二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用

2024年3月31日发(作者：楚雨荨经典台词)

二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用

█山东大学齐鲁医院临床药理研究所 李平利 张蕊 郭瑞臣

5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前体药物卡培他滨临床常用于乳腺癌、结直肠癌及

头颈癌等多种肿瘤的治疗。5-FU进入机体后，80%以上经肝脏二氢嘧啶脱氢酶

（DPD）代谢并转化为氟代β-丙氨酸（FBAL），FBAL的代谢产物为氟乙酸

（Fluoroacetate）和氟代柠檬酸（F-citrate），是引起5-FU心脏及神经毒性

的主要活性物质。部分未经DPD代谢的5-FU在体内转化为具有生物活性的FUTP

和FdUTP，通过干扰肿瘤细胞RNA或DNA的生物合成发挥抗肿瘤作用，或转化为

FdUMP，与胸苷酸合成酶（TS）、5，10-亚甲基四氢叶酸（CH2THF）形成稳定的

三联复合物，抑制TS正常功能，干扰DNA合成，发挥DNA介导的细胞毒性作用

（如图所示）。DPD基因（DPYD）存在多态性，不同个体间DPD活性差异较大，

甚至部分或完全缺失。DPD部分或完全缺失个体，5-FU常规剂量可导致清除率降

低，发生5-FU相关毒性，如粘膜炎、粒细胞减少症、神经性病变，甚至死亡。

而DPD高表达个体，则造成5-FU耐受，常规剂量难以达到理想治疗效果。由于

DPYD基因存在多个突变位点，或可能存在未知位点，或某些位点功能活性的研

究尚不完全，导致已知DPYD基因突变与DPD表型缺乏一致性。因此，DPD活性

测定对于5-FU个体化治疗更具重要意义。其他参与5-FU体内生物转化的尿苷磷

酸化酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、胸苷磷酸化酶等的基因型及活性不同个体间也

不完全相同，使产生活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP的量存在差异。而FUTP、

FdUTP及FdUMP是杀伤肿瘤细胞的直接作用形式，故测定其细胞内浓度可更直接

地揭示或预测5-FU的疗效或毒副作用。因此，直接或间接测定DPD活性及5-FU

活性代谢产物水平有助于制订、调整、修饰5-FU的给药方案，提高疗效，降低

毒副作用，并进一步评价常规5-FU浓度测定的优势和局限性，明确5-FU发挥药

效或产生毒副作用的机制。

1. DPD活性测定

DPD活性测定包括表型测定（Phenotype）、基因型测定（Genotype）、蛋

白表达及mRNA水平测定。

1.1 DPD表型测定

表型指在环境影响下基因型所发生的机体的物理表现和可见性状，不同表型

药物代谢酶的催化代谢活性大小, 可通过测定其底物的代谢率断定。底物可以是

外源性探针药物，如异烟肼、氨苯砜、咖啡因等可用于测定N-乙酰基转移酶表

型测定，非治疗目的，一次性服用；也可以是治疗药物，如5-氟尿嘧啶，以原

形与代谢物比值表示相关酶活性的强弱。

DPD分布于人体多个组织、器官，但主要存在于肝脏，参与80%以上5-FU

的肝脏代谢。测定血浆或尿液二氢尿嘧啶（UH2）、尿嘧啶（U）、二氢胸腺嘧啶

（THY2）、胸腺嘧啶（THY）、二氢氟尿嘧啶（5-FUH2）、氟尿嘧啶（5-FU）浓

度，计算UH2/U、THY2/THY、5-FUH2/5-FU值可间接反映DPD活性。

Ben Fredj等采用高效液相色谱-紫外方法测定9例接受5-FU/亚叶酸钙化疗

的晚期结直肠癌患者血浆UH2与U峰面积，计算所得UH2/U值范围为0.07～3.12。

该比值与相应5-FU血浆半衰期呈负指数相关，与患者5-FU毒性相关。Serdar

