Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖

2024年3月18日发(作者：徜)

Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛

咖多糖

王全;李红亚;李术娜;王会;李茉莉

【摘 要】利用Box-Behnken设计响应面法优化超声波辅助双水相法提取玛咖多

糖的条件.采用玛咖干根为原料,考察了提取温度、提取时间、料液比3个因素对提

取结果的影响.在单个变量因子实验基础上,通过采用Box-Behnken设计响应面分

析法对玛咖多糖的超声波双水相提取条件进行优化.最佳提取条件为提取温度60℃、

料液比1∶20(质量比)、提取时间52 min.与二次方程的拟合度在0.815 3,得到玛

咖多糖的提取率为15.831％,与实测值15.732％基本一致.Box-Behnken响应面法

用于优化超声波辅助双水相法提取玛咖多糖的条件是可行的,模型预测效果较好,优

化条件具备可行性.

【期刊名称】《河北大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2016(036)004

【总页数】9页(P387-395)

【关键词】玛咖多糖;Box-Behnken设计;超声波提取;双水相

【作 者】王全;李红亚;李术娜;王会;李茉莉

【作者单位】河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科

学学院,河北保定071001;河北农业大学生命科学学院,河北保定071001;衡水市农

机管理总站,河北衡水053000;湖南农业大学生活科学技术学院,湖南长沙410128

【正文语种】中 文

【中图分类】O629

玛咖(Maca)是1年生或2年生的草本植物，属于十字花科(Cruciferae)植物的一种

[1].玛咖中含有丰富的营养成分，如蛋白质、氨基酸、多糖、维生素、不饱和脂肪

酸和矿物质等，其根中不饱和脂肪酸的含量较高，占已知脂肪酸总量的56%以上，

并且其富含的亚麻酸和亚油酸对人体健康有益.另外，玛咖根中含有18种左右的氨

基酸和多种金属离子，其中包括人体必需的8种氨基酸，由于氨基酸组成合理，

对谷物类蛋白有较好的平衡作用[2].玛咖的次生代谢物质主要有玛咖酰胺、玛咖烯、

芥子油苷、异硫氰酸酯、甾醇及其衍生物[3].此外，玛咖的根中还含有微量的单宁、

硫氰酸苄、皂角苷等次生代谢物质[4].

玛咖富含多种营养物质以及活性物质，有非常合理的营养结构，它具有提高生育能

力的保健功能和治疗贫血、抑郁症以及中老年人的更年期综合症、风湿等疾病.此

外，玛咖还具有抗癌和抗白血病的功效以及抗疲劳、调节内分泌等多种独特的药理

作用[5].

多糖是一种天然大分子物质，它是由糖苷键连接醛糖和酮糖而构成的多聚糖，是组

成生命体的关键物质，也是维持生命体的基本能源物质[6].玛咖多糖在医药中的主

要作用包括抗肿瘤、抗辐射、抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗衰老、降血糖、降血脂、

免疫调节等功能[7].目前最常用的多糖提取方法主要有水提法，如陈燕青[8]等用水

提醇沉法提取玛咖多糖后进行含量测定，结果显示出较好的重现性，但是方法操作

时间长，提取率低；酸碱法，如孟宪云[9]等用质量分数5%硫酸铵溶液和水2种

方法提取茜草多糖，发现稀酸提取法产品纯度相对较高.赵云平[10]用0.1 mol/L

氢氧化钠提取知母多糖，多糖得率22.078%，但是酸碱会引起多糖的降解及糖苷

键的断裂，因此操作时间不宜过长；酶法，如Hauke Hilz等应用酶分离得到了更

多的果胶多糖，此方法回收率高，节约能耗，但是提取成本较高；微波法，如胡灵

[11]等利用微波辅助技术提取灵芝多糖，结果比对照组的多糖提取率明显提高.柳

志宇[4]分别利用聚能式和扩散式超声设备对玛咖多糖进行了提取，达到了较好的

效果，提取率分别为15.26%和13.25%.本实验采用超声波[12-13]与双水相萃取

技术[14-15]相结合的方法来提取玛咖多糖.双水相萃取法是利用目标物质在上、下

两相之间的分配系数不同，使两相中目标物质的浓度出现不同，进而实现分离的目

的.双水相萃取法对目标物质回收率高，耗能小，操作条件温和，利于后续提纯工

作.本实验采用Box-Behnken响应面分析法[16]对玛咖多糖的超声波双水相提取工

艺进行优化，建立回归模型，取得了吗咖多糖的最佳提取条件，为玛咖多糖的提取

提供了参考.

