土壤可溶性有机氮,硝态氮,铵态氮和微生物量氮测定

2024年4月1日发(作者：离开家乡不舍心情说说)

土壤可溶性有机氮、硝态氮、铵态氮、微生物量氮最方便最简单的测定方法

1.母液制样：称取新鲜土壤（30.0g）于放置烧杯中，加约等于田间持水量60%水在

25℃下培养7~15d。取15.0g土于烧杯，置于真空干燥器中，同时内放一装有用100ml

精制氯仿的小烧杯，密封真空干燥器，密封好的真空干燥器连到真空泵上，抽真空至氯仿

沸腾5分钟，静置5分钟，再抽滤5分钟，同样操作三次。干燥器放入25℃培养箱中24

小时后，抽真空15-30分钟以除尽土壤吸附的氯仿。按照土：0.5M K2SO4=1:4(烘干土算，

一般就是湿土：0.5M K2SO4=1：2)，加入0.5M K2SO4溶液（未熏蒸为空白直接称取

15.0g土，加同样比例0.5M K2SO4溶液）震荡30分钟，过滤。其中熏蒸后的土壤过滤

液为A母液，未熏蒸的土壤过滤液为B母液。母液要是不及时测定，需立即在-15℃以下

保存

2.测定

可溶性有机氮=可溶性全氮-（铵态氮+硝态氮）

要是有流动分析仪器还有TOC的话可以利用A母液测得碳氮减去B母液的碳氮含量

根据公式计算得出微生物碳氮，可以用B母液测的铵态氮、硝态氮和可溶性全氮，是很方

便的。

以下的是用传统的方法测定以上指标，经过852个土壤样品试验结果还是很好的。

土壤可溶性全氮测定

氧化剂:将6g NaOH 和30g K

2

S

2

O

8

溶于蒸馏水中并定容至1 L(K

2

S

2

O

8

比较难溶，

在低于60℃得瑟水浴中溶解，高于60℃配置的溶液至其氧化性失效，NaOH制成溶液，

致其温度达到常温后与K

2

S

2

O

8

溶液混合定容至1L)

测定：移取A母液10ml至消化试管，加入10ml氧化剂，水浴中加热，温度升高到

120℃后保持90min，使用紫外分光光度计测定A

220

和A

275

，空白需加入1ml氧化剂并

同时作水浴处理。（Tips：农化上母液与氧化剂各取25ml，此处取其比例为1:1。）

标准曲线：0.7218g硝酸钾溶于水中，转入1000ml容量瓶中定容摇匀，制得浓度为

100mg/L的氮标准贮存液。稀释10倍即为10mg/L的氮标准溶液。吸取氮标准溶液（梯

度为0ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，6ml；对应浓度分别为0 mg/L，0.02 mg/L，

0.04 mg/L，0.06 mg/L，0.08 mg/L，0.10 mg/L，0.12mg/L）于50ml容量瓶中，各加

入1ml氧化剂并定容，得氮的标准系列，与样品同样消煮测定A

220

和A

275

。以A（A=

A

220

-A

275

）为纵标，氮浓度为横标绘制标准曲线。

硝态氮测定1

注：硝态氮测定1仅适合于农田土壤，腐殖质含量比较低的土壤，森林土壤和腐殖质

含量比较高的土壤不适用，因为森林土壤和腐殖质高的土壤有腐植酸的颜色，干扰比色可

采用硝态氮测定2进行测定

测定：移取B母液5ml定容至50ml容量瓶中，使用紫外分光光度计测定即可，在

220nm和275nm直接测定A220和A275，用校正吸光度A=A220-A275查得硝酸根浓

度，空白为去离子水。

NO3--N标准曲线：0.1631g硝酸钾溶解定容至1L，制得浓度为100mg/L的硝酸根

标准溶液。标准曲线梯度为0ml，0.5ml，1ml，2ml，3ml，4ml，5ml，对应浓度分别为

0mg/L，1mg/L，2mg/L，4mg/L，6mg/L，8mg/L，10mg/L。()

