氮唑类抗真菌药物靶酶CYP51的研究进展

2024年4月1日发(作者：橙)

氮唑类抗真菌药物靶酶CYP51的研究进展

李冉;张大志

【摘 要】氮唑类药物是临床上应用最广、种类最多的广谱高效抗真菌药物,其作用

靶点为真菌甾醇合成过程中的一个关键酶——羊毛甾醇14α-去甲基化酶

(CYP51).CYP51由CYP51基因(同名ERG11)表达.一方面,真菌CYP51是跨膜蛋白,

难以纯化获得其准确的结构信息,成为药物研发的瓶颈之一;另一方面,CYP51变异

是公认的真菌耐药的主要原因之一,研究其结构变化对于抗真菌耐药具有重要意义.

因此,笔者对近年来CYP51的研究进展进行综述.%Triazoles are the most widely

ud antifungal drugs in clinic with broad spectrum and high

efficacy,which targets sterol 14α-demethyla (CYP51),an enzyme

expresd by the gene EGR11,which is a key enzyme in the fungi ergos-

terol the one hand,the CYP51 belongs to a

transmembrane is difficult to get the exact functional structure

conformation which becomes a big challenge for the development of new

the other hand,it becomes con-nsus that EGR11 exon mutation

cau CYP51 structural change is one of the major reasons for antifungal

drugs resistance. Therefore,study of the structural changes toward the

antifungal drug resistance is quite review authors have

summarized the rearch progress on CYP51 over the recent years.

【期刊名称】《药学实践杂志》

【年(卷),期】2016(034)002

【总页数】4页(P106-109)

