黄芪甲苷调控线粒体自噬减轻5-Fu诱导老龄大鼠心肌毒性的实验研究_百

2024年3月31日发(作者：贴春联作文)

378

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

实验研究

黄芪甲苷调控线粒体自噬减轻5-Fu诱导老龄大鼠

心肌毒性的实验研究

252

李沅洋

1，

，周湘忠

3

，雷向红

4

，张宇凡

2，

，徐月

1，

，魏丽萍

2△

摘要：目的探索黄芪甲苷（AS-Ⅳ）通过PINK1/Parkin信号通路调控自噬减轻5-氟尿嘧啶（5-Fu）诱导老龄大鼠

18月龄雄性SD大鼠36只，按随机数字表法分为对照组、模型组、AS-Ⅳ组，每组12心肌毒性的疗效及机制。方法

只。以5-Fu注射液30mg/kg，腹腔注射，隔日1次，连续7次建立模型组；AS-Ⅳ稀释液，20mg/kg，灌胃，每日1次，连

续14次，建立AS-Ⅳ组。检测血清肌钙蛋白（IcTnI）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、心肌线粒体腺苷三磷酸（ATP）及膜

电位水平、行HE及Masson染色观察心肌病理改变、免疫荧光染色检测微管相关蛋白LC3Ⅱ表达、电镜观察线粒体结

构并采用Westernblot检测PINK1/Parkin通路关键分子PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、LC3蛋白表达。结果与模型

组相比，AS-Ⅳ可减缓大鼠体质量下降，降低心肌cTnI及CK-MB水平，抑制线粒体ATP水平下降（P＜0.05）。与对照

组相比，模型组心肌纤维排列紊乱，胶原纤维沉积，胶原容积百分比升高；经AS-Ⅳ干预后，胶原容积百分比减低

（P＜0.05）。电镜及LC3Ⅱ荧光染色显示，经AS-Ⅳ干预后，线粒体损伤程度减轻，LC3Ⅱ表达量减低（P＜0.05）。

Westernblot结果提示AS-Ⅳ苷干预后Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ表达较模型组降低（P＜0.05）。结

论5-Fu可诱导心肌线粒体损伤，线粒体自噬过度，AS-Ⅳ可通过调节自噬减轻5-Fu心肌毒性。

关键词：氟尿嘧啶；黄芪甙；线粒体；自噬；衰老；心脏毒性；黄芪甲苷；PINK1/Parkin信号通路

中图分类号：R73-361文献标志码：ADOI：10.11958/20202229

TheexperimentalstudyonastragalosideⅣregulatingmitochondrialautophagytoreduce

myocardialtoxicityinducedby5-Fuinagingrats

1GraduateSchoolofTianjinUniversityofTraditionalChineMedicine,Tianjin300193,China;2DepartmentofCardiology,

TianjinUnionMedicalCenter;3DepartmentofCardiology,TianjinBinhaiNewAreaDagangHospital;4Departmentof

Ultrasound,TianjinUnionMedicalCenter;5GraduateSchoolofTianjinMedicalUniversity

△

LIYuan-yang

1,2

,ZHOUXiang-zhong

3

,LEIXiang-hong

4

,ZHANGYu-fan

2,5

,XUYue

1,2

,WEILi-ping

2△

CorrespondingAuthorE-mail:*******************

reduce5-fluorouracil(5-Fu)inducedmyocardialtoxicitybadonPINK1/s

Thirty-sixmaleSDratsaged18monthsweredividedintocontrolgroup,modelgroupandAS-Ⅳgroupbyrandomnumber

erventiongroupwasadministeredtheintragastrical20mg/kgAS-Ⅳdiluenteverydayfor

umlevelsoftroponinI(cTnI),creatinekinaisoenzyme(CK-MB),myocardialmitochondrialATPand