硝态氮测定2

1、酚二磺酸比色法

1）方法原理

土壤用饱和CaSO4 2H2O溶液浸提，在微碱性条件下蒸发至干，土壤浸提液中的NO3

－—N在无水的条件下能与酚二磺酸试剂作用，生成硝基酚二磺酸。

C6H3OH(HSO3)2+HNO3→C6H2OH(HSO3)2 NO2+H2O

2，4-酚二磺酸 6-硝基酚-2，4-二磺酸

此反应必须在无水条件下才能迅速完成，反应产物在酸性介质中无色，碱化后则为稳

定的黄色溶液，黄色的深浅与NO3－—N含量在一定范围内成正相关，可在400～425nm

处（或用蓝色滤光片）比色测定。酚二磺酸法的灵敏度很高，可测出溶液中0.1mg•L-1 NO3

－—N，测定范围为0.1～2mg•L-1。

2）主要仪器

分光光度计、水浴锅、瓷蒸发皿。

3）试剂

（1）酚二磺酸试剂：

称取白色苯酚（C6H5OH，分析纯）25.0g置于500mL三角瓶中，以150mL纯浓

H2SO4溶解，再加入发烟H2SO475mL并置于沸水中加热2h，可得酚二磺酸溶液，储于

棕色瓶中保存。使用时须注意其强烈的腐蚀性。如无发烟H2SO4，可用酚25.0g，加浓

H2SO4225mL，沸水加热6h配成。试剂冷后可能析出结晶，用时须重新加热溶解，但不

可加水，试剂必须贮于密闭的玻塞棕色瓶中，严防吸湿。

（2）10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液：

准确称取KNO3（二级）0.7221g溶于水，定容1L，此为100µg•mL-1 NO3－—N

溶液，将此液准确稀释10倍，即为10µg•mL-1 NO3－—N标准溶液。

（3）CaSO4•2H2O（分析纯、粉状）、

（4）CaCO3（分析纯、粉状）、

（5）1:1 NH4OH、

（6）活性碳（不含NO3－），用以除去有机质的颜色。

（7）Ag2SO4（分析纯、粉状）、Ca(OH)2（分析纯、粉状）和MgCO3（分析纯、

粉状），用以消除Cl-1的干扰。

4）操作步骤

测定

（1）吸取B母液 50mL加入0.1g CaSO4•2H2O（注2）[凝聚剂的作用，使滤液不

混浊而澄清（含]NO3－—N 20～150µg）震荡过滤，取25ml滤液于瓷蒸发皿中，加CaCO3

约0.05g（注5）[调节pH，防止NO3－—N在酸性和中性条件下蒸干分解而损失]，在水

浴上蒸干（注6），到达干燥时不应继续加热。稍冷，迅速加入酚二磺酸试剂1---2 mL，

将皿旋转，使试剂接触到所有的蒸干物。静止10min使其充分作用后，加水20 mL，用玻

璃棒搅拌直到蒸干物完全溶解。冷却后缓缓加入1：1 NH4OH（注7）并不断搅拌混匀，

至溶液呈微碱性（溶液显黄色 不再加深）再多加2mL，以保证NH4OH试剂过量。然后

将溶液全部转入100mL容量瓶中，加水定容（注8）。在分光光度计上用光径1cm比色杯

在波长420nm处比色，以空白溶液作参比，调节仪器零点。

（2）同时，NO3－—N工作曲线绘制：分别取10µg•mL-1NO3－—N标准液0、1、

2、5、10、15、20mL于蒸发皿中，在水浴上蒸干，与待测液相同操作，进行显色和比色，

绘制成标准曲线，或用计算器求出回归方程。

5）结果计算

土壤中NO3－—N含量（mg•kg-1）

=

式中：C(NO3－-N)——从标准曲线上查得（或回归所求）的显色液NO3－-N 质量

浓度（µg•mL-1）；

V——显色液的体积（mL）；

ts——分取倍数；

m——风干样品质量，g。

H——风干样品水分质量含量百分数。

6）注释

注1．

硝酸根为阴离子，不为土壤胶体吸附，且易溶于水，很易在土壤内部移动，在土壤剖

面上下层移动频繁，因此测定硝态氮时注采样深度。即不仅要采集表层土壤，而且要采集

心土和底土，采样深度可达40cm、60 cm以至120 cm。试验证明，旱地土壤上分析全

剖面的硝态氮含量能更好地反映土壤的供氮水平。和表层土壤比较，则全剖面的硝态氮含

量与生物反应之间有更好的相关性，土壤经风干或烘干易引起NO3－—N变化，故一般都

用新鲜土样测定。

注2．

用酚二磺酸法测定硝态氮，首先要求浸提液清彻，不能混浊，但是一般中性或碱性土

壤滤液不易澄清，且带有机质的颜色，为此在浸提液中应加入凝聚剂。凝聚剂的种类很多，

有CaSO4、CaO、Ca(OH)2、CaCO3、MgCO3、KAl(SO4)2、CuSO4等，其中CuSO4

有防止生物转化的作用，但在过滤前必须以氢氧化钙或碳酸镁除去多余的铜，因此以

CaSO4法提取较为方便。

注3．

如果土壤浸提液由于有机质而有较深的颜色，则可用活性炭除去，但不宜用H2O2，

以防最后显色时反常。

注4．

土壤中的亚硝酸根和氯离子是本法的主要干扰离子。亚硝酸和酚二磺酸产生同样的黄

