二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用_李波

2024年3月28日发(作者：写人的)

2005　Vol.17　No.4

天然产物研究与开发　

NATURALPRODUCTRESEARCHANDDEVELOPMENT　

523

二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用

李　波

1,2＊

,陈海华,许时婴

22

(1.河南科技学院食品学院,新乡453003;2.江南大学食品学院,无锡214036)

摘　要:二维核磁共振谱(2DNMR)是获取多糖结构信息,尤其是在多糖序列分析方面的有力工具。本文重点介

绍了在多糖结构解析中常用的几种2DNMR谱以及2DNMR解析多糖结构的方法。

关键词:核磁共振;二维核磁共振;多糖;结构

中图分类号:O65　　　

ApplicationofTwoDimensionNuclearMagneticResonanceintheStructural

DeterminationofPolysaccharide

LIBo

1,2＊

,CHENHai-hua

2

,XUShi-ying

2

(hool,HenanInstituteofScienceandTechnology,Xinxiang453003,China;

ofFoodScienceandTechnology,SouthernYangtzeUniversity,Wuxi214036,China)

Abstract:Twodimensionnuclearmagneticresonance(2DNMR)isapowerfultoolacquiringstructuralinformationofpolysac-

charide,l2DNMRspectraoftenudinpolysaccharidestructural

analysisandthemethodforstudyingpolysaccharidestructureusing2DNMRareintroducedinthispaper.

Keywords:nuclearmagneticresonance;2DNMR;polysaccharide;structure

　　近年来,多糖类化合物由于具有多方面的功能

性质,因而成为研究领域的一个热点,多糖的结构及

其构效关系也越来越引起人们的重视。

经典的分析方法如高碘酸氧化、Smith降解和甲

基化分析等,对简单多糖的结构还能解析,但对复杂

的多糖则有些力不从心。尤其是对于糖基之间的连

接序列,往往只能依靠推测,缺乏确凿的证据。核磁

共振(NMR)方法引入多糖结构的研究后,大大推动

了这一领域的发展。早期NMR主要解决多糖结构

中糖苷键的构型以及重复结构中单糖的数目,随着

NMR技术的发展,尤其是二维核磁共振(2DNMR)

的出现和发展,NMR逐渐成为获得多糖结构信息最

有力的工具。NMR具有不破坏样品的优点,因而在

获取多糖的结构信息后,所用的样品可以通过除去

溶剂而回收。

目前,国内有关2DNMR研究多糖结构的文献

很少

[1,2]

针对性

。面对种类繁多的2DNMR,初学者往往

感到无从下手,而且限于条件,也不可能每种2D

NMR都去做一做。事实上,不同的2DNMR谱,它

所提供的信息是不同的。对于多糖,一般只需测定

其中的几种2DNMR谱,就能获得必要的结构信息。

下面介绍2DNMR在多糖结构中的应用。

[3-6]

1　NMR的准备工作

1.1　单糖组成和甲基化分析

　　对于结构复杂的多糖,尤其是结构未知的多糖,

直接采用NMR分析结构难度很大,也不可取,因而

在NMR分析之前最好做一些基础性的工作,主要是

单糖组成的测定和甲基化分析。而且,这些前期的

分析结果越准确越有助于对NMR结果的解析。

1.2　样品的制备

　　通常,多糖的分子量越大,NMR谱图中峰的重

叠越严重,也就越难解析,如果多糖的分子量超过2

万,则有可能得不到十分清晰的图谱。当然,这也与

多糖结构的复杂程度有关,不能一概而论。因此,对

,相关介绍2DNMR的书籍又缺乏对多糖的

　　收稿日期:2004-04-06　　　接受日期:2004-05-12

　＊通讯作者Tel:86-373-3040977;E-mail:libowuxi@

524

天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　2005　Vol.17　No.4

于分子量很大而结构又比较复杂的多糖,最好将多

糖进行部分酸水解后再进行NMR分析。

多糖的分子量大,样品浓度最好超过30mg/

mL,而且浓度越大,越有利于测定

[7]