Theexpressionofmicrotubule-associatedprotein(LC3Ⅱ)rastructureof

PINK1,Parkin,Beclin1,LAMPandLC3)s

tablemethod,modelwasadministeredtheintraperitonealinjectionof30mg/kg5-Fu

assonstainingwereudtoevaluatethepathologicalchangesofmyocardium.

teinexpressionsofPINK1/Parkinpathway(keymolecules

andinhibitthedecreaofmitochondrialATPlevels(P＜0.05).Comparedwithcontrolgroup,themyocardialfiberswere

Comparedwiththemodelgroup,

Abstract:ObjectiveToinvestigatetheeffectandmechanismofastragalosideⅣ(AS-Ⅳ)regulatingautophagyto

AS-Ⅳcouldslowdowntheweightloss(P＜0.05),reducethecretionofmyocardialenzymecTnIandCK-MB(P＜0.05)

disorderlyarrangedheinterventionof

基金项目：天津滨海新区卫生健康委员会科技重点支持项目（2019BWKZ004）；京津冀基础研究合作专项（19JCZDC63900）

AS-Ⅳ,thecollagenvolumefractiondecreadinthemodelgroup(P＜0.05).ElectronmicroscopyandLC3Ⅱfluorescence

作者单位：1天津中医药大学研究生院（邮编3000193）；2天津市人民医院心脏内科；3天津滨海新区大港医院心脏内科；4天津市人民医院

超声科；5天津医科大学研究生院

作者简介：李沅洋（1988），女，硕士，住院医师，主要从事抗代谢类化疗药物心脏毒性方面研究。E-mail：**********************

△

通信作者E-mail：*******************

天津医药2021年4月第49卷第4期

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labelingshowedthatafterAS-Ⅳintervention,thedegreeofmitochondrialdamagewasreducedandtheexpressionofLC3Ⅱ

wasdecread(P＜0.05).WesternblotresultsindicatedthatBeclin1,PINK1,Parkin,LAMPandLC3Ⅱ/Ⅰexpression

levelsweresignificantlyreduced(P＜0.05).Conclusion

cardiacmitochondrialautophagy,andAS-Ⅳalleviatesitbyregulatingautophagy5-Fumyocardialtoxicity.

The5-Fuinducesmyocardialmitochondrialinjuryandexcessive

Keywords:fluorouracil;Astragalin;mitochondria;autophagy;aging;cardiotoxicity;astragalosideⅣ;PINK1/Parkin

signalingpathway

疗药物，

5-氟尿嘧啶

临床应用广泛，

（5-fluorouocil

尤其对于无法耐受手术需药

，5-Fu）是抗代谢类化

物化疗的老龄患者意义重大。然而，5-Fu发挥抗肿

瘤效应的同时存在多器官不良反应，其中肿瘤相关

心血管疾病报道尤为多见

［1-2］

。5-Fu用于老龄尤其

是伴有心血管基础疾病的患者时心脏毒性发生率更

高，程度更重

［3］

。因此，应重视化疗药物心脏毒性的

防治。黄芪甲苷（AstragalosideⅣ，AS-Ⅳ）是黄芪的

主要活性成分，可通过清除氧自由基、抗脂质过氧化

等途径参与心肌细胞的保护

［4］

。本研究拟在老龄鼠

模型中评价AS-Ⅳ对5-Fu诱导心肌毒性的保护作

用，从调控线粒体自噬稳态角度初探其分子机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组18月龄（老龄）雄性SD大鼠36只，平

