植物甾醇的分析方法研究进展

2024年4月1日发(作者：大学新生寄语)

植物甾醇的分析方法研究进展

赵伟;韩敬美;刘春波;钟仙芳;刘志华

【摘 要】植物甾醇因其具有降低胆固醇、抗炎等多种生物活性功能越来越受到人

们的重视,并随着在医药等工业上进一步应用,对其纯度也提出更高要求.因此如何对

植物中甾醇类物质进行分析检测就成为当前研究的重点和热点.本文对传统和现代

的植物甾醇的分析检测方法进行了综述,并对烟草中甾醇分析检测方法做了概括和

介绍,希望对今后的甾醇分析研究工作有一定的帮助.%Becau of its lower

cholesterol, anti-inflammatory and so on many kinds of bioactive functions,

people attached importance to phytosterol increasingly, and with further

applying in medicine industry, and maked higher demand of its purity. So

it was a hot spot and focus on how to analyze and detect phytosterol. The

principal themes of the review highlighted the analysis and detection

methods of the traditional and modern for phytosterol comprehensively,

and briefly summarized the analysis of phytosterol in the tobacco, aiding

its analysis and detection for future rearch.

【期刊名称】《分析仪器》

【年(卷),期】2012(000)004

【总页数】6页(P6-11)

【关键词】植物甾醇;分析检测;烟草

【作 者】赵伟;韩敬美;刘春波;钟仙芳;刘志华

【作者单位】云南烟草科学研究院,省烟草化学重点实验室,昆明650106;云南烟草

科学研究院,省烟草化学重点实验室,昆明650106;云南烟草科学研究院,省烟草化学

重点实验室,昆明650106;云南烟草科学研究院,省烟草化学重点实验室,昆明

650106;昆明理工大学化学工程学院,昆明650224;云南烟草科学研究院,省烟草化

学重点实验室,昆明650106;昆明理工大学化学工程学院,昆明650224

【正文语种】中 文

引言

植物甾醇，又称植物固醇，一般为白色粉末，结构以环戊烃全氢菲(甾核)为骨架的

三萜类化合物，多数甾醇双键在C-5位上，而在C-3位存在羟基，且羟基是其主

要的活性基团[1]，其基本骨架见图1。植物甾醇中最常见的是谷甾醇(sitosterol)、

豆甾醇(stigmasterol)、菜油甾醇(campesterol)，它是植物细胞膜的重要组成成

分。植物甾醇具有防止冠心动脉粥样硬化、促进胆固醇的降解代谢等药用和保健价

值，并且是合成维生素D3等甾类药物重要中间体，同时也是生发、养发和皮肤营

养剂以及化纺工业中的分散剂、柔软剂、抗氧化剂等，被广泛地运用于医药[2-4，

7]、食品[5]、化妆品[6]等领域。

图 1 甾醇的基本骨架

甾醇的结构极其相似，采用一般的化学方法很难对多组分的含量进行分析测定。从

发现植物甾醇至今，它的分析技术就一直处于改进和完善之中。

1 重量法(Potentiometry)

毛地黄皂苷法，又称重量法，在早期的资料中比较常见。3β-OH甾醇对毛地黄皂

苷的反应很灵敏，一分子甾醇和一分子毛地黄皂苷形成分子络合物，产生甾醇毛地

黄皂苷络合物的白色沉淀，此法适用于测定3β-OH甾醇。由于α-甾醇无此性质，

利用这一差异可以分离3α和3β-OH甾醇。另外，250℃以上时，样品中的甾醇

则不能被毛地黄皂苷所沉淀。利用上述两个性质可以对甾醇进行定性鉴定和较为粗

略的定量测定。窦巍巍等人[8]采用国标铁矾显色法(GB/T 5009. 128-2003)测定

酯交换植物油中甾醇的含量，通过与改进的Lieberman-Burchard比色法和毛地

黄皂苷测定结果进行对比分析。研究结果表明国标铁矾显色法最佳显色条件为：显

色剂用量2mL，显色剂组成比例1 ︰9，显色时间15min。采用国标铁矾显色法

测定酯交换植物油中高含量甾醇的平均误差为4.54%，平均回收率为98.6%。

2 薄层色谱法(TLC, thin-layer chromatography)

