3

（图3B）。

细胞中

蛋白免疫印迹法检测槲皮素处理后

LC3Ⅱ/Ⅰ的变化

LC3是目前最明确贯穿

HL-60

整个自噬过程并能出现在晚期自噬溶酶体中的自

噬相关蛋白，自噬激活时，LC3-Ⅰ在泛素样反应

48h

酶的作用下与磷脂酰乙醇胺偶联生成

LC3-Ⅰ

LC3-Ⅱ

外膜。LC3Ⅱ/Ⅰ

定位于胞质内，

比值的变化能够反应细胞内自噬

LC3-Ⅱ定位于自噬体的内

。

水平的高低。将细胞分为空白对照组、槲皮素

（25μmol/L）组、槲皮素（50μmol/L）组、槲皮素

图2槲皮素诱导HL-60细胞内自噬小体生成

Fig.2QuercetininducedautophagyinHL-60cells

（

μmol/L

25μmol/L

收集各组细胞，

）+3-MA

）+3-

（5

MA

mmol/L

（5mmol/L

）组。药物处理

）组及槲皮

24

素（

h

50

后

后，Rapa诱导的细胞自噬被抑制，与Rapa组比较，

差异有统计学意义（P<0.001）；与空白对照组比较

Ⅱ/Ⅰ

差异无统计学意义（P=0.70，图3A）。

μmol/L

的

）

变

组、

化

槲皮素

。

Western

结果

（50

表

blot

明

μmol/L

，

检测各组细胞中

对

）

照

LC3

组各组之间

组、槲皮素（

LC3

25

μmol/L

自噬平均荧光强度在对照组、槲皮素（25

Ⅱ/Ⅰ

素处理后细胞内

比值存在差异

LC3Ⅱ/Ⅰ

（F=79.79

比值明显高于空白对照

，P=0.000），槲皮

组，且随着槲皮素浓度的增高，细胞内LC3Ⅱ/Ⅰ比

有统计学意义

）组及槲皮素

（F=

（

42.24

50μmol/L

，P<0.001

）组各组间的差异

）。槲皮素诱

值增高更明显。加入自噬抑制剂

HL-60

3-MA

导后HL-60细胞内平均自噬荧光强度均高于空白

对照组，且随着槲皮素浓度的增高，诱导自噬的效

应更加明显。组间多重比较，槲皮素（25μmol/L）

60细胞

细胞

24

4

h，

h

细

后，

胞

再予不同浓度槲皮素孵育

预处理

内LC3Ⅱ/Ⅰ比值降低（

HL-

组与空白组比较，差异有统计学意义（P=0.01）；

0.000

P=

所抑制

）

（

，证明槲皮素诱导的细胞自噬能够被

表2，图4）。

3-MA

）

y

100

2）

1

3）

y

g

150

4）

5）

g

a

a

h

6）

h

p

p

o

o

t

t

80

u

u

a

a

f

f

o

100

o

y

y

60

t

i

t

i

s

s

n

n

e

e

t

t

40

n

n

i

50

i

n

n

a

a

e

e

M

20

Rapa

0

A

M

3-MA

-

-

+

-

+

+

Quercetin

0

B

3-MA

-

-

25

-

50

-

-

+

25

+

50

+

0.01vs

A：

control

HL-60

group

cells

；3

treated

）P=0.000

with1

vs

μmol/L

Rapa+3-MA

Rapamycinor

group.

both

B：HL-60

with3-MA

cellsuntreated

for24h（

or

n=

treated

3）.1）

with

F=

quercetin

30.13，

（

P

25

=

，

0.001

50μmol/L

among

）

each

orboth

group

with

；2

3-MA

）P=

0.001

for48

，

h

5

（

）P

n=

=

3

0.002

）.The

vs

difference

quercetin25

are

μmol

significant

/Lgroup

between

，6）P

the

<0.001

groups

vs

which

quercetin

were

50

treated

μmol/L

with

group.

differentconcentrationsofquercetin，4）F=42.24，P<

图3流式细胞仪检测各组细胞平均荧光强度

Fig.3Flowcytometry-badprofilingofautophagydetectioninHL-60ells

506

中山大学学报（医学版）第39卷

表2各组HL-60细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ水平变化

Table2TheratioofLC3Ⅱ/ⅠinHL-60cells

Control

LC3Ⅱ/Ⅰ0.92±0.173.59

25

Quercetin/(μmol/L)

±0.70

1）

5.20

50

5mmol/L3MA+Quercetin/(μmol/L)

±0.42

1）

1.20±

25

0.20

2）

2.03±

50

0.60

3）

n=3，1）F=79.79，P<0.001amongdifferentconcentrationsofquercetingroups；2）P<0.001vsthesinglequercetin（25μmol/L）group；

3）P=0.000vsthesinglequercetin（50μmol/L）group.

