敲低胎盘特异性蛋白8(PLAC8)抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡_

2024年3月17日发(作者：唐雪利)

细胞与分子免疫学杂志

(

Chin

J

Cell

Mol

Immunol)2020,

36(12)

1089

•论著

•

文章编号

：

1007

-

8738

(

2020)12

-1089

-06

敲低胎盘特异性蛋白

8(PLAC8)

抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡

李如梅

"2,

李敏

2,

陈蕾

Z

**

('安徽医科大学海军临床学院妇产科

，

安徽合肥

230032

；

'

解放军总医院第六医学中心妇产科

，

北京

100048)

［

摘要

］

目的

探讨胎盘特异性蛋白

8(PLAC8)

对人胚胎干细胞

(hESC)

增殖和凋亡的影响

。

方法

实时荧光定量

PCR

和

Western

blot

法检测空载体组

、

PLAC8

短发夹

RNA(shPLAC8)

组

、

过表达

PLAC8(PLAC8-OE)

组感染

hESC

的效率

；

以及各组细

胞增殖细胞核抗原

(PCNA)

和细胞周期蛋白

Dl(CCNDl)

的

mRNA

和蛋白水平

。

流式细胞术检测敲低和过表达

PLAC8

对

hESC

凋亡的影响

。

结果

PLAC8

敲低组的

CCND1

、

PCNA

的

mRNA

和蛋白水平降低

，

细胞凋亡增加

；

PLAC8

过表达组

CCND1

和

PCNA

的

mRNA

和蛋白表达略上调

，

细胞凋亡略有下降，但差异均无统计学意义

。

结论

敲低

PLAC8

的表达会抑制

hESC

增殖

并促进其凋亡

。

［

关键词

］

人胚胎干细胞

(hESC)

；

胎盘特异性蛋白

8(PLAC8)

；

细胞增殖

；

细胞凋亡

［

中图分类号

］

R392-33,

Q813.7,

Q25

［

文献标志码

］

A

体外受精-胚胎移植

(in

vitro

fertilization-embryo

transfer,

IVF-ET

)

是现代最常用的辅助生殖技术

(

assisted

reproductive

technology

,

ART)

,

其诞生至今

调

，

在其他组织中下调

。

同时将

PLAC8

过表达

mRNA

注射到斑马鱼受精的原核胚胎中

，

随着胚胎

的慢慢发育

，

过表达

PLAC8

的胚胎表现出背侧

、

弯

经历了飞速的发展

，

为广大不孕不育患者带来了福

曲和缩短的体轴

，

一小部分表现出不同程度的独眼

音⑴

。

然而近

20

多年来其胚胎发育与种植率一直处

于较低水平⑵

。

因此深入研究胚胎发育机制是目前

生殖领域研究的热点和难点

。

近年来对胚胎发育的

畸形

，

表明

PLAC8

在胚胎正常发育中起重要作用⑼

。

还有研究发现

PLAC8

对在发育中的肾脏和咽弓的表

达至关重要

〔

问

。

有研究报道

PLAC8

可能是牛胚胎

研究不仅局限于胚胎培养环境的调节⑶

，

还有在表

观遗传学和分子信号通路等进行深入的研究

“

勺

。

着床过程中的关键分子

，

可作为生物标志分子之一

预测牛的妊娠结局⑴)

。

还有报道孤雌激活的牛胚可

胎盘特异

性蛋白

8

(

placenta-specific

protein

8

,

PLAC8)

是一种相对分子质量

(

M

”

)

