2024年3月28日发(作者:写人的)
2005 Vol.17 No.4
天然产物研究与开发
NATURALPRODUCTRESEARCHANDDEVELOPMENT
523
二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用
李 波
1,2*
,陈海华,许时婴
22
(1.河南科技学院食品学院,新乡453003;2.江南大学食品学院,无锡214036)
摘 要:二维核磁共振谱(2DNMR)是获取多糖结构信息,尤其是在多糖序列分析方面的有力工具。本文重点介
绍了在多糖结构解析中常用的几种2DNMR谱以及2DNMR解析多糖结构的方法。
关键词:核磁共振;二维核磁共振;多糖;结构
中图分类号:O65
ApplicationofTwoDimensionNuclearMagneticResonanceintheStructural
DeterminationofPolysaccharide
LIBo
1,2*
,CHENHai-hua
2
,XUShi-ying
2
(hool,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China;
ofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)
Abstract:Twodimensionnuclearmagneticresonance(2DNMR)isapowerfultoolacquiringstructuralinformationofpolysac-
charide,l2DNMRspectraoftenudinpolysaccharidestructural
analysisandthemethodforstudyingpolysaccharidestructureusing2DNMRareintroducedinthispaper.
Keywords:nuclearmagneticresonance;2DNMR;polysaccharide;structure
近年来,多糖类化合物由于具有多方面的功能
性质,因而成为研究领域的一个热点,多糖的结构及
其构效关系也越来越引起人们的重视。
经典的分析方法如高碘酸氧化、Smith降解和甲
基化分析等,对简单多糖的结构还能解析,但对复杂
的多糖则有些力不从心。尤其是对于糖基之间的连
接序列,往往只能依靠推测,缺乏确凿的证据。核磁
共振(NMR)方法引入多糖结构的研究后,大大推动
了这一领域的发展。早期NMR主要解决多糖结构
中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目,随着
NMR技术的发展,尤其是二维核磁共振(2DNMR)
的出现和发展,NMR逐渐成为获得多糖结构信息最
有力的工具。NMR具有不破坏样品的优点,因而在
获取多糖的结构信息后,所用的样品可以通过除去
溶剂而回收。
目前,国内有关2DNMR研究多糖结构的文献
很少
[1,2]
针对性
。面对种类繁多的2DNMR,初学者往往
感到无从下手,而且限于条件,也不可能每种2D
NMR都去做一做。事实上,不同的2DNMR谱,它
所提供的信息是不同的。对于多糖,一般只需测定
其中的几种2DNMR谱,就能获得必要的结构信息。
下面介绍2DNMR在多糖结构中的应用。
[3-6]
1 NMR的准备工作
1.1 单糖组成和甲基化分析
对于结构复杂的多糖,尤其是结构未知的多糖,
直接采用NMR分析结构难度很大,也不可取,因而
在NMR分析之前最好做一些基础性的工作,主要是
单糖组成的测定和甲基化分析。而且,这些前期的
分析结果越准确越有助于对NMR结果的解析。
1.2 样品的制备
通常,多糖的分子量越大,NMR谱图中峰的重
叠越严重,也就越难解析,如果多糖的分子量超过2
万,则有可能得不到十分清晰的图谱。当然,这也与