均体质量（600±50）g，购自北京维通利华实验动物技术公司，

动物许可证号：SCXK（京）2019-0006。将大鼠依次编号，应

用随机数字表法进行分组，分为对照组、模型组和AS-Ⅳ组，

每组12只。所有大鼠饲养于天津市人民医院恒温动物实验

中心，自由进食水。经预实验后以5-Fu注射液30mg/kg，隔

日1次，腹腔注射，连续7次，构建5-Fu心脏毒性模型，对照

组等方式等剂量给与0.9%氯化钠注射液；AS-Ⅳ组在造模基

础上以AS-Ⅳ稀释液20mg/kg，每日1次，灌胃，连续14次。

本实验经天津市人民医院伦理委员会批准（2020-B03）。

1.2主要仪器和试剂氟尿嘧啶注射液（20mg/支，天津金

耀氨基酸有限公司，批准文号H12020959），大鼠血清心肌肌

钙蛋白（IcTnI）及肌酸激酶同工酶（CK-MB）酶联免疫吸附测

定（ELISA）试剂盒（武汉Elabscience有限公司），线粒体腺苷

三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）及膜电位检测试剂盒

Group

阳万类生物有限公司）

公司），Beclin1、Parkin

，兔源

，LC3

、

LC3Ⅱ一抗（美国Proteintech

一抗及辣根过氧化物酶标记的

PINK1、LAMP、COX-Ⅳ一抗（沈

山羊抗兔二抗IgG（美国CellSignalingTechnology公司）。多

功能酶标仪（美国Bio-Rad公司），光学显微镜、荧光显微镜

日本Nikon公司），透射电镜（日本日立公司），凝胶成像分析

系统（美国Bio-Rad公司）。AS-Ⅳ购自MedChemExpress，纯

度为98.0%，实验药物用量参照产品在体实验推荐剂量。按

照

20

大鼠总用量取AS-Ⅳ粉剂，溶于10%

下以

mmol/L

0.9%氯化钠注射液稀释成

母液于-4℃保存，用时取出适量母液在超声助溶

DMSO中配制为

10mmol/L。

1.3实验方法

1.3.1大鼠一般情况观察各组大鼠自给药前1d起至第15

天，连续监测体质量，依据体质量给予相应剂量药物，最终以

给药第0、3、6、9、12、15天体质量值作为统计数据。同时观察

给药期间各组大鼠毛色、精神状态、纳食、二便等情况。于实

验第15天处死取材。至实验结束，模型组死亡3只，AS-Ⅳ组

死亡1只。

1.3.2

30

血清cTnI及CK-MB检测腹主动脉取血，室温静置

采用

min

ELISA

，离心（

法检测大鼠血清

4℃，1000×g，15

（OD

CK-MB

min），收集血清。每组取

）值，绘制标准曲线，

、cTnI含量。酶标仪在

6只，

指标含量。

450nm波长处测量光密度计算样本

1.3.3线粒体ATP检测取新鲜心肌组织20mg，加入裂解

液，匀浆低温离心（4℃，12000×g，5min）取上清，将ATP标准

溶液稀释成不同浓度制备标准曲线，配制ATP检测工作液，

将

5min

100

消

μL

除

ATP

ATP

检测工作液加入不透光

本底后加入待检样品

96

，采

孔板内，

用化学

室温静置

（luminometer）测定RLU值。取少量上清用BCA法检测蛋白

发光仪

浓度，最终ATP值需转换为μmol/g蛋白形式进行定量。该指

标需以新鲜组织、低温环境下提取线粒体，以保证细胞存活

及线粒体呼吸代谢相关酶的活性，对时间效率要求较高。因

此实验中调整样本量（n=5），达到取材与线粒体提取同时进

行，缩短耗时以减少误差。

1.3.4膜电位检测取新鲜心肌组织20mg，冰上匀浆提取

线粒体，按试剂盒配制JC-1缓冲液，将碳酰氰基-对-氯苯腙

（CCCP）稀释成10μmol/L，制备阳性对照，于不透光96孔板

中加入JC-1检测工作液及样本，充分混匀后采用荧光显微

镜检测JC-1单体及聚合体激发光与发射光荧光值。以膜电

位聚合体与单体红/绿荧光比值（R/G）为最终结果。该指标

同样需以新鲜组织、低温环境下提取线粒体，除需保证细胞

存活及线粒体膜完整性外，JC-1工作液染色后也需立即观

察，以减少荧光淬灭。该指标与线粒体ATP检测同时进行，

每组取5只。

1.3.5