薄层色谱可用于甾醇的分离、纯化、检测。国内有些学者将非皂化物从馏出物中萃

取出来，然后再进行衍生化，点样分析，其处理方法比较繁杂。考虑到工厂分析的

实际需要，我们只取其两个目的：其一为直观评定。无论是甾醇产品还是脱臭馏出

物原料，其中的游离甾醇和甾醇酯等均可通过TLC达到良好分离，根据斑点的大

小、颜色的深浅可以直接判断它们的大致比例关系。其二为准确测定。将上述薄板

进行扫描，利用标准曲线，可以确定产品中甾醇与甾醇酯的含量。具体做法是用标

准溶液点样显色后，在CS ︰910薄板扫描仪上，在参比波长700nm，样品波长

550nm的条件下进行双波长扫描，即可得到标准扫描图[9]。薄层层析法主要用于

甾醇的定性分析，结合光密度计也可以进行初步定量工作。但此方法操作繁琐、费

时，并且显色后不稳定。

3 分光光度法(Spectrophotometry)

此方法是基于Liebermann-Burchard比色法改进的，甾醇与硫酸或其它强酸能发

生颜色反应，其原因可能是脱水后碳正离子上成盐(不过仅限于碳环上有双键的)。

步骤是以乙酸酐为溶剂，制备一系列甾醇的标准溶液，向溶液中加一滴浓硫酸，溶

液颜色由无色经红色，变为暗绿色，稳定10 min后进行可见光扫描，测得最大吸

收波长。在此波长下用不同浓度的标准溶液的吸光度绘制标准曲线，然后根据该标

准曲线测定未知样品中的吸光度以确定其浓度，从而得到样品中总甾醇的含量。这

种方法简单快速，整个操作仅需要0.5h，适用于工厂快速鉴定[10]，但该法对显

色温度、时间要求严格，形成的有色化合物颜色不太稳定，重现性差，且仅适合总

甾醇含量的测定[11]。叶爱英等人[12]采用改进的Liebennan-Burchard比色法，

建立了植物油沥青中总甾醇含量的测定方法，以不加显色剂的样品溶液作空白，甾

醇含量在0.034～0.344 mg/mL范围内服从比耳定律，测得植物油沥青中总甾醇

含量在12.1%左右，提取物中总甾醇含量为74.5%左右。

4 气相色谱法(GC, gas chromatography)

20世纪60年代以来，由于气相色谱的应用，气相色谱法很好地解决了植物甾醇

含量分析与组成的问题。气相色谱具有分析时间短，干扰峰少，分辨率高以及热稳

定性好的优点[13，14]。植物甾醇的GC分析大都采用的是非极性固定相(100%聚

硅氧烷)的毛细管色谱柱。但是研究发现弱极性的固定相(如5%联苯-95%二甲基聚

硅氧烷)可以使柱子的热稳定性和分辨率大大提高。气相色谱适合于分析挥发性强

的物质，而对于极性强、挥发性弱、热稳定性差的物质往往不能直接进样分析，如

果将这类物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物，这类物质就能够得

到很好的分离。植物甾醇分子中含有极性羟基，挥发性差，在高温下容易失水或分

解，所以需要对样品进行衍生处理，才能得到很好的分离。目前一般的衍生化的方

法有硅烷化衍生化，酯化衍生化以及酰化衍生化。在检测器的选择上一般都是利用

破坏性的氢火焰离子化检测器(FID, name ionization detection)对植物甾醇进行

定量，一般都是利用质谱的单离子扫描(SIM, sing1e-ion monitoring)或多离子扫

描(MIM, multiple, ion monitoring)。Dutta等人[13]利用近中等极性的色谱柱

(14% cyanopropyl-phenyl-methylpolysiloxane)使菜油甾醇和菜油甾烷醇的三

甲基硅(TMS)酯衍生物达到基线分离。黎文生等人[15]采用薄板层析、气相色谱对

大麻籽油中甾醇、4H ︰甲基甾醇及三萜醇等不皂化物的成分进行了分离和分析，

并用气相色谱 ︰质谱联用确定了甾醇中的6种化合物。姜媛媛等人[16]建立了植

物甾醇酯的高温气相色谱分析方法：样品经水洗、正己烷提取并结晶等方法处理后，

采用高温气相色谱法，使用Agilent 6820气相色谱仪、氢火焰离子化检测器、

DB5高温色谱柱直接进行定量分析。

5 气相色谱 -质谱联用(Gas Chromatography-Mass Spectroscopy, GC-MS)