表3槲皮素对HL-60细胞中p-AMPK/AMPK表达的影响

Table3TheeffectofQuercetinontheratioofp-AMPK/AMPKinHL-60cells

Control

Quercetin/(μmol/L)CompoundC25μmol/L+Quercetin/(μmol/L)

p-AMPK/AMPK0.44±0.121.08

25

±0.11

1）

1.30

50

±0.02

1）

0.56±

25

0.11

2）

0.43±

50

0.14

3）

n=3，1）F=48.84，P<0.001amongdifferentconcentrationquercetingroups；2）P=0.000vsthesinglequercetin（25μmol/L）group，3）P<

0.001vsthesinglequercetin（50μmol/L）group.

1）

2）

1）

2）

6

2）

u

2）

a

1.5

/

o

i

t

u

a

r

a

/

o

K

i

t

a

4

P

1.0

r

M

A

I

/

/

I

K

I

3

C

L

2

P

M

0.5

A

-

p

LC3

0

0.0

I

p-AMPK

LC3II

AMPK

GAPDH

Quercetin

GAPDH

3-MA

-

-

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

Compound

Quercetin

C

-

-

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

groups.

1）F=79.79，P<0.001amonggroups；2）P<0.001betweenP<0.001between

图4HL-60细胞中LC3Ⅱ/Ⅰ的变化

groups.

1）F=48.84，P<0.001amonggroups；2）

图5槲皮素对HL-60细胞内p-AMPK/AMPK表达的影响

Fig.4TheratioofLC3Ⅱ/ⅠinHL-60cellsFig.5QuercetinactivatedAMPKinHL-60cells

2.3

AMPK

槲

表达的变化

皮素处理后HL-60细胞中AMPK、p-

60

检测蛋白表达。结果发现，

细胞24h，收集细胞，提取总蛋白，

槲皮素与

Western

Compound

blot

C

HL-60

不同浓度槲皮素

细胞24h后

（

，

25

Western

μmol/L

Blot

、50

检

μmol/L

测细

）

胞

孵育

联合用药组与单用槲皮素组比较，p-AMPK的表

AMPK

达

析进行统计，

、p-AMPK

结果发现槲皮素能够浓度依赖性的

蛋白的变化。采用两因素方差分

中

AMPK

降低，CompoundC能够阻断槲皮素诱导

激活AMPK活性，使得AMPK的磷酸化水平增高

2.4

磷酸化（表3，图5）。

的

对细胞凋亡及自噬的影响

CompoundC抑制AMPK磷酸化后槲皮素

（F=48.84，P=0.000）。25μmol/LCompoundC不同浓度槲皮素加或者不加CompoundC孵

与不同浓度槲皮素（25、50μmol/L）共同孵育HL-育HL-60细胞24h后，采用流式细胞仪Annex⁃

第4期

肖洁，等.槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

inV-FITC+Pl

507

皮素浓度依赖性的诱导

染色法检测凋亡细胞。结果显示：

HL-60细胞凋亡的发生

槲L

低，

）组比较，

P<0.001

LC3Ⅱ/Ⅰ

。槲皮素

比值下降，

（50μmol/L

细胞自噬程度降

）+CompoundC

（

Compound

F=316.41，P=0.000）；槲皮素（（

μmol/L

25μmol/L

）组，

）组

P<

LC3

0.001

Ⅱ/Ⅰ

。抑制

比值

AMPK

低于槲皮素（50

组比较，细

C（

胞

25

凋

μmol/L

亡率下

）组与槲皮素

降（P<0.001

（

25

）

25

μmol/L

。

μmol/L

）

槲皮素

）

+

皮素诱导细胞自噬的作用减弱（表5，

的活性后，

图7）。

槲

（50μmol/L）+CompoundC（25μmol/L）组与槲皮素

（

4

50

，图

μmol/L

6）。

）比较，细胞凋亡率下降（P<0.001；表

表5AMPK磷酸化受抑后槲皮素对HL-60细胞自噬的

影响

Table5Theautophagylevelinducedbyquercetinafter

表4AMPK磷酸化受抑后槲皮素对HL-60细胞凋亡的

AMPKphosphorylationinhibited

影响

Table4Theapoptosislevelinducedbyquercetinafter

Quercetin/（μmol/L）

Compound

AMPKphosphorylationinhibited

Quercetin/（μmol/L）

Compound

25

Quercetin/

C

（

25

μmol/L

μmol/L

）

+

Quercetin

C25μmol/L+

LC3Ⅱ/Ⅰ4.20±0.346.47

50

±0.260.36±

25

0.16

1）

0.37±

50

0.22

2）

255025

（μmol/L）

n=3,1）P<0.001vssinglequercetin(25μmol/L)groups;2）P<

Apoptosis16.65±1.8528.35±1.235.47±0.66

1）

15.68

50

±1.25

2）

0.001vssinglequercetin(50μmol/L)groups.

n=6，1）P<0.001vssinglequercetin（25μmol/L）groups；

2）P<0.001vssinglequercetin（50μmol/L）groups.