48h，脱水包埋组织，

组织病理学分析

切片（

取左心室组织固定于

4μm），并行苏木精-

4%

伊红

多聚甲醛

色及

（HE）染

Image

Masson染色。样品于光学显微镜下观察、摄片。采用

积百分比

J软件进行心肌纤维化程度相对定量分析，

（collagenvolumefraction，CVF%）=阳性蓝染面积

心肌胶原容

/组

织总面积×100%。因5-Fu所诱导的心脏毒性以心肌收缩力

下降为主

［5-6］

，左心室结构及功能为评估心脏受损的良好指

标，同时为使组织充分固定，避免裂片及染色不均，故选取左

心室进行病理（HE、Masson、LC3Ⅱ）及电镜观察。因模型组

（上海碧云天有限公司）

（

380

死亡3只，每组取4只进行观察分析。

1.3.6电镜观察线粒体超微结构取新鲜左心室心肌组织

切成体积＜1mm

3

的组织块，于2.5%戊二醛固定液中固定24h，

冲洗后，于1%锇酸固定液固定2h，梯度乙醇脱水，环氧树脂

包埋后超薄切片机切片，超薄切片经枸橼酸铅、醋酸铀双重

染色后，嵌入环氧树脂。样品于透射电镜下观察、摄片。

1.3.7LC3Ⅱ免疫荧光染色检测心肌石蜡切片常规脱蜡、

脱水，

8

10%

min

一

60

抗

山羊血清室温封闭

煮沸，

置于加入柠檬酸修复液

保温数分钟后中小火

（pH=6.0）的修复盒中，中火

修复完毕后复温

30

、洗

min

涤

。加入

7min

；滴加二

LC3Ⅱ

。自然冷却后洗涤。

一抗，4℃过夜。

封片后荧光显微镜下观察、

min。洗涤后滴加DAPI，室温避光染核

抗，

摄片。采用Image

5

室

min

温

J软件进行阳

，

避

PBS

光

冲洗。

孵育

性标记计数。

1.3.8蛋白质免疫印迹分析取新鲜心肌组织匀浆提取线

粒体蛋白，BCA法定量、SDS-PAGE电泳分离、转膜，4℃过夜

孵育PINK1、Parkin、Beclin1、LAMP、COX-Ⅳ抗体（稀释度均

为1∶500）及LC3抗体（稀释度为1∶1000），次日洗膜后以辣

根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG抗体（稀释度为1∶1000）继

续孵育90min。扫描胶片，采用ImageJ软件进行相对定量分

析，各目的蛋白以COX-Ⅳ（内参蛋白）进行校正。

1.4统计学方法采用SPSS23.0对数据进行统计分析。符

合正态分布计量资料采用

x±s

表示，各组间比较采用单因素

方差分析，结合Tukey's检验进行多重比较，非正态分布数据

采用非参数检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1大鼠一般情况对照组大鼠饮食活动情况良

好，体质量保持稳定状态。模型组出现活动力差，纳

差，并伴有不同程度的腹泻症状，自给药第6天起体

质量下降。经AS-Ⅳ干预后，大鼠精神状态及摄食

情况优于模型组，体质量下降幅度较小。实验过程

各组大鼠体质量变化趋势，见图1。

900

750

量

（

g

）

600

质

体

鼠

450

大

300

150

对照组

模型组

0

0

AS-Ⅳ

3

组

691215

时间（d）

各时间点组间比较：F

12.861

＊＊

，F

0d

＝0.122，F

3d

12d

=31.490

＊＊

，F

15d

=19.404

＊＊

=1.602

，

＊

P＜

，

0.05

F

6d

=4.464

＊

，F

，

＊＊

P＜0.01

9d

；

=

a

与对照组比较，

Fig.1

b

与模型组比较，P＜0.05

Changes

图1各组大鼠体质量变化

ofratbodyweightineachgroup

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

2.23组大鼠心肌酶变化与对照组相比，模型组

血

AS-Ⅳ

清cTnI及CK-MB水平明显升高（P＜0.05），而

0.05

组上述心肌酶指标较模型组显著降低（P＜

Tab.