为

12

500

的小蛋

以发育至妊娠

35

d

［

12

］

,

Abdoon

等

〔

⑶研究孤雌激活

的牛胚胎

，

发育速度比正常受精胚胎迟缓

，

检测到

孤雌激活的牛胚

PLAC8

的表达低于正常受精牛

白

，

PLAC8

基因富含半胱氨酸结构

，

没有信号肽

，

且

大多数的半胱氨酸都来自

CXXC

的结构

，

包含了

3

~

4

个分子内二硫键

，

是结合其基底物的特殊位点

，

与

胚

，

推测

PLAC8

低表达可能是其发育缓慢的原因

之一

。

Li

等

〔

⑷收集临床废弃的卵母细胞

，

免疫荧

光组织化学染色检测发现在植入前胚胎均发现

PLAC8

蛋白的表达

。

我们前期研究利用慢病毒

氧化还原相关的蛋白形成有关⑹

。

PLAC8

首次在小

鼠的胎盘中发现之后

，

在胚胎

、

肺

、

肠道

、

脂肪

、

巨

噬细胞和中性粒细胞中均发现有高表达

。

PLAC8

在

多种恶性肿瘤细胞中也有较高表达

，

并参与其细胞

PLAC8

干扰载体感染人类早期胚胎

，

发现敲低胚

胎

PLAC8

表达

，

早期胚胎的卵裂率有所下降(未

的增殖和分化

［

7

-

81

o

同时在很多物种的早期胚胎发

育中可检测到

PLAC8

表达

。

有研究发现

PLAC8

与斑

马鱼的胚胎发育相关

，

在斑马鱼的母体和受精卵及

发表数据)

,

然而

PLAC8

对人胚胎发育具体的作

用机制仍然不明

。

本研究进一步利用细胞实验来

进行探讨

，

利用慢病毒载体对人胚胎干细胞

(

human

embryonic

stem

cells

,

hESC

)

进行敲低和过

胚胎的各个时期中均有

PLAC8

mRNA

的表达

，

到受

精后

4

d

在胚胎中均是全胚胎表达

，

之后在肠道中上

收稿日期

：

2020

-

03

-

06

；

接受日期

：

2020

-11

-03

表达来观察

PLAC8

对

hESC

的影响

。

基金项目

：

国家自然科学基金

(8170060984)

；

海军

“

十二五

”

项目

(

CHJ11J015)

作者简介

：李如梅

(

1994

-

),

女

，

安徽蚌埠人

，

医师

，

硕士研究生

Tel

：

188****1524

；

E-mail

：

1596876521

@

qq.

com

*

通讯作者

，

陈蕾

，

E-mail

:

3313400243

@

qq.

com

1090

细胞与分子免疫学杂志

(

Chin

J

Cell

Mol

Immunol

)

2020

,

36(12)

1

材料和方法

基在

37

七

、

50

mL/L

CO2

培养箱培养

。

以慢病毒感

1.1材料

hESC

是解放军总医院第六医学中心心内科实验

染复数

(

multiplicity

of

infection

,

MOI)

为

50

分别加入

含

EGFP

基因的

PLAC8

过表达载体

(

PLAC8

overexpression

,

PLAC8-OE)

、

shPLAC8

干扰载体和空

室赠与

，

HEK293T

细胞

、

pLPl

、

pLP2

、

pLP-VSVG

质

粒购自上海吉凯基因公司

；

TeSR-E8

培养基购自

Stem

Cell

公司

；

基质胶

(

Matrigel

)

购自

Coming

公司

；

载体

，

同时各组加入聚凝胺

(polybrene)

助染剂

，

在感

染了

12

h

后

，

换不含有病毒的

E8

培养基

。

继续培养

48

-72

h

后

，

观察

EGFP

荧光确定感染的效果

，

为了

兔抗

PLAC8

抗体

、

4',

6

-二眯基苯基

H

引嗥

(4

‘

，

6-diamidino-

2-phenylindole,

DAPI)

购自

Sigma

公司

；

兔抗

p

肌动

筛选稳定表达的细胞加入瞟吟霉素

(puromycin)

。

1.2.3

蛋白

(

p-actin)

抗体购自

Abeam

公司

；

辣根过氧化物

免疫荧光细胞化学染色检测

hESC

的

OCT4

、

酶标记的山羊抗兔二抗

、

二辛可宁酸

(

bicinchoninic

acid,

BCA)

蛋白质定量试剂盒购自碧云天生物技术

PLAC8

的表达

hESC

铺在

6

孔板上

，

用

TeSR-E8

培

养基在

37P

、

50

miyL

C0

2

培养箱培养，

待细胞长满

后

，

40

g/L

多聚甲醛常温固定

10

min,

PBS

洗

3

次

，

5

mL/L

Triton-X

100

通透

5

min,

10

g/L

BSA

2

mL/L

Triton

X-100

封闭

30

min

；

加兔抗

PLAC8

抗

有限公司

；

兔抗增殖细胞核抗原

(

proliferating

cell

nuclear

antigen

,

PCNA)

抗体

、

兔抗细胞周期蛋白

D1

(cyclin

DI,

CCND1)

抗体

、

兔抗丿

l

聚体结合转录因子

4

(

octamer-binding

transcription

factor

4

,

OCT4

)