色化合物，但一般土壤中亚硝酸含量极少，可忽略不计。必要时可加少量尿素、硫尿和氨

基磺酸（20g•L-1NH2SO3H）以除去之。例如亚硝酸根如果超出了1µg•mL-1时，一般

每10mL待测液中加入20mg尿素，并放置过夜，以破坏亚硝酸根。

检查亚硝酸根的方法：可取待测液5滴于白瓷板上，加入亚硝酸试粉0.1g，用玻璃棒

搅拌后，放置10min，如有红色出现，即有1mg•L-1亚硝酸根存在。如果红色极浅或无

色，则可省去破坏亚硝酸根手续。

Cl-对反应的干扰，主要是加酸后生成亚硝酰氯化合物或其它氯的气体。如果土壤中含

氯化合物超过15mg•kg-1，则必须加Ag2SO4除去，方法是每100mL浸出液中加入

Ag2SO4 0.1g (0.1g Ag2SO4 可沉淀22.72mg Cl-)，摇动15min，然后加入Ca(OH)2

0.2g及MgCO3 0.5g，以沉过量的银，摇动5min后过滤，继续按蒸干显色步骤进行。

NO3- + 3Cl- + 4H+ → NOCl + Cl2 + 2H2O

亚硝酰氯

注5．

在蒸干过程中加入碳酸钙是为了防止硝态氮的损失。因为在酸性和中性条件下蒸干易

导致硝酸离子的分解，如果浸出液中含铵盐较多，更易产生负误差。

注6．

此反应必须在无水条件下才能完成，因此反应前必须蒸干。

注7．

碱化时应用NH4OH，而不用NaOH或KOH，是因为NH3能与Ag+络合成水溶性

的[ (NH3)2]+，不致生成Ag2O的黑色沉淀而影响比色。

注8．

在蒸干前，显色和转入容量瓶时应防止损失

铵态氮测定

方法原理

0.5mol•L-1 K2SO4溶液浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH4+及水溶性NH4+浸

提出来。土壤浸提液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料

靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。在含氮0.05～0.5mg•L-1的范围内，吸光度与铵态氮含量成

正比，可用比色法测定。

2）试剂

（1）2mol/LKCl溶液 称取149.1g氯化钾（KCl，化学纯）溶于水中，稀释至1L。

（2）苯酚溶液 称取苯酚（C6H5OH，化学纯）10g和硝基铁氰化钠

[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱

中保存。

（3）次氯酸钠碱性溶液 称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠

（Na2HPO4•12H2O, 化学纯）9.431g、磷酸钠（Na3PO4•12H2O, 化学纯）31.8g和 5.25%

次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含5%有效氯的漂白粉溶液)10mL溶于1L水中，贮于棕色

瓶中，在4℃冰箱中保存。

（4）掩蔽剂 将400g/L的酒石酸钾钠（KNaC4H4O6•4H2O, 化学纯）与100g/L

的EDTA二钠盐溶液等体积混合。每100mL混合液中加入10 mol•L-1氢氧化钠0.5mL。

得清亮溶液。

（5）5mg/L 铵态氮（NH4+—N）标准溶液 称取烘干的硫酸铵[(NH4)2SO4，分

析纯]0.4717g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1L，制备成含铵态氮（N）100µg•mL –1

的贮存溶液；使用前取5ml将其加水稀释至100ml，即配制成含铵态氮（N）5mg/L的

标准溶液备用。

3）仪器与设备：分光光度计。

4）分析步骤

测定： 吸取B土壤浸出液2mL～10mL(含NH4+—N2µg～25µg)放入50mL容量

瓶中，用氯化钾溶液补充至总体积为10mL，加水20ml，然后加入苯酚溶液5mL和次氯

酸钠碱性溶液5mL，摇匀。在20℃左右的室温下放置1h后（注1），加掩蔽剂1mL以溶

解可能产生的沉淀物，然后用水定容至刻度。用1cm比色槽在625nm波长处（或红色滤

光片）进行比色，读取吸光度。用空白试验溶液（只有相同试剂，但无土壤浸出液的空白

溶液），调零。

（3）工作曲线 分别吸取0，0.5，1，2，3，4，5mL的含铵态氮（N）5mg/L的标

准溶液于50mL容量瓶中，各加10mL氯化钾溶液，同（2）步骤进行比色测定。

6）注释

注1. 显色后在20℃左右放置1h,再加入掩蔽剂.过早加入会使显色反应很慢,蓝色偏弱;

加入过晚,则生成的氢氧化物沉淀可能老化而不易溶解.