），

1

见表

Comparison

1。

ofCK-MBandcTnIlevelsbetween

threegroups

表1各组大鼠血清CK-MB及cTnI水平比较

（ng/L，

x±s

）

组别

n

对照组

模型组

644.71±6.56

cTnI

26.20±7.49

CK-MB

AS-Ⅳ组

6

6

147.45±33.64

a

ab

143.18±38.74

a

＊

F

109.84±29.03

P＜0.01；

与对照组比较，

b

与模型组比较，

20.535

＊

77.78±27.24

ab

a

P＜0.05

13.456

＊

2.33组大鼠心肌线粒体功能损伤情况与对照组

相比，模型组线粒体ATP水平及膜电位均明显下降

P＜0.05）。与模型组相比，AS-Ⅳ组ATP水平显著

升高（P＜0.05），膜电位R/G比值2组间差异无统计

学意义（P＞0.05），见表2。

Tab.2ComparisonofMMPandATPlevelsbetween

threegroups

表2各组大鼠心肌组织线粒体膜电位及ATP水平比较

（x±s）

组别

n

对照组

ATP

膜电位（R/G）

模型组

50.88±0.18

（μmol/g）

1.97±0.44

AS-Ⅳ

F

组

5

5

0.36±0.05

a

0.64±0.15

ab

0.95±0.34

a

13.062

＊＊

1.50±0.33

5.610

＊

＊

P＜0.05，

＊＊

P＜0.01；

a

与对照组比较，

b

与模型组比较，P＜0.05

2.43组大鼠心肌纤维化变化HE染色结果：对照

组心肌纤维排列整齐，未见特异性病理改变；模型组

心肌细胞排列欠规则，心肌纤维略显粗大，部分细胞

核深染浓集；AS-Ⅳ组心肌纤维排列欠规则，但并无

明显特异性病理改变。Masson染色结果：对照组心

肌间质纤维可见少量蓝染区域，呈轻微纤维化表现；

模型组心肌纤维增粗，间隔增大，可见较多间质蓝染

区，纤维化程度较重；AS-Ⅳ组心肌间质仍可见纤维

化，但程度较模型组减低，见图2。与对照组胶原容

积

1.84%

百分

0.87%

）升

比（

高

3.53%±0.88%

，与模型

）相比，模型组（16.74%±

2.53

）

组大鼠心肌线粒体结构及功能变化

明显减低（F=40.331

组相

，

比

P＜

，

0.05

AS-

）

Ⅳ

。

组（10.18%±

对照组

心肌细胞质膜完整，肌丝排列整齐，线粒体结构正

常，线粒体嵴排列致密，可见单个自噬小体；模型组

表现为线粒体稀疏，核周间隙扩张，线粒体部分肿

胀、固缩，形态不均，并可见较多脂滴沉积及自噬小

（

天津医药2021年4月第49卷第4期

381

照组LC3Ⅱ表达量（84.00±7.55）相比，模型组

（167.75±14.01）升高，与模型组相比，AS-Ⅳ组LC3Ⅱ

表达量（120.05±16.09）则减低（F=35.321，P＜0.05），

见图4。

体，线粒体结构破坏较为严重；AS-Ⅳ组显示线粒体

排列欠规则，线粒体出现肿胀，但形态及结构大致正

常，其间可见单个散在自噬泡，见图3。

2.63组大鼠心肌组织LC3Ⅱ表达水平比较与对

HE染色（×200）

Masson染色（×100）

Fig.2

对照组模型组AS-Ⅳ组

Thepathologicalmorphologyofmyocardialtissuesunderlightmicroscopebebweenthethreegroups