购自

Cell

Signaling

Technology

公司

；

Alexa

Fluor®

594

标记

体

(

1

：

1000)

、

兔抗

OCT4

抗体

(1

：

400),

4T

孵育过

夜

；

PBS

洗

3

次

，

Alexa

Fluor®

594

标记的山羊抗兔

IgG(

1

：

10

000),

常温避光孵育

1

h

；

PBS

洗

3

次,用

的山羊抗兔

IgG

购自

Life

Technology

公司

；

Alexa

Fluor®

647

标记的膜联素

V/

碘化丙曉

(

annexin

V-

1

：

1

稀释

DAPI

染细胞核

10

min,

荧光显微镜观察

。

Alexa

Fluor®

647/

propidium

iodide

,

annexin

V

-FITC/

PI)

细胞凋亡检测试剂盒购自北京金普来生物科技有

1.2.4

实时荧光定量

PCR

检测感染慢病毒后

hESC

的

PLAC8

、

CCND1

、

PCNA

mRNA

水平

hESC

铺于

6

孔板

24

h

后

，

慢病毒感染

，

实验分成

3

组

：

空载体

限公司

；

Lipofectamine™

2000

、

牛血清白蛋白

(

bovine

rum

albumin,

BSA)

购自

Invitrogen

公司

；

反转录试

NC

组

、

shPLAC8

组和

PLAC8-0E

组

。

感染

12

h

后换

剂均购自南京诺维赞生物技术有限公司

；

SYBR®

Green

qPCR

Master

Mix

购自

Bio-Rad

公司

；

其他化学

液

,

48

h

后

TransZol

Up

RNA

试剂盒提取总

RNA,

UV-Vis

分光光度计测量

RNA

浓度

，

HiScript

反转录

试剂均是国产分析纯

；

CO?

孵箱购自赛默飞世尔科

为

cDNA,

采用实时荧光定量

PCR

检测感染后细胞

PLAC8

、

CCND1

、

PCNA

的

mRNA

相对表达量

。

PLAC8

上游引物为

5

，

-CTGTCTGTGTGGAACAAGC3,

下

技公司

；

倒置显微镜购自

Olympus

公司

；

化学发光

成像仪购自通用电气公司

；

流式细胞仪购自

Beckman

Coulter

有限公司

。

游引物为

5

，

-GAGGACAGCAAAGAGTTGCC-3，

；

CCND1

上游引物为

5

〔

TCCTCTCCAAAATGCCAGAG3

，

；

12

方法

1.2.

1

PLAC8

慢病毒载体的构建和包装

运用

pLPl

、

pLP2

、

pLP-VSVG

质粒按比例混合成包装质粒

下游引物为

5

，

-GGCGGATTGGAAATGAACTT3

；

PCNA

上游引物为

5

AGTGGAGAACTTGGAAATGG-3

f

,

再加入含有目的基因序列的骨架质粒

，

目的基因插

入含有增强型绿色荧光蛋白

(

enhanced

green

fluorescent

protein

,

EGFP

)

和瞟吟霉素的筛选片段

。

下游引物为

5

，

-CTCTATGGTAACAGCTTCCTC-3

，

；

GAPDH

上游引物为

5

，

-AGCCTCAAGATCATCAG-

CAATGCC-3

,

,

下游引物为

5

^TGTGGTCATGAGTCCT-

TCCACGAT-S^

每个反应体系

10

|

jl

L,

包括

cDNA

人

PLAC8

短发夹

RNA(

short

hairpin

RNA

of

PLAC8

,

shPLACS

)

表达慢病毒载体由上海吉凯公司根据提供

1

|iL,

上下游各

0.5

piL,

ddH

2

O

3

p,L,

SYBR®

Green

qPCR

Master

Mix

5

jjl

L

。

PCR

扩增条件

95

P

30

s,

95

七

5

s,

60

*

5

s,

共

42

个循环

，

72T

15

s

。

GAPDH

的两条不同靶标序列克隆

，

利用的质粒骨架是

GV493

。

两条

shPLAC8

的靶标序列分别为

5

，

-GGTG-

GTCGTTGTGACCCAACCTGGA-3

7

和

5'-CAAATCAA-

GAGAGATATCAACAGAA-3'

。

慢病毒包装在

HEK293T

工具细胞中进行

。

质粒转染是利用

作为内参

，

△&=&(

实验组-内参

)