气质联用已经成为一种发展相对比较成熟的检测手段，在进行多种组分分析时，用

气相色谱法检测需要多个检测器，而气质联用一般只需一次GC ︰MS检测即可。

Cai等人[17]用气 ︰质联用测定了混合肥料中30种半挥发性有机污染物，利用索

氏提取法提取待测组分后，再用GC ︰MS法进行分离检测。李凌[18]选取西双版

纳的成年绿玉树和重庆引种的2年生海南绿玉树乳汁，自然干燥后用CS2溶解，

气相色谱 ︰质谱联用测定了西双版纳绿玉树和海南幼年绿玉树中的绿玉树甾醇，

其中绿玉树的“指纹”成分绿玉树甾醇的含量(17.40%)要稍高于西双版纳成年绿

玉树(10.91%)。徐继林等人[19]对一种重要的未知生物饵料微藻在充气和瓶中静态

两种生态条件下进行培养，设计了一种分步衍生化脂肪酸与甾醇的GC/MS连续分

析法，对微藻脂肪酸甾醇进行了定性和定量分析，共鉴定出11种甾醇组分，主要

是24 ︰甲基(乙基)胆甾醇，碳数分布从27到30，特别含有甲基巴夫甾醇和乙基

巴夫甾醇。张志杰等人[20]对银杏叶中的甾醇进行分离，重结晶纯化，得到了高纯

度的植物甾醇，采用GC ︰MS联用技术对甾醇进行了分析，经GC ︰MS确定了

其中丰度较大的5种组分及其结构，分别为菜油甾醇、豆甾-4,22-双烯-3β-醇、

β-谷甾醇、豆甾-3β-醇和岩藻甾醇。杨晓静等人[21]采用快速硅胶柱层析和气相色

谱对紫苏子油中甾醇、4-甲基甾醇及三萜醇等不皂化物的成分进行了分离和分析，

用气相色谱 ︰质谱联用技术确定了甾醇中的7种化合物，分别为胆甾醇、菜油甾

醇、豆甾醇、β-谷甾醇、α-菠菜甾醇、燕麦甾醇和豆甾烯。肖寄平等人[22]利用

GC ︰MS测定哈蟆油中甾体类化合物的成分及含量，共鉴定出8个化合物：胆固

醇、胆甾-3-酮、胆甾-3，5-二烯-7-酮、菜油甾醇、胆甾-4-烯-3-酮、胆甾-4，6-

二烯-3-酮、豆甾醇-22，23-二氢、胆甾-8-烯-7-酮。李海英等人[23]比较分析了

16种东海沿海贝类的脂肪酸和甾醇组成，通过气相色谱 ︰质谱联用法共检测出了

14种甾醇。

6 液相色谱法(High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)