多糖结构的复杂程度有关,不能一概而论。因此,对
,相关介绍2DNMR的书籍又缺乏对多糖的
收稿日期:2004-04-06 接受日期:2004-05-12
*通讯作者Tel:86-373-3040977;E-mail:libowuxi@
524
天然产物研究与开发 2005 Vol.17 No.4
于分子量很大而结构又比较复杂的多糖,最好将多
糖进行部分酸水解后再进行NMR分析。
多糖的分子量大,样品浓度最好超过30mg/
mL,而且浓度越大,越有利于测定
[7]
。但是,样品溶
解后的粘度不能太大,要有一定的流动性,以使各部
分的磁场均匀。样品管底部少量的沉淀不影响分
析,关键是磁场扫描范围内的溶液要均匀一致。
测定多糖的溶剂一般是重水(D
2
O)。国外有报
道先用D
2
O将样品冷冻干燥3次(或减压蒸发3
次),以充分替换出样品中原有的H
2
O,再进行NMR
测试。但若将固体样品直接溶于D
2
O后进行NMR
测试,一般也能得到比较满意的结果。内标通常用
TMS和DSS,也可以用甲醇、丙酮等来定标,但要注
意所加入的溶剂不能破坏多糖的溶解性。
[8,9]
3)确定硫酸基的取代位置
[11]
。硫酸酯多糖中硫酸
基的取代位置对多糖的生理功能有重要影响,若用
红外光谱法来判定硫酸基的位置并不可靠
,
13
CNMR可有效地解决这一问题。糖环上某一位置
的碳若发生硫酸基的取代,则其化学位移向低场移
动6~9ppm。因此,通过比较硫酸酯多糖脱硫前后
的
13
CNMR谱,就可以确定硫酸基在糖环上的取代位
置。4)确定某些糖类。例如,δ170~176范围内的
低场信号表明存在己糖醛酸的羧基或乙酰氨基,δ
16~18范围内的高场信号表明有6位脱氧糖的甲
基存在。5)确定异头碳的构型。多数β型异头碳的
化学位移高于α型约2~3ppm,因而可对H谱的分
析结果进一步确证。但此规律不适用于甘露糖和鼠
李糖,因为它们的α与β化学位移几乎在同一位置。
[12]
2 1DNMR在多糖结构分析中的应用
1
2.1 HNMR
1
HNMR主要解决多糖结构中糖苷键构型的问
3 2DNMR在多糖结构分析中的应用
以上
13
CNMR的应用大多建立在对多糖
13
13
CNMR谱的全归属基础之上,而2DNMR对于多糖
题。通常α型糖苷的异头质子超过δ5.0,β型一般
小于δ5.0。此外,耦合常数
3
J
1,2
对解析异头质子的
构型也有帮助。如果异头质子同时满足化学位移小
于5.0且
3
J
1,2
大于6,则认为是β型。反之,若化学
位移大于5.0且J
1,2
小于4,则认为是α型。J
1,2
的
计算方法是谱峰的分裂间距(ppm)乘以仪器的工作
频率。
此外,异头质子(H1)和6位脱氧糖的甲基(H6)
信号的线宽和积分可用于区别糖单元的类型及其相
对含量。
2.2 CNMR
13
CNMR的化学位移范围较宽,而且通常采用
全去耦法,每一种化学等价的碳原子只有一条谱线,
因而谱图的分辨率好,谱线很少重叠。
13
13
33
CNMR谱的全归属起着至关重要的作用。下面重
点介绍几种在多糖结构研究中比较常用的2DNMR
谱。
3.1 同核位移相关谱
3.1.1 COSY(化学位移相关谱,
1
H,
1
HChemicalShift
CorrelationSpectroscopy)
COSY能够提供糖环中相邻氢核之间的耦合关
系。COSY谱中,每个交叉峰反映了相邻氢核之间的
耦合关系。交叉峰的强度与其有关的
3
J值密切相
关,
3
J值大,交叉峰的强度就大,反之亦然。
由于异头质子易于确认,所以一般从异头质子
的对角线峰出发,首先找到H1/H2的交叉峰,通过
划线即可找出H2的对角线峰。再由H2的对角线
峰出发,依次找出H3~H6的对角线峰和化学位移。
3.1.2 COSY-45(β-COSY)
COSY的脉冲序列由两个90°的脉冲组成。如果
减小第二个脉冲的宽度,使其倾倒角减小,则会对交