，

实验重复

3

次,

用

2-

“

a

计算

。

1.2.5

Western

blot

法检测感染慢病毒后

hESC

的

Lipofectamine

IM

2000

进行

,

并进行病毒浓缩

，

得到

10

8

数量级滴度的病毒

，

于

-80

七冰箱保存

。

PLAC8

、

PCNA

、

CCND1

蛋白的表达

将

hESC

铺于

6

孔板

，

25x10°

个

/

孔

。

24

h

后

，

进行慢病毒感染

，

1.2.2

细胞培养及感染

hESC

在培养前需要用基

实验分为空载体阴性对照

(

negative

control

,

NC)

组

、

shPLAC8

组和

PLAC8-OE

组

。

感染

12

h

后换液

，

72

h

质胶提前包被皿底约

1

~2

h

左右

，

用

TeSR-E8

培养

12

期

李如梅

，

等.敲低胎盘特异性蛋白

8

（

PLAC8

）

抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡

1091

后提蛋白

。

把慢病毒感染后细胞刮下来后加上裂解

2.2

构建敲减和过表达

PLAC8

的

hESC

液提取细胞的总蛋白

，

用

BCA

试剂盒检测蛋白的浓

度

。

加上样缓冲液

，

100

*

煮

10

min

0

用

120

g/L

SDS-PAGE,

每孔加入

30

~40

憾

蛋白

，

恒压

80

V

30

min,

100

V

90

min；

PVDF

转膜恒流

0.25

A

90

min

；

用

PLAC8

空载体

、

干扰载体

、

过表达载体转染

细胞后培养

72

h,

然后用

2

Qg/mL

瞟吟霉素筛选获

得稳定表达的细胞株

。

病毒感染

72

h

后

，

观察到空

载体组

、

shPLAC8

干扰组

、

PLAC8-OE

组均有

EGFP

在

TBS

中平衡

3

次后放入

50

g/L

BSA

中封闭

1

h,

加

表达

（

图

2A

）,

感染效率约

60%

左右

，

表明含有

EGFP

的目的基因载体成功进入

hESC

中

。

采用实时荧光

定量

PCR

检测和

Western

blot

法检测各组细胞

PLAC8

mRNA

和蛋白的表达，

结果发现

，

与空载体组

兔抗

PLAC8

抗体

（

1

：

300

）

、

兔抗

PCNA

抗体

（

1

：

500

）

、

兔抗

CCND1

抗体

（

1

：

500

）

、

兔抗

p-actin

抗体

（

1:1000

）

,

4

七孵育过夜

；

TBST

洗膜

5

minx

3

次

，

加

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗

（

1

：10

000

）

,

室

温旋转摇动孵育

1

h

；

TBST

洗膜

5

min

x

3

次

，

ECL

发光液和稳定液

1

：

1

混合发光显影

。

图像用

Image

J

软件分析

，

测定蛋白条带的吸光度

（

A

）

值

，

以

A

目的白

/A

”

“

m

的比值计算目的蛋白的相对表达水平

。

1.2.6

流式细胞术检测细胞凋亡

细胞分组与处理

相比

，

PLAC8-0E

组的

PLAC8

mRNA

和蛋白水平明

显增加

，

shPLAC8

干扰组的

PLAC8

mRNA

和蛋白水

平明显降低

（

P<0.05,

图

2B

、

C

）

。

说明成功建立了

过表达或敲减

PLAC8

的

hESC

o

同上

，

加入预冷

PBS

充分洗涤

2

次

；

加入结合缓冲液

把细胞调节到一定数量后

，

取

100

mL

左右的悬液进

行检测

，

加入

5

jxL

annexin

V

-Alexa

Fluor®

647

,

遮

光染色

5

min

；

加入

PI

和

400

pL

PBS,

上机

1

h,

数

B

据用

FLOW

JO

分析

。

1.2.7

统计学分析数据均采用

SPSS2

1

软件进行

字

垛

耳

4

统计分析

，

实验中的图均利用

Graphpad

Prism

绘制,

V

N

H

E

数据用孑士

s

表示

，

P<0.05

为差异有统计学意义

。

2

结果

2.1

hESC

表达

OCT4

和

PLAC8

oo

u

V

J

d

12

13

B3S

A

：

hESC

的

EGFP

表达

（

荧光显微镜

，

x200

）

；

B

：

实时定量

PCR

检测

hESC

的

PLAC8

mRNA

水平

；

C

：

Western

blot

法检测

hESC

的

PLAC8

>

采用免疫荧光细胞化学染色技术检测特异性

0CT4

和

PLAC8

的分布

，

结果发现

OCT4

在

hESC

中

广泛分布

（

图

1A

）

,

表明

hESC

多能性良好

，

可用后

续实验

。

PLAC8

在

hESC

的细胞质中分布

，

细胞核中

有少量

PLAC8

（

图

IB

）

,

这与

PLAC8

在胚胎细胞中的

分布是一致的剧

。

A

OAPI

OCT4

自表达.