3讨论

不同浓度槲皮素加或者不加CompoundC孵

目前，联合化疗仍然是急性髓系白血病

育HL-60细胞24h后，蛋白免疫印迹法检测细胞

（acutemyelocyticleukemia，AML）治疗的主要方

中LC3Ⅱ/Ⅰ比值。结果显示：槲皮素诱导HL-60

法。传统的细胞毒性药物治疗急性白血病毒性

细胞自噬的作用与浓度相关，浓度越高，作用越

大，副反应多。槲皮素是植物来源的抗肿瘤药物，

明

L）

显

+Compound

（F=454.07

C（25

，P

μmol/L

=0.000

）组与槲皮素

）；槲皮素（

（

25

25

μmol/

μmol/

具有低毒性的特点，近年来受到广泛的关注。有

研究发现槲皮素作为一种“分子靶向药物”，可以

Quercetin25μmol/LQuercetin50μmol/L

40

1）P<0.001between2groups

1）

30

%

/

e

t

a

1）

r

s

Quercetin

i

s

o

t

20

+Compound

25

C

μmol/LQuercetin

+Compound

50

C

μmol/L

p

o

p

A

10

Quercetin

0

CompoundC

25μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

-

50μmol/L

+

图6AMPK磷酸化受抑后槲皮素对HL-60细胞凋亡的影响

Fig.6TheapoptosislevelinducedbyquercetinafterAMPKphosphorylationinhibited

508

中山大学学报（医学版）第39卷

8

1）

1）

蛋白酶Caspa被激活，导致细胞凋亡的发生。研

究证实，槲皮素可以直接诱导白血病细胞发生线

u

a

6

粒体应激产生凋亡效应实现其抗白血病作用

［11］

。

/

o

i

t

a

r

最新的研究表明：自噬作为Ⅱ型细胞程序性死亡，

I

/

4

I

I

3

C

是肿瘤细胞的死亡方式之一

［12-13］

。在真核细胞

L

2

LC3

0

中，自噬通过溶酶体途径降解损伤的细胞器及长

寿命蛋白等物质，对维持内环境稳定起到十分重

LC3

I

II

要的作用。在急性髓系白血病的研究中发现，硼

GAPDH

替佐米可以诱导急性髓细胞白血病发生自噬，通

过自噬途径加速FLT-3/ITD的降解，继而发挥其

Compound

Quercetin

C

25μmol/L

-

50μmol/L

-

25μmol/L

+

50μmol/L

+

抗白血病作用

［14］

。针对自噬途径寻找新的治疗靶

点是目前肿瘤研究的热点。有研究表明：凋亡和

图7

1）P

AMPK

<0.001

磷酸化受抑后槲皮素对

between2groups

HL-60细胞自噬的

自噬作为两种不同的细胞程序性死亡，可能存在

影响

共同的信号分子通路。

Fig.7Theautophagylevelinducedbyquercetinafter

凋亡及自噬都受细胞内能量代谢的调控，腺

AMPKphosphorylationinhibited

苷酸活化蛋白激酶

干扰肿瘤细胞中信号转导通路的关键靶点使细胞

AMPK

谢。AMPK

）是细胞的能量感受器，

（AMP-activated

由αβγ三个亚单位组成，

调节细胞能量代

proteinkina，

α-亚基N-末

死亡，对多种肿瘤细胞有生长抑制作用

［3-5］

。槲皮

端包含一个保守的

素可调节多种蛋白激酶如酪氨酸激酶、丝氨酸/苏

氨酸激酶等，从而诱导细胞凋亡

［6-7］

。在美国，其

172

缺氧的状态可能导致

）位点的磷酸化是其激酶活性所必需的。细胞

Ser/Thr激酶区，苏氨酸（Thr-

AMPK的活化

［15］

。肿瘤常伴

作为非处方药物（Difaprost

®

）用于前列腺癌的治

随能量代谢紊乱和AMPK激活抑制。因此，AMPK

疗；含有槲皮素的圆叶葡萄皮提取物治疗生化复

被视为治疗肿瘤的潜在作用靶点

［16］

。体内外研究

发前列腺癌的药物临床试验正在进行中

［8］

。槲

发

皮素是一种有应用前景的抗肿瘤药物。然而其

在急性髓系白血病中的研究非常有限，有文献报

mTOR

现，激活急性髓细胞白血病AMPK并抑制

去磷酸从而产生抑制肿瘤的作用，

的活性，可使得翻译起始因子

但对正常的髓

4E-BP1发生

道槲皮素能够阻滞急性髓系白血病细胞于G0/G1

系造血干细胞功能无影响

［17］

。研究发现白藜芦醇

期，诱导凋亡及保护性自噬的发生

［9］

，我们前期

能够通过AMPK信号通路调节细胞内能量代谢，

研究发现槲皮素对急性髓系白血病HL-60细胞

抑制糖酵解，增加葡萄糖有氧氧化，增强肿瘤细胞

株有抑制增殖的活性

［3］

，但其具体的机制有待进

的氧化能力发挥抗肿瘤的作用

［18］

。本研究发现，

一步阐明。

槲皮素能够活化HL-60细胞中AMPK，导致细胞

本研究发现，槲皮素能够诱导白血病HL-60

内p-AMPK的表达增加。这一过程能够被AMPK

细胞株发生凋亡，其对凋亡的影响呈时间及浓度

特异性的小分子抑制剂CompoundC所阻断。但

依赖性。同时，通过电镜、WesternBlot等检测方

采用CompoundC阻断AMPK的活化后，槲皮素对

法我们还发现，槲皮素能诱导HL-60细胞株发生

自噬。我们认为，槲皮素通过诱导HL-60细胞同

HL-60

素可能通过激活

细胞凋亡及自噬的诱导作用均减弱。槲皮

AMPK实现对HL-60细胞凋亡及