参考文献

（1）南京农业大学主编. 土壤农化分析（二版） 北京:农业出版社, 1986, 40～64

（2）李酉开. 紫外分光光度法测定硝酸盐, 土壤学进展. 1992, 6, 44～45

（3）易小琳, 李酉开, 韩琅丰. 紫外分光光度法测定硝酸氮. 土壤通报. 1983, 6

（4）鲍士旦主编. 土壤农化分析（三版） 北京:中国农业出版社, 2000, 49～61

微生物氮的测定

试剂配制：

混合催化剂：按照硫酸钾：五水硫酸铜：硒粉=100：10：1，称取硫酸钾100g、五

水硫酸铜10g、硒粉1g。均匀混合后研细,贮于瓶中。

密度为1.84浓硫酸。

40%氢氧化钠：称400g氢氧化钠于烧杯中，加蒸馏水600ml，搅拌使之全部溶解定

容至1L。

2%硼酸溶液：称20g硼酸溶于1000ml水中，再加入20ml混合指示剂。（按体积比

100:2加入混合指示剂）

混合指示剂：称取溴甲酚绿0.5g和甲基红0.1克,溶解在100ml95%的乙醇中,用稀氢

氧化钠或盐酸调节使之呈淡紫色，此溶液pH应为4.5。

0.01mol的盐酸标准溶液：取比重1.19的浓盐酸0.84ml，用蒸馏水稀释至1000ml，

用基准物质标定之。5M K2SO4溶液：称取K2SO4174.33g溶解于蒸

0.5M K2SO4溶液：称取K2SO4 87.165g溶解于蒸馏水中，搅拌溶解，（可加热）

定容至1L。

去乙醇氯仿的配制：在通风柜中，量取100毫升氯仿至500毫升的分液漏斗中，加入

200毫升的蒸馏水，加塞，上下振荡10下，打开塞子放气，而后加塞再振荡10下，反复

3次，将分液漏斗置于铁架台上，静止溶液分层，打开分液漏斗下端的阀，将下层溶液（氯

仿）放入200毫升的烧杯中，将剩余的溶液倒入水槽，用自来水冲洗。再将烧杯中的氯仿

倒入分液漏斗中，反复3次。将精制后的氯仿倒入棕色瓶中，加入无水分析纯的CaCl2 10g，

置于暗处保存。

试验步骤

测定：经试验：微生物碳测定只吸取2ml，采用重铬酸钾-硫酸亚铁滴定法测定。微生

物氮吸取滤液A和B母液10ml于消化管中，加入2g催化剂，在再加5ml浓硫酸，管口

放一弯颈小漏斗，将消化管置于通风橱内远红外消煮炉的加热孔中。打开消煮炉上的所有

加热开关进行消化，加热至微沸，关闭高档开关，继续加热。消煮至溶液呈清彻淡蓝色，

然后继续消煮0.5—1.0h，最后溶液呈蓝绿色，土呈灰白色，全部消煮时间约85一90 min。

消煮完毕冷却，同时做两个试剂空白试验。

（3）计算：

A．氮含量计算

土壤含氮量（%）=(V-V0)*N*0.014*100*ts/W

V-滴定试样时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

V0 -滴定空白时消耗的盐酸标准溶液体积，ml。

N-盐酸标准溶液的当量浓度。（此处为0.01）

W-土壤样品重（用水分系数换算成烘干土重）g。

0.014-氮的毫克当量

ts为分取倍数，滤液为30ml，试验测定用了10ml，因此处ts为3

B．微生物氮计算

B(N) =EN／KEN

式中 B(N)——微生物量氮（BN）质量分数，-1；

EN——熏蒸土样浸提的全 N 与未熏蒸土样之间的差值，-1；（取上述A母液

测定的氮和B母液测定的氮的差值）

KEN—代表被氯仿熏蒸杀死的土壤微生物生物量碳在培养期间矿化为矿质态氮的比例，

常取 0.57（Jenkinson.1988）

注：所有的滤液测定参考的方法为：陈立新《土壤实验实习教程》，步骤和熏蒸前期处

理参考：吴金水《土壤微生物生物量测定方法及其应用》，所有的药品全是分析纯，若土壤

比较贫瘠可在消煮的时候加多点浸提液。