数控超声波清洗器、TD5A-WS台式低速离心机，赛特湘仪离心机仪器有限公司；

SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵，河南省予华仪器有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，

河南省予华仪器有限公司；2802UV/VIS分光光度计，上海美谱达仪器有限公司.

玛咖干根细粉，秘鲁；体积分数6%苯酚溶液，DNS溶液，Sevag试剂，浓硫酸

(分析纯)，PEG-400(分析纯)，葡萄糖(分析纯).

2.1 总糖及还原糖含量的测定

以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法进行总糖含量的测定[17]；以葡萄糖为标准，

采用DNS法进行还原糖含量测定.

2.2 多糖含量的测定

多糖量的计算见公式(1)

式中，m多为多糖质量，mg；m总为总糖质量，mg；m还为还原糖质量，mg.

含糖量的计算见公式(2)

式中，m多为多糖质量，mg；m原料为原料质量，mg；m含糖量为多糖的百分

含量.

2.3 标准曲线的建立

苯酚-硫酸法测定总糖含量获得的总糖标准曲线方程为y=6.897x-0.026，其中x

代表总糖的质量(mg)，y代表吸光度值，R2为0.999，线性关系良好.

DNS法测定还原糖含量获得的还原糖标准曲线方程为y=1.312x-0.046，其中x

代表还原糖的质量(mg)，y代表吸光度值，R2=0.998，线性关系良好.

2.4 双水相系统的制备[18]

采用聚乙二醇/硫酸铵作为双水相体系，取一定体积的多糖提取液样品，通过加入

不同比例的PEG-400和硫酸铵，观察其是否分相以及分相的速度和得到的上相与

下相的体积比，最终确定加入的PEG-400占总体系的16.00%，硫酸铵占总体系

的22.00%.

2.5 玛咖多糖的提取[19]

称取玛咖块根粉末5.00 g，按一定的料液比例加入蒸馏水，在一定温度下水浴超

声提取一定时间(超声功率为200 W)，离心分离上层清液，并浓缩至原体积的1/5，

将浓缩液冷却.用Sevag法除蛋白质.取一定体积浓缩液，加入适量PEG-400，充

分溶解后，按一定质量比加入(NH4)2SO4，超声混匀，静止分相，用分液漏斗分

离，取其下相保存，备用.

2.5.1 提取温度对玛咖多糖提取率的影响

料液比1∶20(质量比)，提取时间30 min，提取温度分别为40，50，60，70，

80 ℃，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，并测定多糖提取率.实验结果如表1所

示.

由表1数据作折线图，如图1所示.

结果表明，玛咖多糖提取率随着温度的上升而逐渐增高，当在60 ℃时达到最大值，

之后有微小地下降趋势.这可能由于随着温度的升高，玛咖多糖在水中的溶解度增

大，进而多糖的提取率上升.但是在温度上升的同时，多糖在较高的温度下的分解

也会增加，因此选择60 ℃为实验提取温度.

2.5.2 料液比对玛咖多糖提取率的影响

在提取温度60 ℃，提取时间30 min的条件下，分别按料液比(质量比)1∶10，

1∶15，1∶20，1∶25，1∶30加入蒸馏水，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，

并测定多糖提取率.实验结果如表2所示.

由表2数据作折线图，如图2所示.

结果表明，玛咖多糖的提取率随着料液比的增大而逐渐上升，而当料液比高于

1∶20(质量比)时，玛咖多糖的提取率随着料液比的增大而有所提高.玛咖多糖随着

料液比的增大，在水中溶解的越充分，但是提取增加不大，因此选择料液比

1∶20(质量比)作为实验条件.

2.5.3 提取时间对玛咖多糖提取率的影响

在料液比1∶20(质量比)，提取温度60 ℃，提取时间分别为20，30，40，50，

60 min的条件下，按照2.5的实验路线提取玛咖多糖，并测定多糖提取率.结果如

表3所示.