HPLC具有柱温温和，无需破坏性等特点，故而适合于测定热不稳定的甾醇。自

1976年有人首次用高效液相色谱法分离了甾醇后，正相和反相HPLC技术已被广

泛用于甾醇分析[24]。在检测器的选择上，一般有紫外检测器(UV)，光电二极管阵

列检测器(DAD)，折射率检测器，蒸发光散射检测器(ELSD)。HPLC可以直接分析

简单均一的脂类萃取物的甾醇，并且无须进行大量的样品纯化，从而避免了前处理

中目标样品的损失，但是对于复杂样品则需要经过纯化的前处理，以消除干扰组分

对测定的影响[1]。通过HPLC还可以研究其他复杂体系中的甾醇[25-27]。夏晓明

等人[28]采用反相高效液相色谱法，建立了检测禾谷丝核菌中麦角甾醇和羊毛甾醇

含量的方法，采用DiamonsiITMC18色谱柱 (250mm × 4.6mm ，i.d, 5 μm

i.d.)，流动相为100%甲醇，流速为1mL/min，紫外检测波长为210nm。麦角甾

醇和羊毛甾醇的保留时间分别为21min 和27min，麦角甾醇在0.125～

12.5mg/L浓度范围内，羊毛甾醇在0.1～10.0 mg/L浓度范围内，两者峰面积与

浓度均呈线性关系，相关系数分别为0.9993 和0.9983。加标回收率实验表明：2

种甾醇的平均回收率为91.8%～99.7%，相对标准偏差为2.8% ～7.8%，麦角甾

醇和羊毛甾醇的最小检出量分别为1.0 和0.8 ng，最低检出浓度分别为0.05 和

0.04 mg/L。李治建等人[29]采用反相高效液相色谱法，建立了测定红色毛癣菌中

麦角甾醇含量的方法，色谱柱为Waters symmetry shieldlmTM

C18(4.6mm×150mm，5 μm)，流动相为100%甲醇，流速为1．0 mL/min，检

测波长为282nm，麦角甾醇的保留时间为8.9min。麦角甾醇在0.93～

29.75mg/L浓度范围内，峰面积与浓度呈线性关系，相关系数分别为0.9998。回

收率实验表明，麦角甾醇的平均回收率为94.8%～96.3%，相对标准偏差为

1.8%～3.3%，麦角甾醇的最低检出浓度为0.008 mg/L。杨虹等人[30]研究了食

用油中植物甾醇的检测方法，并将液相色谱法与薄层色谱法、气相色谱法进行了比

较，结果表明：气相色谱法具有分析速度快、准确性高和精密度好的优点，利用该

方法，对油脂加工过程中植物甾醇的含量进行了追踪分析，考察了油脂在精炼过程

中的甾醇损失情况。另外，还对不同种类植物油的毛油和脱臭馏出物中植物甾醇的

组成及含量进行了分析。潘加亮等人[31]综述了油菜素甾醇样品前处理方法，及

HPLC等分析检测技术的研究进展。甘辉等人[32]对栀子的植物甾醇成分进行分离

分析，对所得甾醇样品的组分采用HPLC-MS分析的结果表明：栀子果油中可能

含有β-谷甾醇和甘氨胆酸等甾醇成分。吕喆等人[33]用微波辅助萃取法首次从野

生菱角皮和菱角仁中提取到甾醇类化合物，并用紫外-可见分光光度法和高效液相

色谱法对提取液中总甾醇含量和其中β-谷甾醇的含量进行了分析测定，菱角皮及

菱角仁中总甾醇含量分别为0.624和0.813 mg/g，其β-谷甾醇的含量分别为

0.508和0.716 mg/g。

7 超临界流体色谱(Supercritical Fluid Chromatography, SFC)

超临界流体色谱因为分析速度快，无需对样品进行衍生化等优点在脂类物质的分析

中具有重要的地位[34，35]。有文献报道通过超临界萃取-超临界色谱(SFE-SFC)分

析了脂类富集的复杂体系中的植物甾醇[36]，与固相萃取(SPE)或有机溶剂处理得

到的数据进行比较后，得出SFE-SFC能够更准确地定量微量或痕量的甾醇的结论，

并且样品前处理简单，节省溶剂，分析时间短。该文作者首先用SFE萃取富集了

植物油中的甾醇，然后在Dionex SB-Octyl-50毛细管柱(10m×100μm×0.5μm)