【关键词】CYP51靶酶;三维结构;动力学;突变;耐药

【作 者】李冉;张大志

【作者单位】第二军医大学药学院有机化学教研室,上海200433;第二军医大学药

学院有机化学教研室,上海200433

【正文语种】中 文

【中图分类】R978.5

羊毛甾醇14-α去甲基酶（sterol 14α-demethyla，P45014DM，CYP51）是

麦角甾醇生物合成路径中必不可少的酶［1］，其主要功能是催化羊毛甾醇14-α

位的甲基离去。唑类化合物能选择性地抑制真菌的CPY51，为常用的抗真菌药物

［2］。但由于CYP51是疏水性很强的膜蛋白，药物与靶酶的构效关系研究难以

形成清晰明确的结论［3］，阻碍了新型抗真菌化合物的设计和发展。另外，

CYP51也参与了部分耐药机制，它的变异是真菌耐药问题的主要原因之一。近些

年来已有研究者对致病性真菌不同种属类的CYP51的三维结构、活性位点以及与

唑类的结合进行了较为深入的研究，分析了靶酶的相关动力学性质，与耐药有关的

基因突变的报道也在不断增加。

目前，不同相关菌属的CY P51基因已经得到克隆和鉴定。对基因序列的识别和对

比有利于了解不同种类的CY P51在基因水平的联系。一般而言，序列一致性低于

40%的基因视为不同的家族，一致性高于55%的基因归为一个亚家族，因此，不

同的亚家族基因的一致性应在40%～55%之间。整个生物界CY P51的序列相似

性降低至23%～34%，同一物种CY P51多个拷贝间的序列相似性程度为中等，

真菌间的相似性相对低很多，一般把一致性在30%左右的就可以归为同一家族，

可见真菌的CYP51酶的基因序列差异较大［4］。这种基因序列的低一致性与生

物功能的高度单一性反差较大，使得对CY P51催化反应的单一性和反应机制的研

究愈加困难，颇具挑战性。

不同CYP51氨基酸序列的一致性是同源模建的基础。虽然真菌中围绕卟啉-Fe的

氨基酸序列的一致性相对较高，但总体而言，种间的一致性、相似性不高［5］。

新近报道的首个真菌类CYP51晶体（酿酒酵母的RsCYP51）结构中［6］，其氨

基酸序列与白念珠菌、新生隐球菌、烟曲霉等致病真菌的CYP51相比较，绝对保

守的为24%，相近的仅为25%。

2.1 三维模型的构建与分子对接 早期张万年等［7］首次根据原核生物 P450s

（P450BM3、P450cam、P450terp和P450eryF）已知的共晶结构来构建白念

珠菌的CYP51与底物24（28）-亚甲基-24，25-二氢羊毛甾醇复合物三维结构，

同时鉴定了与底物任意一原子相距0.8 nm以内的活性位点氨基酸残基，这些氨基

酸残基有助于更好地理解酶的结构与功能关系。底物与CYP51的分子对接研究

［8］表明，底物固定在活性位点主要是通过疏水作用力和氢键相互作用。另外

14个唑类化合物的活性构象也分别对接到白念珠菌CYP51的唑类结合位点，研究

发现这14个唑类化合物在结合位点都有相似的对接模式。抑制剂的卤代苯环和氨

基酸残基Y132之间可能有π-π叠加相互作用。伊曲康唑和酮康唑较长侧链会穿

过结合位点和底物入口通道的残基相互作用。

随着同源建模技术的发展，白念珠菌、烟曲霉菌和新生隐球菌CYP51酶的三维模

型依次被构建出来［5，8］，用于研究与底物的结合模式和与唑类抑制剂的相互

作用，以及邻近突变对酶与抑制剂结合的影响。研究发现，疏水作用和氢键在底物

识别和定向方面起重要作用。白念珠菌和烟曲霉菌的CYP51酶的模型虽然有相似

的核心结构，但它们的活性位点明显不同。对白念珠菌和烟曲霉菌CYP51的结合

位点与唑类化合物分子对接研究表明［8］，泊沙康唑较长的侧链能占据CYP51

的一个特定通道。通道内相应的氨基酸残基能为唑类化合物对特定点突变耐药菌株

的活性数据［8］提供解释和支持。结果表明，这种额外的相互作用有利于稳定其

与CYP51突变体的结合，而氟康唑（FCZ）和伏立康唑并没有这种性质。同时表

明，这些能特异影响泊沙康唑活性点的突变，是通过干预泊沙康唑侧链与受体的结

合而起作用的。

2.2 重组体的表达及动力学研究

2.2.1 白念珠菌属羊毛甾醇14-α去甲基酶（CaCYP51）与唑类结合的性质 2010

年，Warrilow等［9］首次在大肠杆菌中表达出了野生型的CaCYP51，并初步阐

述了突变体I 471T CaCYP51的性质。研究发现，在氧化条件下，纯化的

CaCYP51与唑类的亲和力是相似的，解离常数Kd值在10～26 nM（除了FCZ

的Kd值为47 nM）。伏立康唑与CaCYP51的亲和力高于FCZ，归因于伏立康唑

脂肪碳上多出来的甲基增强了与芳香氨基酸的疏水相互作用，但是，克霉唑和伊曲

康唑与CaCYP51相似的亲和力表明化合物侧链并不是决定与靶酶亲和力的决定性

因素。在CO置换实验中，CaCYP51与伊曲康唑的亲和力是FCZ的7倍，与在氧