由表3数据作折线图，如图3所示.

结果表明，在低于40 min时，随着时间的增加玛咖多糖的提取率迅速上升，在

40 min以后提取率增加缓慢，在提取时间为60 min时达到最大值，这可能由于

随着超声时间的增长，玛咖多糖在水中溶解的越充分.但是提取时间在50 min时

的提取率已经接近最大值，考虑到能耗与提取率的关系，实验选择50 min.另外，

玛咖粉在浸泡0.5 h后超声提取与直接超声提取结果变化不大，总结原因可能为药

材粉末由于颗粒较小，在实验的有效时间内即可充分提取；超声提取的效果较彻底.

2.6 响应面实验设计

2.6.1 实验设计

基于单因素实验结果，以提取温度60 ℃，料液比1∶25，提取时间50 min为中

心点，利用Box-Behnken软件进行响应面实验设计.以提取温度A、提取时间B、

料液比C为自变量，以多糖提取率Y为响应值，利用响应面设计软件分析实验结

果.

由响应面设计软件设计实验方案，其方案结果如表5所示.

根据表5的方案条件，按照2.5的实验方法进行实验，零水平实验重复5次，用

以估计实验误差[20].最终将得到玛咖多糖的提取率.

2.6.2 回归模型的建立及方差分析

以玛咖多糖提取率为指标，采用Box-Behnken软件对表5中的数据进行回归分析，

回归分析结果见表6.各因素经过回归拟合后，获得玛咖多糖提取率对编码自变量

提取温度、料液比、提取时间的二次多项回归方程

经Box-Behnken软件分析，Model(模型)的F值是18.23(P<0.001 0)，表明该模

型非常显著.因素的显著性检验结果显示，交互因素AC(即提取温度和料液比交互

作用)P值小于0.000 1，说明其对玛咖多糖提取率有极显著的影响；提取时间的二

次项B2、提取时间B、提取温度的二次项A2的P值均小于0.050 0，说明对玛咖

多糖提取率影响显著；其他因素的P值大于0.100 0，说明无显著影响[21-22].相

对于纯误差失拟项的F值1.60(P=0.322 8>0.050 0)，表明失拟项的差异不显著，

实验的拟合性较好.

由表7可知，变异系数CV=4.42%，说明仅有总变异的4.42%不能用此模型来解

释；回归模型的判定系数R2=0.959 1，通常期望判定系数校正值和判定系数预测

值相接近，但该分析结果显示，判定系数校正值=0.906 5与判定系数预测值

=0.815 3相近.该模型的精密度值是13.038>4，表示该模型可以用来指导设计实

验方案.

为了研究2因素之间交互作用对玛咖多糖提取率的影响，将其中一个因素固定在

零水平，选取剩余2个因素对玛咖多糖提取率进行响应面分析.如图4所示，曲面

上相同提取率所对应的因素值在底面上形成曲线，即为等高线图.等高线的形状可

以清晰地反映出2因素交互作用对玛咖多糖提取率影响的强弱.等高线越接近圆形，

说明交互作用对提取率影响越弱；等高线越接近椭圆形，说明交互作用对提取率影

响越强；在等高线的圆心处附近存在极值的条件[21].从图4a、b可以看出，当提

取温度保持不变时，玛咖多糖提取率随提取时间的升高而增大，曲面的斜率较大.

当提取时间保持不变时，多糖提取率随提取温度的升高变化不明显，曲面斜率相对

较小.说明提取时间对玛咖多糖提取率的影响较为显著.从图4c、d可以看出提取温

度与料液比交互作用形成的曲面最陡，说明对多糖提取率的影响最显著.从图4e、f

可以看出提取时间与料液比的交互作用对多糖提取率的影响较弱[23-24].

2.7 验证实验

通过Box-Behnken软件求解回归方程，得到玛咖多糖的最佳提取条件：提取温度

60 ℃，料液比(质量比)1∶20，提取时间51.95 min，在此条件下，多糖提取率的

理论值为15.831%.结合实际操作情况，对实验条件进行一定的修改，在60 ℃、

1∶20(质量比)的料液比、提取时间52 min条件下，实验结果如表8所示.