等采用LC-MS/MS测定45例接受5-FU治疗患者PBMCs中5-FUH2和5-FU浓度，

计算得5-FUH2/5-FU值为21.9±3.72，2例DPD缺失患者分别为1.26和1.61，

说明DPD活性缺失可使5-FU的清除率严重降低。

Van Kuilenburg AB等以放射性[4-14C]THY为底物，采用反相高效液相色谱

方法检测THY及其降解产物THY2浓度，以每毫克蛋白每小时代谢生成的THY2

nmol数表示DPD活性。结果显示，2例5-FU治疗出现严重毒性反应的癌症患者

PBMCs DPD活性分别为3.2nmol·mg-1·h-1和4.2nmol·mg-1·h-1，低于健康

志愿者平均DPD活性水平。其中1例患者治疗后康复期DPD活性恢复到正常水平

（8.6nmol·mg-1·h-1）。进一步研究显示，44例接受5-FU/亚叶酸钙化疗患者

PBMCs中DPD活性在4.2～16.0nmol·mg-1·h-1范围内呈高斯分布，较低DPD

活性与中性粒细胞减少症显著相关，但与胃肠道反应、流感样症状、手足综合征

等毒副反应无相关性。

Büchel等采用LC-MS/MS方法测定10例结直肠癌患者接受5-FU治疗前内源

性血浆U、UH2及接受5-FU治疗2h后外源性5-FU、5-FUH2浓度。结果显示，U

和UH2浓度范围分别为（0.07～2.6）和（0.81～1.77）μM，UH2/U值为3.7～

15.4；5-FU和5-FUH2浓度范围为（1.4～6.7）和（9.1～25.8）μM。由于DPD

可能存在饱和状态，接受5-FU治疗后，即体内有5-FU存在时，U和UH2浓度高

于接受5-FU治疗前，即体内不存在5-FU时。Sistonen等认为，多数个体，接

受5-FU治疗前的UH2/U值为DPD非饱和状态时的活性，不能准确反映DPD活性

变化，而5-FU治疗期间所得UH2/U值更准确。因此，接受5-FU治疗前给予一定

量DPD底物（如U），所得UH2/U值可更准确评估DPD活性，并准确预测5-FU

相关性毒性。

另外，由于5-FU可被DPD代谢为FBAL，FBAL水平也可一定程度上反映DPD

活性。有报道采用RP-HPLC法测定体外细胞内经DPD分解的5-FU代谢物FBAL

浓度，或采用LC-MS/MS法测定职业暴露于5-FU人员尿液FBAL浓度，可用于监

测、评价医护人员暴露于5-FU的风险，也可用于DPD活性测定。

采用探针药物间接测定DPD活性，包括其他药物代谢酶，快速、简便，易于

推广，但探针药物须代谢机制清楚，代谢途径单一；排除其他疾病、年龄因素影

响；原形和代谢物浓度测定方法应灵敏专一。

1.2 DPYD基因型测定

已知DPYD基因存在30多种单核苷酸多态性及缺失突变，包括DPYD*2A、

DPYD*13等，可造成DPD活性降低或缺乏。不同的基因位点突变对DPD活性影响

不同，因此，明确DPYD基因型与活性之间的相关性可用于指导5-FU剂量方案调

整。

DPYD*2A突变导致第14位外显子缺失，造成DPD活性降低甚至丧失。一项

Meta分析结果表明，DPYD*2A突变与5-FU相关毒性反应（≥3级）密切相关（OR

5.42，P<0.001），须将5-FU或卡培他滨初始给药剂量降至标准剂量的50%，以

降低DPYD*2A突变携带者发生严重毒性反应的风险。Henricks等认为，DPYD*2A

纯合突变个体，不建议给予5-FU类药物。杂合突变个体DPD活性降低50%，

c.2846A>T纯合突变个体降低50%，杂合突变个体降低25%，可采用荧光原位杂

交、基因测序等技术分析DPYD基因多态性，根据患者基因型预测DPD活性及DPD

代谢5-FU的能力，高效、简便，可用于5-FU的个体化治疗。但由于体内处置过

程的复杂性和未知基因突变位点存在的可能性，以及已发现突变位点与酶活相关

性有待证实，通过基因型预测酶活性尚有一定局限性。

1.3 DPD蛋白及mRNA水平测定