化条件的2倍相比，这一差距表明唑类的侧链对结合力有着决定性作用。突变体

I471T CaCYP51也在该实验中得到了初步的表征，并表明FCZ的耐药是源自对底

物亲和力的增强和对唑类化合物结合力减弱的双重影响。其后，人类同源的 14-α

去甲基酶 HsCYP51和Δ60HsCYP51得到表达和纯化［10］，以探索唑类药物和

农业中的抗真菌药对它们的选择性。

2.2.2 烟曲霉菌羊毛甾醇 14-α去甲基酶（CYP51B）的结构与功能研究 不同于人

类和其他脊椎动物，烟曲霉菌有2个CY P51基因［11，12］，所表达的酶分别

是CYP51A和CYP51B，两者氨基酸序列的相似度为59%。尽管2个基因在烟曲

霉菌中都有活性，但是研究指出CY P51B基因编码的酶主要负责羊毛甾醇的去甲

基化。2个基因的出现或许成为解释烟曲霉菌高度耐药的原因。2015年，

Hargrove等［13］首次表达纯化并鉴定了烟曲霉菌的CYP51B，研究发现它催化

天然底物齿孔醇和植物的CYP51底物钝叶醇去甲基化的催化常数Kcat值分别为

（45±3）和（52±3）／min，对羊毛甾醇并没有活性。咪康唑在测定过程中对酶

的抑制活性最强。与伏立康唑复合物的X-射线结构表明，烟曲霉菌的CYP51B与

其他同源的CYP51有较高的整体相似性，但具有在其他门系所没有的特点，进而

为小分子伏立康唑对曲霉菌有效提供了解释。

随着唑类药物的长期大量使用，真菌的耐药情况日益严重。已知的临床致病真菌对

唑类化合物耐药的机制主要分为4类：①CYP51的点突变致使其与唑类药物的亲

和力降低；②靶酶基因的上调导致CYP51的过度表达；③转运蛋白的过度表达致

使唑类药物的流出增加；④在耐药的白念珠菌属中发现的ERG3的突变。其中，

影响唑类结合的CYP51的突变体通常在耐药菌株中发现［14，15］，并得到了广

泛的研究。研究CYP51的突变及对唑类结合的影响，有利于设计抗耐药真菌的药

物。

3.1 白念珠菌 目前，已有140多种不同的CYP51氨基酸替换见诸文献报道，但是

大约只有一半仅存在于对唑类药物敏感力弱的菌株中（表1）［16］。虽然临床

上菌株含有的氨基酸替换通常不止一个，但替换的位点大部分都位于3个区域

［17］：氨基酸残基105-165、266-287和405-488。一些点突变体已在大肠杆

菌中被表达出来，用于研究氨基酸替换对CYP51的活性和对药物敏感性的影响、

突变体与唑类的结合位点及动力学性质。其中包括Y132H［18］、F145L［19］、

I471T［20］和S279F［21］。另外，一些突变体如G464S［22］、R467K［23］

和T315A在啤酒酵母菌中被表达，可用于对唑类耐药的研究［24］。

3.2 烟曲霉菌 与白念珠菌不同，烟曲霉的耐药机制仅与CYP51变异有关［25］，

其CYP51酶有2种同源蛋白CYP51A和CYP51B。但研究表明，大部分耐药的烟

曲霉菌株通常只含有CYP51A的单个突变体［26］。烟曲霉菌在临床上与耐药有

关的CYP51的氨基酸取代（表1）虽然少于白念珠菌属，但也有30多种［27，

28］，其中最常见的氨基酸替换有 G54、L98、G138和M220［27］。从临床上

耐药的菌株中发现，氨基酸G54和M220有不同的取代。部分烟曲霉菌CYP51

的突变体也在啤酒酵母菌中表达。通过活性研究发现，G54的突变能严重影响菌

株对伊曲康唑和泊沙康唑的敏感性，但对伏立康唑的活性影响不大［28］。对于

M220的突变，M220K 和M220T能降低菌株对所有药物的敏感性，M220I能特

异地影响伊曲康唑，M220V能影响伊曲康唑和泊沙康唑。有分析表明，在同一位

置的不同取代能特异地影响药物与靶标的相互作用。

3.3 新生隐球菌 目前只在临床菌株中发现了2个介导耐药的新生隐球菌CYP51的

氨基酸取代，G484S［29］和Y145F［30］（表1）。G484S能引起新生隐球菌

对FCZ的耐药［29］，Y145F能使真菌对FCZ和伏立康唑耐药，但能增强真菌对

伊曲康唑和泊沙康唑的敏感性［30］。

利用同源模建构建致病性真菌CYP51酶的三维结构，并通过分子对接研究有利于

更好地了解靶酶的结构与功能关系，同时也有利于为新型抗真菌药物的研发建立高

通量的筛选体系。但不同种的CY P51基因序列的一致性普遍较低，表明同源模建

的CYP51用于药物设计的准确度并不高。利用基因克隆与表达技术，纯化得到相

应的靶酶重组体，为酶的动力学性质提供了更准确和更可靠的信息。另外，

CYP51突变与耐药的关系能为设计抗真菌耐药的药物提供基础。目前还需要利用

现有的先进技术对靶酶的性质做进一步阐述，为设计研发新型的具有高度特异性的

抗真菌药物提供平台。

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