图23组大鼠心肌组织光镜下病理形态变化

×10000

×20000

Fig.3

对照组模型组AS-Ⅳ组

Thepathologicalmorphologyofmyocardialmitochondriaunderelectronmicroscopebebweenthethreegroups

图33组大鼠电镜下心肌线粒体形态变化

对照组模型组AS-Ⅳ组

Fig.4TheproteinexpressionlevelsofLC3Ⅱinmyocardialtissues(×400)

图43组大鼠心肌组织LC3Ⅱ免疫荧光标记染色（×400）

382

2.73组大鼠心肌线粒体自噬PINK1/Parkin信号通

路

Beclin1

相关

表

、

蛋

PINK1

白表

、

达水平与对照组相比，模型组

（

Parkin

达量

P＜0.05

、LC3Ⅱ/Ⅰ

升高（P

Parkin

＜

），见图5

及

0.05

、LAMP及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白相对

、表

LAMP

），AS-

3。

表达量则较模型组减低

Ⅳ组Beclin1、PINK1、

Beclin1

ABC

60ku

PINK1

54ku

Parkin

49ku

COX-Ⅳ

19ku

LAMP

ABC

45ku

LC3Ⅰ

LC3Ⅱ

16

14

ku

ku

COX-Ⅳ

19ku

Fig.5Theproteins

A：对照组；

expressions

B：模型组；

ofPINK1/Parkin

C：AS-Ⅳ组

图5大鼠心肌组织

myocardial

PINK1/Parkin

tissues

pathwayin

通路相关蛋白表达情况

Tab.3Comparisonoftheproteinexpressionof

PINK1/Parkinpathwayinmyocardialtissues

betweenthreegroups

表3大鼠心肌组织PINK1/Parkin通路相关蛋白表达比较

（n=4，

x

±s）

组别

对照组

模型组

0.73±0.12

Beclin1

1.01±0.66

PINK1

AS-Ⅳ

F

组

1.54±0.13

a

1.26±0.21

ab

1.54±0.20

a

33.365

＊＊

1.19±0.13

b

7.774

＊

组别

对照组

模型组

0.77±0.27

ParkinLAMPLC3Ⅱ/Ⅰ

1.62±0.09

a

0.61±0.09

1.21±0.12

a

1.09±0.18

1.43±0.95

a

AS-Ⅳ

F

组1.06±0.11

babb

8.949

＊

0.91±0.13

22.935

＊＊

1.16±0.10

5.309

＊

＊＊

P＜0.05，

＊

P＜0.01；

a

与对照组比较，

b

与模型组比较，P＜0.05

3讨论

在关注高龄患者化疗药物心脏毒性损伤的同时，

5-Fu用于化疗时存在潜在且严重的心脏毒性，

需

更加关注其心脏毒性的预防及治疗。

粒体损伤是一种机制假说。药理机制研究指出

5-Fu引起心脏毒性的发病机制是多方面的，线

5-

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

Fu

粒体，

体内代谢产物氟

阻断三羧酸循环，

-柠檬酸

减少

（

ATP

F-Cltrate

产生，

）可作用于线

改变线粒体

膜通透性，从而导致线粒体功能异常

［7］

。线粒体损

伤导致有缺陷的细胞器逐渐积累，由此线粒体自噬

被启动

［8］

。自噬是一种程序化的细胞内降解过程，

平衡的自噬可满足代谢需要、细胞器更新及维持细

胞稳态

［9］

。自噬的激活通常被认为具有心脏保护

性，而过度的自噬导致细胞死亡和心肌受损

［10-11］

。

的线粒体自噬信号通路，

PINK1/Parkin信号通路是已知的研究较为深入

其参与多种心血管系统疾