结果表明，软件的预测值为15.831%，在提取温度为60 ℃，料液比(质量

比)1∶20，提取时间为52 min的实际操作条件下，测得玛咖多糖提取率为

15.732%.实验值与理论预测值十分接近，说明了该模型在实际预测上的可用性，

可以利用响应曲面法优化玛咖多糖的提取条件.

通过单因素实验考察了温度、料液比、超声时间对玛咖多糖提取率的影响，在此基

础上采用响应面分析法对提取工艺进行优化，建立了回归数学模型.通过模型，得

到最佳提取条件为温度60 ℃、料液比(质量比) 1∶20、超声时间 51.95 min，在

此条件下预测玛咖多糖提取率为15.831%.经过实验验证，该条件下的多糖的提取

率达到15.732%，与预测值基本一致，优化效果明显，为玛咖多糖的提取提供实

验基础.

E-mail：*******************

【相关文献】

[1] 张永忠.玛咖对更年期综合征及骨质疏松的实验研究[D].武汉:华中科技大学,2006.

ZHANG Y Z .Experimental study of maca(Lepidium Meyenii Walp.)on menopau

syndrome and osteoporosis[D].Wuhan:Huazhong University of Science and

Technology,2006.

[2] 孙友平.玛咖引种栽培基础研究[D].武汉:华中科技大学,2004.

SUN Y y studies on cultivation of Lepidium meyenii[D].Wuhan:Huazhong

University of Science and Technology,2004.

[3] 肖伟,彭勇,许利嘉,等.秘鲁特产药用植物玛咖研究的新进展[J].世界科学技术,2007,9(3):102-

104.

XIAO W,PENG Y,XU L J,et advances in study of peruvian Lepidium meyenii

(maca)[J].World Science and Technology,2007,9(3):102-104.

[4] 柳志宇.玛咖多糖的提取及其单糖组成的研究[D].北京:北京林业大学,2012.

LIU Z ch in the extraction and monosaccharide composition of polysaccharide in

Maca[D].Beijing:Beijing Forestry University,2012.

[5] 金文闻.药食两用植物玛咖的功效物质研究[D].武汉：华中科技大学,2006.

JIN W on the functional factors of Lepidium Meyenii,a plant with medicine and

food characteristics[D].Wuhan:Huazhong University of Science and Technology,2006.

[6] 陈韩英,李元元,廉宜君,等.3种新疆特色植物药多糖对小鼠免疫功能影响的研究[J].时珍国医国

药,2011,22(9)::10.3969/.1008-0805.2011.09.083.

CHEN H Y,LI Y Y,LIAN Y J,et of polysaccharide of three Xinjiang herbal on immune

function in mice[J].Lishizhen Medicine and Materia Medica Rearch,2011,22(9):2226-

2227.

[7] 张媛,刘健.植物多糖生物活性的研究进展[J].天津药学,2010,22(2):62-64.

ZHANG Y,LIU es in the biological activity of plant polysaccharides[J].Tianjin

Pharmacy,2010,22(2):62-64.

[8] 李娜,杨晓杰,李旭业,等.植物多糖提取技术研究[J].高师理科学刊,2012,32(2):86-88.

LI N,YANG X J,LI X Y,et tion of plant polysaccharides[J].Journal of Science of

Teachers' College and University,2012,32(2):86-88.

[9] 孟宪云,邢连宗.茜草多糖的提取与分析[J].北京中医,2005,24(1):35-36.

MENG X Y,XING L tion and analysis of polysaccharides madder[J].Beijing Journal

of Traditional Chine Medicine,2005,24(1):35-36.

[10] 赵云平,高文远,方玲.知母多糖的提取及含量和抗氧化活性的测定[J].食品科

技,2011,36(9):210-212,218.

ZHAO Y P,GAO W Y,FANG extraction,determination and antioxidant activity of

anemarans[J].Food Science and Technology,2011,36(9):210-212,218.

[11] 胡灵,何晋浙,林炳谊,等.灵芝多糖微波辅助提取工艺及其模型的研究[J].浙江工业大学学

报,2011,39(2):140-145.

HU L，HE J Z,LIN B Y,et zation of microwave extraction technics of

polysaccharides from Ganaderma lucidum and its model[J].Journal of Zhejiang University

of Technology,2011,39(2):140-145.