。但是,样品溶

解后的粘度不能太大,要有一定的流动性,以使各部

分的磁场均匀。样品管底部少量的沉淀不影响分

析,关键是磁场扫描范围内的溶液要均匀一致。

测定多糖的溶剂一般是重水(D

2

O)。国外有报

道先用D

2

O将样品冷冻干燥3次(或减压蒸发3

次),以充分替换出样品中原有的H

2

O,再进行NMR

测试。但若将固体样品直接溶于D

2

O后进行NMR

测试,一般也能得到比较满意的结果。内标通常用

TMS和DSS,也可以用甲醇、丙酮等来定标,但要注

意所加入的溶剂不能破坏多糖的溶解性。

[8,9]

3)确定硫酸基的取代位置

[11]

。硫酸酯多糖中硫酸

基的取代位置对多糖的生理功能有重要影响,若用

红外光谱法来判定硫酸基的位置并不可靠

,

13

CNMR可有效地解决这一问题。糖环上某一位置

的碳若发生硫酸基的取代,则其化学位移向低场移

动6～9ppm。因此,通过比较硫酸酯多糖脱硫前后

的

13

CNMR谱,就可以确定硫酸基在糖环上的取代位

置。4)确定某些糖类。例如,δ170～176范围内的

低场信号表明存在己糖醛酸的羧基或乙酰氨基,δ

16～18范围内的高场信号表明有6位脱氧糖的甲

基存在。5)确定异头碳的构型。多数β型异头碳的

化学位移高于α型约2～3ppm,因而可对H谱的分

析结果进一步确证。但此规律不适用于甘露糖和鼠

李糖,因为它们的α与β化学位移几乎在同一位置。

[12]

2　1DNMR在多糖结构分析中的应用

1

2.1　HNMR

1

HNMR主要解决多糖结构中糖苷键构型的问

3　2DNMR在多糖结构分析中的应用

　　以上

13

CNMR的应用大多建立在对多糖

13

13

CNMR谱的全归属基础之上,而2DNMR对于多糖

题。通常α型糖苷的异头质子超过δ5.0,β型一般

小于δ5.0。此外,耦合常数

3

J

1,2

对解析异头质子的

构型也有帮助。如果异头质子同时满足化学位移小

于5.0且

3

J

1,2

大于6,则认为是β型。反之,若化学

位移大于5.0且J

1,2

小于4,则认为是α型。J

1,2

的

计算方法是谱峰的分裂间距(ppm)乘以仪器的工作

频率。

此外,异头质子(H1)和6位脱氧糖的甲基(H6)

信号的线宽和积分可用于区别糖单元的类型及其相

对含量。

2.2　CNMR

13

CNMR的化学位移范围较宽,而且通常采用

全去耦法,每一种化学等价的碳原子只有一条谱线,

因而谱图的分辨率好,谱线很少重叠。

13

13

33

CNMR谱的全归属起着至关重要的作用。下面重

点介绍几种在多糖结构研究中比较常用的2DNMR

谱。

3.1　同核位移相关谱

3.1.1　COSY(化学位移相关谱,

1

H,

1

HChemicalShift

CorrelationSpectroscopy)