进行分离，以FID为检测器，在350℃温度下，4种植物甾醇、甘油二酯和甘油三

酸酯达到完全基线分离。

对于以上各种色谱方法，从分析的精密度和灵敏度来看，一般是GC>HPLC>SFC，

但是具体的哪种技术更适合，依赖于实际分析的样品、甾醇的结构和检测器的选择。

一般GC-FID (MS)是最实用的，是分析食品和植物油中植物甾醇的首选分析技术

[1，37]。

8 烟草中甾醇分析检测技术

烟草中的植物甾醇主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇、胆固醇和麦角甾醇等

[38]。这些甾醇是构成烟叶油分的主要成分之一，与烟草品质正相关[39]，但也是

卷烟烟气中气态烷烃和稠环芳烃的来源之一，如豆甾醇[40]。麦角甾醇也可以作为

监控烟草早期霉变的主要化学指标[41]。植物甾醇的定量分析从20世纪50年代

末最初的沉淀法发展到目前的气相色谱、气相色谱/质谱、液相色谱和薄层色谱等

方法。

Stedman和Rusaniwskyi[42]利用重量法测定了烟草中的游离和结合的甾醇。具

体的过程如下：用己烷萃取游离的植物甾醇，蒸干后将残余物用乙醇溶解，煮沸时

加入含2%毛地黄皂苷的80%的乙醇溶液，并继续煮沸此溶液1min，过夜沉淀，

用布氏漏斗过滤后，分别用80%的乙醇和二乙酯洗涤干净后在100℃下干燥1h。

新采摘和调制陈化后的6种不同类型的烟叶，甾醇的总含量在0.01%～0.45%之

间不等。从方法的原理和过程来看，这种方法简单，对仪器设备的要求低。但该项

技术对操作安全性要求较高、分析时间长、干扰因素较多，并且只能测定总甾醇含

量，不能给出样品中各种甾醇的含量信息。由于大部分烟草甾醇报告是20世纪

70年代发表的，大都使用填充柱。1978年Severson[46]利用碱皂化-己烷萃取-

CC纯化-硅烷衍生化-GC-FID分析测定了烤烟中“总甾醇”和游离的甾醇。但是

应该指出的是文献里测定的“总甾醇”并不是烟草中含有的甾醇总量。1997年

Jiu Ai[47]使用一根10m×0.25mm的DB-5弱极性色谱柱，利用GC/MS/MS法

快速分析了烟草中3种主要的植物甾醇，这篇文献的重点就是利短柱解决了由于

长时间的保留时间和高温造成的植物甾醇在毛细管柱上的分辨率降低和甾醇的损失

的问题。由于实验使用的短柱使得GC的分辨率降低，所以采用质谱联用(MS/MS)

的高选择性的扫描模式，选择反应检测(SRM，lected reactionitoring)很好地

消除了高化学背景干扰，从而弥补了短色谱柱低分辨率的不足。

近几年我国的烟草研究者利用毛细管柱分析了烟草中游离植物甾醇。考虑到甾醇在

三氯甲烷中的溶解性很好，许燕娟等人[48]采用三氯甲烷直接萃取烟样中的甾醇，

萃取液经过滤后进行气相色谱/质谱分析，结果表明所建立的方法前处理十分简单，

回收率高，适合大批量样品的定量分析。黄龙等人[49]建立了一种采用二氯甲烷提

取、微孔滤膜过滤、气相色谱/质谱/选择离子监测(GC/MS/SIM)定量测定烟草中

游离植物甾醇的方法，并采用该法测定了部分烟叶样品、霉变烟叶和部分卷烟样品

中的游离植物甾醇含量。结果表明：①该法的检测限为5.12～8.43 ng/g，回收率

在93%～103%之间，RSD<6%；②香料烟的麦角甾醇含量最高，其次是烤烟，

白肋烟最低；③卷烟烟丝中的游离植物甾醇含量与其烟气中苯并[a]芘的释放量呈

显著正相关。尹键等人[39]采用石油醚作为提取液，并进一步进行萃取、分离烟草

中的植物甾醇，在此基础上发展了对烟草中植物甾醇的气相色谱分析的方法，并对

β-谷甾醇进行了定量分析。虽然烟叶中的甾醇对烟叶品质有着重要的影响，但是

关于各种烟叶中游离和结合态的甾醇含量研究报道较少。刘绍民等人[50]采用GC-

MS，利用TMS衍生物方法对代表烤烟烟叶中的甾醇含量进行了研究。测定结果

表明：干烟叶中甾醇含量在1.0～2.5 mg/g，75%～85%的甾醇是以糖苷和酯的

形式存在，15%～25%的甾醇是以游离态的形式存在。不同烟叶中甾醇含量从大

到小顺序：东方烟，白肋烟，雪茄，马里兰烟。

9 展望

以上介绍的植物甾醇的分析检测方法是近年应用的主要方法，尽管其中一些方法还

处于发展初期，但它们独特的优越性己被广大分析工作者所认识，必将得到更快的

发展。

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