[12] 江茂田,谢培山,王忠东.天然有机化合物提取分离与结构鉴定[M].北京:化学工业出版

社,2004:31-52.

JIANG M T,XIE P L,WANG Z D,et ion and structure identification of natural organic

compounds[M].Beijing:Chemical Industry Press,2004:31-52.

[13] 尹艳,高文宏,于淑娟.多糖提取技术的研究进展[J].食品工业科技,2007(02):248-249.

YIN Y,GAO W H,YU S es in polysaccharide extraction technology[J].Science and

Technology of Food Industry,2007(02):248-249.

[14] 郭黎平,傅冬梅,张卓勇,等.双水相萃取技术的研究进展[J].东北师范大学报(自然科学

版),2000,32(3):34-38.

GUO L P，FU D M,ZHANG Z Y,et pment of aqueous two-pha system

technique[J].Journal of Northeast Normal University(Natural Science

edition),2000,32(3):34-38.

[15] 林东强,朱自强,姚善泾,等.生化分离过程的新探索-双水相分配与相关技术的集成[J].化工学

报,2000,51(1):1-6.

LIN D Q,ZHU Z Q,YAO S J,et technology in bioparation process-integration of

aqueous two-pha partitioning with related techniques[J].Journal of chemical industry

and engineering,2000,51(1):1-6.

[16] 吴有炜.试验设计与数据处理[M].苏州:苏州大学出版社,2002:135-142.

WU Y mental design and data processing[M].Suzhou:Suzhou University

Press,2002:135-142.

[17] 张青,张天民.苯酚-硫酸比色法测定多糖含量[J].山东食品科技,2004,13(7):17-18.

ZHANG Q,ZHANG T ination of polysaccharide by phenol-sulfuric acid

colorimetry[J].Shandong Science and Technology of Food,2004,13(7):17-18.

[18] 刑健敏,李芬芳,梁逸曾,等.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系提取分离芦荟多糖及含量的测定[J].中

国药学杂志,2007,42(7):541-543.

XING J M,LI F F,LIANG Y Z,et ination and extraction of aloe polysaccharides by

polyethylene glycol/(NH4)2SO4 two pha system[J].Chine pharmaceutical

journal,2007,42(7):541-543.

[19] 陈燕青,陈思浩,丁德润.玛咖多糖含量的测定[J].食品科技,2007,32(2):231-233.

CHEN Y Q,CHEN S H,DING D ination of polysaccharide in maca[J].Food Science

and Technology,2007,32(2):231-233.

[20] 向昌国,向宁,黄成龙,等.响应面法优化刺槐花黄酮类化合物的微波提取工艺[J].食品科

学,2011,32(22):32-36.

XIANG C G,XIANG N,HUANG C L,et zation of microwave extraction of flavonoids

from robinia pudoacacia L. flowers using respon surface methodology[J].Food

Science,2011,32(22):32-36.

[21] 周晓明,闫鹏,马凯,等.响应面法优化超声波辅助提取玛咖总黄酮的工艺研究[J].新疆农业科

学,2012,49(8):1414-1420.

ZHOU X M,YAN P,MA K,et zation of ultrasonic-assisted extraction of flavonoids

from maca by respon surface methodology[J].Xinjiang Agricultural

Sciences,2012,49(8)::10.6048/.1001-4330.2012.08.007.

[22] 徐春明,李婷,王英英,等.响应曲面法优化微波辅助双水相提取苦荞麦麸皮中黄酮类化合物的工

艺研究[J].中国食品添加剂,2014(02):80-86.

XU C M,LI T,WANG Y Y,et zation of microwave- assisted extraction process for

total flavonoid from buckwheat bran by respon surface analysis[J].China Food

Additives,2014(02):80-86.

[23] SUN Y X,LI T B,LIU J logy optimization for polysaccharides extraction from

the fruiting bodies of Pleurotus ostreatus by Box-Behnken statistical design[J].Carbohydr

Polym,2010(82):242-247.

[24] YIN G,DANG zation of extraction technology of the Lycium barbarum

polysaccharides by Box-Behnken statistical design[J].Carbohydr Polym,2008(74):603-610.