COSY能够提供糖环中相邻氢核之间的耦合关

系。COSY谱中,每个交叉峰反映了相邻氢核之间的

耦合关系。交叉峰的强度与其有关的

3

J值密切相

关,

3

J值大,交叉峰的强度就大,反之亦然。

由于异头质子易于确认,所以一般从异头质子

的对角线峰出发,首先找到H1/H2的交叉峰,通过

划线即可找出H2的对角线峰。再由H2的对角线

峰出发,依次找出H3～H6的对角线峰和化学位移。

3.1.2　COSY-45(β-COSY)

COSY的脉冲序列由两个90°的脉冲组成。如果

减小第二个脉冲的宽度,使其倾倒角减小,则会对交

叉峰及对角线峰的精细结构产生影响。在COSY-45

中,第二个脉冲角度是45°。与COSY相比,COSY-45

减少了平行跃迁间的磁化转移强度,限制了多重峰

的间接跃迁,对角线峰则因自身的自相关峰消失而

简化。因此,COSY-45谱中的对角线峰沿对角线变

窄,减少了对邻近的交叉峰的干扰,有利于复杂分子

的密集峰群的解析。另外,从COSY-45还可判别耦

合常数的符号。对于多糖,推荐采用COSY-45谱。

CNMR在多糖结构研究中的作用如下:1)确

定糖残基的数目和相对含量。异头碳的共振信号出

现在δ90～110,由于所有异头碳的共振是非等价的

且很少重叠,因而可根据这一范围内峰的个数来确

定糖残基的数目,还可根据峰的相对高度来估算糖

残基的相对比例。2)确定糖链的连接位置。糖环上

某个位置的碳如发生取代,则其化学位移向低场移

动6～7ppm。如α-Glc的C4的化学位移是δ70.6,

C4被取代后化学位移变为δ78.1。因此,如果糖残

基的各个碳都得以归属,就可以通过与已知单糖的

碳的化学位移进行比较

[7,10]

,确定糖链的连接位置。

2005　Vol.17　No.4李　波等:二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用　

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3.1.3　DQF-COSY(双量子滤波COSY,DoubleQuan-

tumFilteredCOSY)

就自旋体系的识别而言,DQF-COSY所能提供

的信息与COSY毫无二致。DQF-COSY的优点在于

它抑制了强峰和溶剂峰,而且由于对角线峰和交叉

峰均为吸收型,所以分辨率较高。然而,DQF-COSY

的灵敏度比同等条件下的COSY低。

3.1.4　TQF-COSY(三量子滤波COSY)

TQF-COSY只能显示至少三个以上两两耦合的

自旋之间的交叉峰。对于糖环而言,满足这一条件

的质子一般只有H5和H6(6位通常有两个质子),

而在COSY谱中出现的其它谱峰均被“洗白”。因

此,TQF-COSY可以作为COSY谱的一个补充,用于

识别H5和H6。

在很多情况下,单靠COSY并不能完成多糖中

各个糖环质子的识别。这种不完全的识别往往是由

于缺乏质子间的交叉峰连接

。交叉峰的缺失可能

是由于以下原因造成的:1)也是最常见的原因,是两

个化学位移很接近而相互间的耦合又较强的两个质

子的交叉峰很容易掩埋在对角线峰中;2)两个质子

间的耦合太弱,因而所形成的交叉峰强度太小,难于

观测;3)由于谱峰相互重叠,有的交叉峰可能根本无

法识别。总之,还有必要做其它的一些实验作为补

充才能完成谱峰的识别。

3.1.5　TOCSY(全相关谱,TotalCorrelationSpectroscopy)

COSY给出的是相邻氢核间的相关峰,而TOC-

SY给出的是同一自旋体系中所有氢核间的相关峰,

包括长程耦合和短程耦合。从任一谱峰出发,可以

找到好几个相关峰,它们与该氢核处于同一自旋体

系,如H1/H2,H1/H3,H1/H4等,因而可能克服一些

COSY谱中由于谱峰重叠造成的困难。TOCSY可以

作为COSY谱的补充和验证。

3.1.6　NOESY(NuclearOverhaurEffectSpectroscopy)

NOESY的外观与COSY相似,其差别在于交叉

峰表示的不是耦合关系,而是NOE关系。通常间距

小于5 的两个质子,在谱上会出现交叉峰,且空间

距离越近,NOE作用越强。对于多糖,NOESY可作

为COSY的补充来识别谱峰,也可用来确定糖残基

间的连接方式。

3.2　碳氢相关谱

3.2.1　HSQC(异核单量子相干,HeteronuclearSingle-

qauntumCoherence)

HSQC反映的是直接相连的H、C核之间的耦

113

[4]