病的发生发展

［12-13］

。Kubli等

［14］

证实沉默PINK1基

因后心肌细胞中线粒体功能受损，氧化应激水平增

高，进而引起心力衰竭。Givvimani等

［15］

在小鼠升主

动脉缩窄诱导的心力衰竭模型中也发现抑制线粒体

自噬后可明显减少升主动脉缩窄引起的心肌纤维

化。因此，自噬的动态变化对心血管疾病具有不同

的意义，即维持平衡状态的自噬有益于心肌保护，但

线粒体自噬过度则可能加重心肌损伤。本研究大鼠

在经5-Fu刺激后线粒体自噬PINK1/Parkin信号通

路相关蛋白Beclin1、PINK1、Parkin、LAMP和LC3Ⅱ/Ⅰ

比值升高，提示线粒体自噬参与了5-Fu诱导的心肌

损伤，且线粒体可呈现自噬过度状态。

黄芪是经典的多效中药之一，临床用于冠心病、

心绞痛的治疗且已取得显著疗效

［16］

。AS-Ⅳ是黄芪

的主要成分之一，研究表明AS-Ⅳ通过激活一氧化

氮

cGMP/PKG

合成酶（

GSK-3）失活，

信号通路，

NOS）产生

抑制线粒体通透性转换孔

进一步使糖原合成酶激酶

一氧化氮（NO），从而激活

（mPTP）

-3

开

放，发挥心肌线粒体保护作用

［17］

；同时AS-Ⅳ能够下

调心肌组织磷酸化缝隙连接蛋白

Caspa-3

肌细胞凋亡

表达水平，

［18］

。

上调Bcl-2的表达，

3（P-Cx3

从而抑制心

）以及

基于以上研究基础，笔者参照Li等

［19-20］

干预方

式以观察AS-Ⅳ对化疗药物心脏损伤的保护作用。

本研究发现，

AS-Ⅳ

在5-Fu诱导的心脏毒性模型中给予

食及精神状态；

干预能改善大鼠的一般状况，

此外，组织病理学检测以及心肌酶学

包括体质量、摄

检测结果均表明AS-Ⅳ可减轻心肌细胞损伤、减缓

心肌组织纤维化进展，并能改善心肌细胞线粒体质

量，从而缓解化疗药物对心肌的损伤。

线粒体质量控制是维持细胞正常活动的关键，

线粒体自噬过程对于质量控制至关重要

［21］

。研究表

明AS-Ⅳ通过PINK1/Parkin信号通路参与多种心血

管疾病的预防及治疗

［22-23］

。黄莉等

［24］

以心肌缺血再

灌注模型观察AS-Ⅳ对细胞自噬及心肌组织损伤的

（

天津医药2021年4月第49卷第4期

影响，结果表明AS-Ⅳ能够降低Beclin1的表达，抑

制自噬从而保护心肌。为进一步探索AS-Ⅳ参与调

节线粒体自噬的分子机制，本研究对PINK1/Parkin

信号通路蛋白表达进行定量，结果表明AS-Ⅳ可降

低Beclin1和LAMP蛋白表达。LAMP为溶酶体膜蛋

白，可用于监测自噬体与溶酶体融合状态，AS-Ⅳ干

预后LAMP蛋白表达水平降低，提示线粒体自噬通

量下降，

Parkin

心肌线粒体数量与质量的内稳态。

通路过度激活，

表明AS-Ⅳ可通过抑制线粒体自噬

调控自噬稳定状态，从而维持

PINK1/

综上，AS-Ⅳ可减轻5-Fu诱导心肌损伤，其机制

可能是AS-Ⅳ通过调节线粒体自噬稳态，改善线粒

体质量，从而发挥心肌细胞保护作用。本研究在动

物实验基础上初步探索了AS-Ⅳ在预防及改善5-Fu

诱导心肌毒性中的作用与机制，为肿瘤患者尤其是

老龄患者临床化疗安全性提供了新的干预策略及研

究方向。

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［

384

TianjinMedJ,April2021,Vol.49No.4

实验研究

CD137-CD137L信号通路通过活化TNF受体相关因子6

促进小鼠动脉粥样硬化斑块内血管新生

翁嘉懿

1

，殷云杰

2

，马雪兴

1

，李渊

1

，陈璐

1

，何洪涛

1

，徐桂冬

1△

，孙康云

1

摘要：目的

管新生。方法

探讨CD137-CD137L信号通路是否通过活化TNF受体相关因子6（TRAF6）促进粥样硬化斑块内血

将小鼠内皮细胞（bEnd.3）和小鼠主动脉环分别分为对照组（培养基中加入10μg/LTNF-α）、IgG同型