1：

空载体组

；

2：

shPLAC8

组

；

3

：

PLAC8-0E

组.

"P<0.05

vs

1.

图

2

感染不同慢病毒载体

hESC

的

PLAC8

mRNA

和蛋白

DAPI/OCT4

表达

2.

3

敲低

PLAC8

表达降低

hESC

的

CCND1

、

PCNA

mRNA

水平

hESC

感染成功后检测各组增殖相关基因的表达

DAPI

PLAC8

1

）

八

PI/PLAC8

情况

，

与空载体组相比

，

shPLAC8

组的

CCND1

和

PCNA

的

m

RNA

水平明显降低

（

P<0.05,

图

3

）

。

但

PLAC8-0E

组的

CCND1

和

PCNA

mRNA

略有升高,

但差异无统计学意义

（

P>0.05,

图

3

）

。

A

：

OCT4

的表达

；

B

：

PLAC8

的表达.

2.

4

敲低

PLAC8

表达降低

hESC

的

CCND1

、

图

1

OCT4

和

PLAC8

在

hESC

的表达

（

免疫荧光细胞化学染

色，

x400）

PCNA

蛋白水平

hESC

感染慢病毒成功后

，

采用

Western

blot

1092

细胞与分子免疫学杂志

(

Chin

J

Cell

Mol

Immunol

)

2020

,

36(

12)

A

E

0

卜

^

Q5-1

^

1.02%

3

比

Q5-2

1.31%

Q5-1

1.87%

法检测各组

hESC

增殖相关的蛋白

CCNDI

、

PCNA

的表达情况

。

与空载体组相比

，

shPLAC8

组的

CCNDI

、

PCNA

蛋白水平降低

，

差异有统计学意义

2

^

七

运

屯

一

€

一

工

1

(P<0.05,

图

4)

。

但

PLAC8-OE

组的

CCND1

和

2

94.42%

Q5-4

3.25%

PCNA

蛋白表达略有增高

，

但差异无统计学意义

(P>0.05,

图

4)

。

酯

盘

臺

loho^io

3

1(^10

5

1(^

io

7

Q5-3

85.89%

4

£

0

Q5-4

&15%

一

怙

一

2

io1

io

2

io

3

io

4

io

5

10^

io

7

1

Annexin

V-Alexa

Fluor®

647

(

％

)

□

CCNDI

B

PCNA

工

10

a

工

1

:

空载体组

；2

：

shPLAC8

组

；

3

：

PLAC8-OE

组

.

*P<0.05

vs

1.

图

3

实时定量

PCR

检测

hESC

的

CCNDI

、

PCNA

mRNA

水平

A

CCNDI

1

V

N

H

E

V

N

o

d

n

艾

G

5

-二

N

O

0

CJ

1

2

3

A

：

流式细胞术检测

hESC

的凋亡

；B

：

凋亡早期和凋亡晚期细胞数百

分比

.1

：

空载体组

；

2：

shPLAC8

纽

；3

：

PLAC8-OE

组

•

a

PvO.O5usl.

图

5

流式细胞术检测

hESC

的凋亡情况

2

I

3

3

讨论

研究发现

PLAC8

与细胞增殖

、

分化和凋亡有关

。

B

喇

岀

卅

圧

嘲

浜

冬

PLAC8

在多种肿瘤细胞均有表达

，

参与细胞的增殖

□

CCNDI

B

PCNA

和凋亡的过程

，

PLAC8

表达增加与肿瘤细胞增殖

、

T

生长和转移相关

。

Mao

等

［

⑸发现

PLAC8

可通过激活

核因子

k

B/

磷脂酰肌醇

3

激酶

/

蛋白激酶

B

(

nuclear

factor

k

B/

phosphatidylinositol

-3

kina/protein

kina

B,

NF-

k

B/PI3K/AKT)