DPD mRNA水平与DPD活性密切相关，肿瘤组织或细胞DPD活性可预测5-FU

的治疗效应和毒性效应。因此，也可采用免疫组化或逆转录聚合酶链反应

（RT-PCR）方法测定肿瘤组织DPD蛋白表达，预测DPD活性。Kim等测定184名

胃切除术并替吉奥（S-1）辅助化疗的胃癌患者肿瘤组织DPD蛋白表达及mRNA

水平，单变量或多变量分析表明，肿瘤组织DPD蛋白表达量或mRNA水平较低患

者，5年无病生存期（DFS）差，更易发生非血液学毒性（≥3级）反应。但肿瘤

组织DPD mRNA高表达患者，对以5-FU为基础的化疗方案则产生较差的治疗效果。

提示，DPD不仅影响5-FU及含5-FU药物治疗方案的治疗效应和毒性作用，还影

响决定疗效的活性产物生成。

2. 5-FU活性代谢产物测定

由于细胞内活性代谢物含量较低，细胞转运蛋白外排作用的程度难以确定，

代谢物与内源性核苷酸结构高度类似存在干扰，较难准确测定。但FUTP、FdUTP、

FdUMP确为5-FU细胞内发挥抗肿瘤作用的活性物质，细胞内水平直接反映到达

作用部位的量，对于指导5-FU剂量方案调整，阐述耐受机制，有不可替代的作

用。因此，应建立准确、可行、实用的体内FUTP、FdUTP、FdUMP水平测定方法。

Carli等采用固相提取法，对极性化合物有较长保留时间的AtlantisC18色

谱柱，流动相为甲酸铵（5mM，pH4）/甲醇/水（5/5/90，v/v），等离子梯度洗

脱，三重四级杆质谱检测器定量测定MCF-7细胞内5-FdUMP（ng/μg蛋白）。结

果显示，5-FU孵育后30min内，细胞内5-FdUMP的量呈线性增加。操作简便，

可用于生物样本5-FdUMP检测。

Derisn等建立了UPLC-MS/MS方法测定接受5-FU治疗患者PBMCs中FUTP、

FdUTP、FdUMP含量。采集患者16ml外周血，提取白细胞，甲醇裂解后取上清液

进样。3例口服卡培他滨及5例接受FOLFOX6化疗方案治疗的癌症患者PBMCs中

FUTP、FdUTP、FdUMP测定结果显示，卡培他滨给药后0～8h内，测得FUTP最低

浓度为1.84nM，但未测出FdUTP和FdUMP。同样，静脉注射5-FU患者，测得FUTP

最低浓度为178nM，FdUMP最低浓度为3.39nM，但未测出FdUTP。提示该方法特

异、灵敏，但需进一步优化，或扩大样本，提高研究方法的适用性，以实现对生

物样本FUTP、FdUMP和FdUTP的定量检测以及临床实用价值的评价。

3.展望

DPD酶在5-FU化疗过程中发挥着重要的作用，掌握其生理病理特点、作用

规律和影响因素有助于提高5-FU的疗效，降低其毒副作用。虽然DPYD基因多态

性检测已被推荐用于预测5-FU类化疗药物的毒性及敏感性，5-FU浓度测定也被

常规用于治疗药物监测，但作为补充，DPD酶活性测定可更全面反映由未知基因

突变或非基因因素造成的DPD活性改变，并作为制定、调整、修饰5-FU治疗方

案的依据，提高5-FU治疗的有效性和安全性。

此外，尽管DPD活性研究已较为深入，但由于研究者的角度不同，如样本来

源，体内体外研究，采用的方法不同，如色谱法、光谱法、免疫法等，或样本量

的局限性，导致DPD活性缺乏统一的界值，即低于界值患者更大可能出现高风险

毒性反应，从而需要规范设计、采用先进技术、进行更大样本量的研究，以确定

DPD活性界值。

5-FU活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP可直接反映其发挥疗效、产生毒副

作用及耐受的机制，有助于进一步揭示5-FU代谢动力学特征，有助于5-FU的个

体化治疗，有助于验证、评价5-FU常规治疗监测的可靠性及可行性，因此，排

除内源性核苷酸的干扰，建立灵敏、可靠、实用、可行的细胞内ng甚至pg水平

FUTP、FdUTP、FdUMP活性代谢物定量测定方法，可最大限度地指导5-FU的临床

合理使用。