1

合关系(J

CH

),它的作用相应于H,C-COSY。在用

H,HCOSY等将糖单元的氢核的化学位移进行归属

后,通过HSQC,就可将碳核的化学位移进行归属。

此外,如果某些氢核的谱峰由于重叠无法识别,可以

根据已识别的δH由HSQC推出相应的δC,然后再

根据

13

CNMR谱的峰形和峰高,结合甲基化分析的

结果,对未知的δH进行反推。

3.2.2　HMBC(异核多键相关,HeteronuclearMultiple-

bondCorrelation)

HMBC把H核与长程耦合的C核关联起来,其

作用相应于长程H,C-COSY,它能提供分子骨架的

结构信息。对于多糖,HMBC可作为一种序列分析

的工具给出糖单元间的连接次序。例如,一种多糖

由A、B、C三种糖单元组成,在HMBC谱中,出现A-

H1/B-C2、B-H1/C-C3、C-H1/A-C4的相关峰,则可以

推定多糖有如下的结构单元:-4A1-2B1-3C1-4A1-。

由此可见,HMBC在多糖结构研究中是一个非常有

用的工具,它解决了糖残基连接序列的问题,这是以

前的分析手段(包括1DNMR)难以做到的,这也正

是2DNMR的魅力所在。

3.3　2DNMR的解析思路

　　对于多糖的结构分析,必做的2DNMR谱为

COSY-45(或DQF-COSY)、HSQC和HMBC。若条件允

许,TQF-COSY、TOCSY和NOESY也可做一做,以帮

助识别氢核。用2DNMR分析多糖结构的思路如

下:1)首先由碳谱确定异头碳的数目。因为碳谱是

全去耦谱,一般一条谱线对应一种化学等价的碳原

子,而氢谱有耦合峰,异头质子的数目不易确定,且

有些异头质子峰还可能被溶剂峰所掩盖;2)由异头

碳的位移,在HSQC谱中找出异头质子;3)从异头质

子出发,在COSY-45(或DQF-COSY)谱中,找出其它

氢核的化学位移。若不能完成识别,可结合TQF-

COSY、TOCSY、NOESY等帮助识别;4)由氢核的位

移,在HSQC谱中找出碳的位移。对于个别无法识

别的碳,可借助甲基化分析的结果进行推测;5)完成

了氢和碳的归属后,在HMBC谱中找出与某一个糖

单元的异头质子和异头碳相关的另一个糖单元的碳

和氢,从而推出糖单元的连接次序;6)在得到多糖的

初步结构后,最好与甲基化分析的结果进行对照,看

是否有大的出入,这样可以避免2DNMR谱中一些

噪音峰和杂质峰所带来的干扰。

下面举一个例子。笔者在对羊栖菜褐藻糖胶的

113

526

天然产物研究与开发　　　　　　　　　　　　　　　　2005　Vol.17　No.4

从异头质子出发,在COSY-45谱(图2)中,可找出其

它氢核的化学位移。氢和碳的归属完成后,在HM-

BC谱(图3)中可找到B1/D2、C1/A4、C1/D2和D1/

C4(在HMBC谱的其它区域,图3未显示)的相关峰,

由此就能推出糖单元A、B、C、D、E之间的连接次序。

综上所述,2DNMR在多糖结构研究中可以发挥

重要的作用。虽然目前一些结构复杂、分子量大的多

糖用2DNMR还不能完全解决问题,但相信随着NMR

技术的不断发展,更多的多糖结构将会被解开。

参考文献

图1　羊栖菜褐藻糖胶DSJL的HSQC谱

Fig.1　HSQCspectrumofDSJL

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图2　羊栖菜褐藻糖胶DSJL的COSY45谱

Fig.2　COSY45spectrumofDSJL

图3　羊栖菜褐藻糖胶DSJL的HMBC谱

Fig.3　HMBCspectrumofDSJL

结构进行研究时,由于褐藻糖胶的分子量较大且组

成复杂,因此将其部分酸水解后再用2DNMR进行

分析。部分酸水解产物称为DSJL,其分子量约为1

万,主要由甘露糖、葡萄糖醛酸和葡萄糖组成,NMR

仪的工作频率为400MHz。首先由碳谱确定异头碳

A、B、C、D、E,再从HSQC谱(图1)中找出异头质子。