通路抑制乳腺癌细胞

V

N

d

^

-

a

N

o

o

凋亡

。

Kaistha

等皿发现

PLAC8

定位于胰腺癌细胞

的内侧质膜

，

通过关键的细胞周期调控通路调控细

A

：

Western

blot

法检测

hESC

的

CCNDI

和

PCNA

蛋白表达

；

B

：

hESC

的

CCND1

和PCNA蛋白水平的半定量分析

.1

：

空载体组

；

2

：

shPLAC8

胞生长和疾病进展

。

Zeng

等发现

PLAC8

可通过

激活胞外信号调节激酶

(

extracellular

signal-regulated

kina,

ERK

)

信号通路促进肺腺癌细胞的增殖

。

Huang

等

〔

阁发现敲除

PLAC8

可通过

AKT/

哺乳动物

组

；

3

：

PLAC8-OE

组

.

唧<

0.05

us

1.

图

4

Western

blot

法检测

hESC

的

CCNDI

和

PCNA

蛋白表达

2.5

敲低

PLAC8

表达促进

hESC

凋亡

hESC

经过感染特异性目的基因的慢病毒载体,

雷帕霉素靶蛋白

(

mammalian

target

of

rapamycin,

mTOR)

途径诱导自噬

，

从而抑制细胞增殖和上皮间

并经过筛选获得稳定细胞后

，

流式细胞术检测敲低

和过表达

PLAC8

后对细胞凋亡的影响

。

空载体组

、

shPLAC8

组和

PLAC8-OE

组的细胞凋亡百分比分别

质转化

，

促进鼻咽癌细胞凋亡

。

Shi

等问发现

PLAC8

的表达与透明细胞肾细胞癌的肿瘤大小

、

转

移及临床分期呈正相关

，

敲低

PLAC8

的表达可显著

减少肾细胞癌的增殖和侵袭

。

同时

Tatura

等血

〕

报道

PLAC8

在大多数分化良好的人胰腺神经内分泌肿瘤

(

pancreatic

neuroendocrine

tumors

,

PanNET

)

中

表达,

是

(4.58

±0.

83)%

、

(12.

60

±

1.

12)%

、

(3.

57

±

0.70)%

。

shPLACS

组与空载体组相比

，

细胞凋亡

率增高约

3

倍左右

，

而

PLAC8-OE

组细胞凋亡率与

空载体组相比变化不明显

，

差异无统计学意义

(P>0.05,

图

5)

。

考虑

PLAC8

敲低后细胞增殖下

通过小干涉

RNA(

small

interfering

RNA

,

siRNA)

介导

调可能与细胞凋亡有关

。

下调

PanNET

细胞中

PLAC8

的表达

，

可以降低细胞

12

期

李如梅

，

等.敲低胎盘特异性蛋白

8(PLAC8)

抑制人胚胎干细胞增殖并促进其凋亡

1093

的增殖能力和生存能力

。

Qin

等

0

〕

建立

PLAC8

敲除

HEK293T

细胞系

，

发现

PLAC8

敲除可以降低细胞增

殖

，

并且

PLAC8

敲除对细胞增殖的抑制作用与细胞

周期进程中的

G2/M

阻滞有关

。

Zhang

等切发现

PLAC8

是转移性骨肉瘤中上调的基因之一

，

研究发

现

PLAC8

过表达增强骨肉瘤细胞的增殖

、

克隆形成

率

、

侵袭和迁移

；

PLAC8

过表达诱导

CXC

趋化因子

配体

5(

C-X-C

motif

chemokine

ligand

5

,

CXCL5

)

的上

调

，

导致

ERK

磷酸化增加

，

从而导致更具侵袭性的

骨肉瘤转移表型的发生

。

从这些研究结果可以看出

PLAC8

在不同的肿瘤细胞中通过调控不同的信号通

路来影响细胞的增殖和凋亡

。

本研究利用构建的

PLAC8

敲低和过表达慢病毒

载体感染

hESC

进一步探讨

PLAC8

对胚胎发育的具

体作用机制

，

其中免疫荧光实验发现

PLAC8

在

hESC

有表达

，

主要分布在细胞质；

Yan

等匚

］

通过人类围

种植期胚胎单细胞

RNA

测序的研究也在

hESC

发现

PLAC8

的表达

，

但个体细胞之间也存在差异

。

我们

的实验发现通过下调

hESC

PLAC8

基因的表达会降

低细胞的增殖并促进其凋亡

，

这与

PLAC8

在各种癌

症中的作用机制是相符的

［

19-211

o

而过表达

hESC

PLAC8

基因后没有显著促进细胞增殖和抑制凋亡

，

考虑

hESC

是从早期胚胎或原始性腺中分离出来的

一类细胞

，

具有无限增殖

、

自我更新和多向分化潜

能

「

⑷

，

能释放大量的细胞保护性抗凋亡因子

，

例如

鞘氨醇

-1

■磷酸

(

sphingosine-1

-phosphate

,

SIP

)