叉峰及对角线峰的精细结构产生影响。在COSY-45
中,第二个脉冲角度是45°。与COSY相比,COSY-45
减少了平行跃迁间的磁化转移强度,限制了多重峰
的间接跃迁,对角线峰则因自身的自相关峰消失而
简化。因此,COSY-45谱中的对角线峰沿对角线变
窄,减少了对邻近的交叉峰的干扰,有利于复杂分子
的密集峰群的解析。另外,从COSY-45还可判别耦
合常数的符号。对于多糖,推荐采用COSY-45谱。
CNMR在多糖结构研究中的作用如下:1)确
定糖残基的数目和相对含量。异头碳的共振信号出
现在δ90~110,由于所有异头碳的共振是非等价的
且很少重叠,因而可根据这一范围内峰的个数来确
定糖残基的数目,还可根据峰的相对高度来估算糖
残基的相对比例。2)确定糖链的连接位置。糖环上
某个位置的碳如发生取代,则其化学位移向低场移
动6~7ppm。如α-Glc的C4的化学位移是δ70.6,
C4被取代后化学位移变为δ78.1。因此,如果糖残
基的各个碳都得以归属,就可以通过与已知单糖的
碳的化学位移进行比较
[7,10]
,确定糖链的连接位置。
2005 Vol.17 No.4李 波等:二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用
525
3.1.3 DQF-COSY(双量子滤波COSY,DoubleQuan-
tumFilteredCOSY)
就自旋体系的识别而言,DQF-COSY所能提供
的信息与COSY毫无二致。DQF-COSY的优点在于
它抑制了强峰和溶剂峰,而且由于对角线峰和交叉
峰均为吸收型,所以分辨率较高。然而,DQF-COSY
的灵敏度比同等条件下的COSY低。
3.1.4 TQF-COSY(三量子滤波COSY)
TQF-COSY只能显示至少三个以上两两耦合的
自旋之间的交叉峰。对于糖环而言,满足这一条件
的质子一般只有H5和H6(6位通常有两个质子),
而在COSY谱中出现的其它谱峰均被“洗白”。因
此,TQF-COSY可以作为COSY谱的一个补充,用于
识别H5和H6。
在很多情况下,单靠COSY并不能完成多糖中
各个糖环质子的识别。这种不完全的识别往往是由
于缺乏质子间的交叉峰连接
。交叉峰的缺失可能
是由于以下原因造成的:1)也是最常见的原因,是两
个化学位移很接近而相互间的耦合又较强的两个质
子的交叉峰很容易掩埋在对角线峰中;2)两个质子
间的耦合太弱,因而所形成的交叉峰强度太小,难于
观测;3)由于谱峰相互重叠,有的交叉峰可能根本无
法识别。总之,还有必要做其它的一些实验作为补
充才能完成谱峰的识别。
3.1.5 TOCSY(全相关谱,TotalCorrelationSpectroscopy)
COSY给出的是相邻氢核间的相关峰,而TOC-
SY给出的是同一自旋体系中所有氢核间的相关峰,
包括长程耦合和短程耦合。从任一谱峰出发,可以
找到好几个相关峰,它们与该氢核处于同一自旋体
系,如H1/H2,H1/H3,H1/H4等,因而可能克服一些
COSY谱中由于谱峰重叠造成的困难。TOCSY可以
作为COSY谱的补充和验证。
3.1.6 NOESY(NuclearOverhaurEffectSpectroscopy)
NOESY的外观与COSY相似,其差别在于交叉
峰表示的不是耦合关系,而是NOE关系。通常间距
小于5 的两个质子,在谱上会出现交叉峰,且空间
距离越近,NOE作用越强。对于多糖,NOESY可作
为COSY的补充来识别谱峰,也可用来确定糖残基
间的连接方式。
3.2 碳氢相关谱
3.2.1 HSQC(异核单量子相干,HeteronuclearSingle-
qauntumCoherence)
HSQC反映的是直接相连的H、C核之间的耦
113
[4]
1
合关系(J
CH
),它的作用相应于H,C-COSY。在用
H,HCOSY等将糖单元的氢核的化学位移进行归属
后,通过HSQC,就可将碳核的化学位移进行归属。