时发生凋亡和自噬，从而发挥其抗白血病作用。

自噬的调控。

但是其诱导凋亡及自噬的具体信号通路及信号分

综上所述：槲皮素作为一种植物来源的低

子有待进一步明确。

毒性药物，具有抗肿瘤的作用。槲皮素可能通

自噬与凋亡属于两种不同的细胞程序性死

过激活细胞内AMPK，影响细胞内能量代谢的变

亡。自噬、凋亡与肿瘤的发生、发展以及治疗有着

化，导致细胞凋亡和自噬的发生从而发挥抗白

非常密切的关系

［10］

。细胞凋亡是受基因调控的精

血病作用。但其具体的分子通路还有待进一步

确过程，当细胞接受体内外信号刺激后，半胱氨酸

的阐明。

第4期

肖洁，等.槲皮素调控AMPK活性诱导HL-60细胞自噬与凋亡

509

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lective

and

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Quercetin

AKT/mTOR

effusion

induces

and

lymphoma

apoptosis

STAT3signaling

cellsby

and

inhibiting

autophagy

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HL-

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Yin

，Niaz

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60

，

21

Maqbool

）

cells

apoptosis

SM，et

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and

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Chin

inhibiting

Mechanismof

JCancer

prolif⁃

Prev

F，lartar⁃

inhibitorsinduce

gets

cells

FLT3-ITD

［J］.Blood

degradation

，2016，

through

127（7

au⁃

Anupdate

underlying

［J］.Nutrients

theanticancer

，2016

effects

，8（9）

of

：529-545.

quercetin：

882-892.

tophagyinAML）：

［15］李娜，贺涓涓，汪倩，等.CompoundC抑制腺苷

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combined

andinvivo

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，

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phosphorylated

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withitsspecial

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tion-

Univ（

inhibitor-

onhypoxia

MedSci），

compound

precondition⁃

2016，

C

37

［

（

J］

2）：

.J

cercells

induced

potently

toapoptosis

autophagy

counteractsquercetinstarva⁃

［

and

J］.

nsitizes

MolNutr

hepG2

FoodRes

can⁃

［16］

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SUNYat-n

BungardD，FuerchBJ，ingkina

］

2018

Kim

，

JH

62

，

（

Kim

5）：1700610.

，

［tinnsitizespancreatic

AMPK

cancer

histone

activates

H2B

stress-promotedtranscriptionvia

JNK-mediated

cellsto

cFLIP

TRAIL-

turnover

induced

［J

apoptosis

］.IntJBiochem

through

［17］

329

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（5996

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recurrent

grape

prostate

skinextract

cancer：

in

Safety

men

，

with

tol⁃

repression

activity

of

in

signaling

mTOR-

acutemyeloid

pathway

dependent

leukemia

hastumorsuppres⁃

oncogenic

through

mRNA

the

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（编辑孙慧兰）