对照组（培养基中加入10μg/LTNF-α+5mg/LIgG2b）和CD137刺激组（培养基中加入10μg/LTNF-α+5mg/LCD137

抗体）。利用转染小干扰RNA（siRNA）技术抑制内皮细胞和主动脉环TRAF6基因表达，将内皮细胞和主动脉环分别

分为对照siRNA组（转染对照siRNA）和TRAF6siRNA组（转染TRAF6siRNA）。分别采用Westernblot和实时荧光定

量PCR（qPCR）检测内皮细胞和主动脉环TRAF6、血管内皮生长因子（VEGF）、Smad1/5蛋白和mRNA的表达；采用

新生实验检测主动脉环新生微血管形成能力。结果

Transwell迁移实验检测内皮细胞的迁移能力；内皮细胞管腔形成实验检测内皮细胞的管腔形成能力；主动脉环血管

mRNA表达水平均高于对照组和IgG同型对照组（均P＜0.05）。与对照siRNA组比较，TRAF6siRNA组内皮细胞和主

低，主动脉环新生微血管数量减少（均P＜0.05）。结论

样硬化斑块内血管新生。

关键词：抗原，CD137；动脉粥样硬化；TNF受体相关因子6；Smad1蛋白质；Smad5蛋白质；血管新生

中图分类号：R541.4文献标志码：ADOI：10.11958/20202041

CD137-CD137L信号通路可能通过TRAF6促进小鼠动脉粥

CD137刺激组内皮细胞和主动脉环TRAF6、VEGF蛋白和

动脉环TRAF6、Smad1/5蛋白和mRNA表达水平明显降低，内皮细胞迁移数量减少，内皮细胞小管长度和分支数量降

CD137-CD137Lsignalingpromotesangiogenesisinatherosclerosisplaqueofmicethrough

activatingTNFreceptorassociatedfactor6

1DepartmentofCardiovascularDias,SuzhouHospitalAffiliatedtoNanjingMedicalUniversity,Suzhou215000,China;

2DepartmentofCardiovascularDias,YixingPeople'sHospital

△

WENGJia-yi

1

,YINYun-jie

2

,MAXue-xing

1

,LIYuan

1

,CHENLu

1

,HEHong-tao

1

,XUGui-dong

1△

,SUNKang-yun

1

CorrespondingAuthorE-mail:******************

atherosclerosisplaqueviaactivatingTNFreceptorassociatedfactor6(TRAF6).Methods

Abstract:ObjectiveToexplorewhetherCD137-CD137Lsignalingpathwaycanpromoteangiogenesisin

theaorticringsfrommalemiceweredividedintothefollowinggroups:controlgroup(with10μg/LTNF-αinculture

medium),IgGisotypecontrolgroup(with10μg/LTNF-α+5mg/LIgG2binculturemedium)andCD137activatedgroup

基金项目：苏州市“科教兴卫”青年科技项目（KJXW2017040）；苏州市科技局项目（sys2018088）

作者单位：1南京医科大学附属苏州医院心血管内科（邮编215000）；2宜兴市人民医院心血管内科

作者简介：翁嘉懿（1991），女，硕士，主治医师，主要从事动脉粥样硬化发病机制及治疗研究。E-mail：********************

△

Endothelialcells(bEnd.3)and

通信作者E-mail：******************

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（本文编辑魏杰）

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