此外,如果某些氢核的谱峰由于重叠无法识别,可以
根据已识别的δH由HSQC推出相应的δC,然后再
根据
13
CNMR谱的峰形和峰高,结合甲基化分析的
结果,对未知的δH进行反推。
3.2.2 HMBC(异核多键相关,HeteronuclearMultiple-
bondCorrelation)
HMBC把H核与长程耦合的C核关联起来,其
作用相应于长程H,C-COSY,它能提供分子骨架的
结构信息。对于多糖,HMBC可作为一种序列分析
的工具给出糖单元间的连接次序。例如,一种多糖
由A、B、C三种糖单元组成,在HMBC谱中,出现A-
H1/B-C2、B-H1/C-C3、C-H1/A-C4的相关峰,则可以
推定多糖有如下的结构单元:-4A1-2B1-3C1-4A1-。
由此可见,HMBC在多糖结构研究中是一个非常有
用的工具,它解决了糖残基连接序列的问题,这是以
前的分析手段(包括1DNMR)难以做到的,这也正
是2DNMR的魅力所在。
3.3 2DNMR的解析思路
对于多糖的结构分析,必做的2DNMR谱为
COSY-45(或DQF-COSY)、HSQC和HMBC。若条件允
许,TQF-COSY、TOCSY和NOESY也可做一做,以帮
助识别氢核。用2DNMR分析多糖结构的思路如
下:1)首先由碳谱确定异头碳的数目。因为碳谱是
全去耦谱,一般一条谱线对应一种化学等价的碳原
子,而氢谱有耦合峰,异头质子的数目不易确定,且
有些异头质子峰还可能被溶剂峰所掩盖;2)由异头
碳的位移,在HSQC谱中找出异头质子;3)从异头质
子出发,在COSY-45(或DQF-COSY)谱中,找出其它
氢核的化学位移。若不能完成识别,可结合TQF-
COSY、TOCSY、NOESY等帮助识别;4)由氢核的位
移,在HSQC谱中找出碳的位移。对于个别无法识
别的碳,可借助甲基化分析的结果进行推测;5)完成
了氢和碳的归属后,在HMBC谱中找出与某一个糖
单元的异头质子和异头碳相关的另一个糖单元的碳
和氢,从而推出糖单元的连接次序;6)在得到多糖的
初步结构后,最好与甲基化分析的结果进行对照,看
是否有大的出入,这样可以避免2DNMR谱中一些
噪音峰和杂质峰所带来的干扰。
下面举一个例子。笔者在对羊栖菜褐藻糖胶的
113
526
天然产物研究与开发 2005 Vol.17 No.4
从异头质子出发,在COSY-45谱(图2)中,可找出其
它氢核的化学位移。氢和碳的归属完成后,在HM-
BC谱(图3)中可找到B1/D2、C1/A4、C1/D2和D1/
C4(在HMBC谱的其它区域,图3未显示)的相关峰,
由此就能推出糖单元A、B、C、D、E之间的连接次序。
综上所述,2DNMR在多糖结构研究中可以发挥
重要的作用。虽然目前一些结构复杂、分子量大的多
糖用2DNMR还不能完全解决问题,但相信随着NMR
技术的不断发展,更多的多糖结构将会被解开。
参考文献
图1 羊栖菜褐藻糖胶DSJL的HSQC谱
Fig.1 HSQCspectrumofDSJL
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图2 羊栖菜褐藻糖胶DSJL的COSY45谱
Fig.2 COSY45spectrumofDSJL
图3 羊栖菜褐藻糖胶DSJL的HMBC谱
Fig.3 HMBCspectrumofDSJL
结构进行研究时,由于褐藻糖胶的分子量较大且组
成复杂,因此将其部分酸水解后再用2DNMR进行
分析。部分酸水解产物称为DSJL,其分子量约为1
万,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖组成,NMR
仪的工作频率为400MHz。首先由碳谱确定异头碳
A、B、C、D、E,再从HSQC谱(图1)中找出异头质子。
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