介导

hESC

凋亡和增殖

〔

旳

，

Tavakoli

等皿发现胚胎干细胞

可通过释放外泌体来抑制炎症和细胞的凋亡

。

考虑

胚胎干细胞的抗凋亡因子趋于饱和

，所以尽管增加

胚胎干细胞

PLAC8

基因的表达

，

也无法显著降低细

胞的凋亡率

。

综上所述

，

敲低

hESC

PLAC8

基因的表达会降低

细胞的增殖并促进凋亡

。

考虑

PLAC8

可能是通过调

控细胞的增殖和凋亡来影响胚胎的发育

。

有研究发

现一些基因相关的凋亡和增殖机制在人和动物卵母

细胞和早期胚胎中均有表达

，

在哺乳动物胚胎着床

前的发育过程中细胞的增殖和凋亡信号发挥重要的

作用⑵

］。

PLAC8

与胚胎发育过程有关

，

可作为预测

胚胎发育状态的一个预测指标

。

实验结果为继续研

究

PLAC8

对胚胎发育的影响提供了一个思路

。

参考文献

：

［

1

］

Zhang

T

,

Chen

X

,

Wang

C

C

,

et

al

.

Intrauterine

infusion

of

human

chorionic

gonadotropin

before

embryo

transfer

in

IVF/ET

cycle

:

The

critical

review

[

J/OL ]

.

Am

J

Reprod

Immunol

,

2019

,

81

(

2

)

：

el3077.

DOI

：

10. 1111/aji.

13077.

Epub

2019

Jan

23.

[2]

Op0ien

H

K,

Fedorcsak

P,

Omland

A

K,

et

al.

In

vitro

fertilization

is

a

successful

treatment

in

endometriosis-associated

infertility

[

J

]

.

Fertil

Steril,

2012,

97(4)

:

912

-918.

[3]

StSepetova

J

,

Baranova

J,

Simm

J

,

et

al.

The

complex

microbiome

from

native

men

to

embryo

culture

environment

in

human

in

vitro

fertilization

procedure

[

J/OL

]

.

Reprod

Biol

Endocrinol

,

2020

,

18(1)

：

3.

DOI

：

10.

U86/sl2958

-019

-0562

-z.

[4]

Balasubramanian

S,

Raghunath

A,

Perumal

E.

Role

of

epigenetics

in

zebrafish

development

[

J/OL

].

Gene,

2019

,

18

:

144049.

DOI

：

10.

1016/j.

gene.

2019.

144049.

Epub

2019

Aug

17.

[5]

Kim

E

H,

Kim

G

A,

Taweechaipaisankul

A,

et

al.

Melatonin

enhances

porcine

embryo

development

via

the

Nr£2/ARE

signaling

pathway

[

J

]

.

J

Mol

Endocrinol

,

2019

,

63(3)

:

175

-185.

[6]

Galaviz-Hernandez

C

,

Stagg

C,

de

Ridder

G,

et

al.

Plac8

and

Plac9

,

novel

placental-enriched

genes

identified

through

microarray

analysis

[

J

]

.

Gene

,

2003

,

309(2)

:

81

-

89.

[7]

Zou

L,

Chai

J,

Gao

Y

,

et

al.

Down-regulated

PLAC8

promotes

hepatocellular

carcinoma

cell

proliferation

by

enhancing

PI3K/AKT/

GSK3

p/Wnt/

p-catenin

signaling

[

J

]

.

Biomed

Pharmacother

,

2016

,

84

：

139

-146.

[8]

Jia

Y

,

Ying

X,

Zhou

J,

et

al.

The

novel

KLF4/PLAC8

signaling

pathway

regulates

lung

cancer

growth

[

J/OL

]

.

Cell

Death

Dis,

2018,

9(6)

:

603.

DOI

：

10.

1038/s41419

-018

-0580

-3.

[9]

Li

C,

Ma

H

,

Wang

Y,

et

al.

Excess

PLAC8

promotes

an

unconventional

ERK2-dependent

EMT

in

colon

cancer

[

J

]

.

J

Clin

Invest

,

2014

,

124(5)

:

2172 -2187.

[10]

Bedell

V

M

,

Person

A

D,

Larson

J

D,

et

al.

The

lineage-specific

gene

ponzrl

is

esntial

for

zebrafish

pronephric

and

pharyngeal

arch

development

[

J]

.

Development

,

2012,

139(4)

:

793

-

804.

[11

]

Ghanem

N

,

Salilew-Wondim

D

,

Gad

A,

et

al. Bovine

blastocysts

with

developmental

competence

to

term

share

similar

expression

of

developmentally

important

genes

although

derived

from

different

culture

environments

[

J

]

.

Reproduction

,

2011

,

142(4)

:

551

-

564.

[12]

Camargo

L

S

A,

Costa

F

Q,

Munk

M

,

et

al.

Contrasting

effects

of

heat

shock

during

in

vitro

maturation

on

development

of

in

vitro

-

fertilized

and

parthenogenetic

bovine

embryos

[

J

]

.

Reprod

Domest

Anim,

2019,

54(10)

:

1357

-1365.

[13

]

Abdoon

A

S,

Ghanem

N,

Kandil

0

M,

et

al.

cDNA

microarray

analysis

of

gene

expression

in

parthenotes

and

in

vitro

produced

buffalo

embryos

[

J

]

.

Theriogenology

,

2012

,

77(6)

:

1240

-

1251.

[14]

Li

M

,

Liu

D,

Wang

L,

et

al.

Expression

of

placenta-specific

8

in

human

oocytes

,

embryos

,

and

models

of

in

vitro

implantation

[

J

]

.

Fertil

Steril,

2016,

106

(

3

)

：

781

-

789.

e2.

DOI

：

10.

1016/

j.

fertnstert.

2016.05.018.

Epub

2016

Jun

17.

[15

]

Mao

M

,

Chen

Y,

Jia

Y,

et

al.

PLCA8

suppress

breast

cancer

1094

apoptosis

by

activating

the

PI3k/AKT/NF-KB

pathway

[

J

]

.

J

Cell

Mol

Med,

2019,

23(10)

:

6930

-6941.

[16]

Kaistha

B

P,

Lorenz

H

,

Schmidt

H

,

et

al.

PLAC8

localizes

to

the

细胞与分子免疫学杂志

(

Chin

J

Cell

Mol

Immunol

)

2020

,

36(12)

kidney

293

T

cell

[

J

].

Cell

Biochem

Biophys

,

2020,

78

(

1

)

：

55

-64.

[22]

Zhang

Y,

Hu

Q,

Li

G,

et

al.

ONZIN

upregulation

by

mutant

p53

contributes

to

osteosarcoma

metastasis

through

the

CXCL5-MAPK

inner

plasma

membrane

of

pancreatic

cancer

cells

and

regulates

cell

growth

and

dia

progression

through

critical

cell-cycle

regulatory

pathways

[

J

]

.

Cancer

Res,

2016

,

76(

1

)

:

96

-

107.

signaling

pathway

[

J

].

Cell

Physiol

Biochem

,

2018

,

48

(

3

)

：

1099

-1111.

[17]

Zeng

X,

Liu

Q,

Yang

Y,

et

al.

Placenta-specific

protein

8

promotes

the

proliferation

of

lung

adenocarcinoma

PC

-9

cells

and

their

[23]

Yan

L,

Yang

M,

Guo

H

,

et

al.

Single-cell

RNA-Seq

profiEng

of

human

preimplantation

embryos

and

embryonic

stem

cells

[

J

]

.

Nat

Struct

Mol

Biol,

2013,

20(9)

:

1131

-nce

to

an

epidermal

growth

factor

receptor

tyrosine

kina

inhibitor

by

activating

the

ERK

signaling

pathway

[J]

.

Oncol

Lett

,

2019,

18(5)

:

5621

-5627.

[24]

Wang

D,

Bu

F,

Zhang

W.

The

role

of

ubiquitination

in

regulating

embryonic

stem

cell

maintenance

and

cancer

development

[

J/OL

]

.

Int

J

Mol

Sci,

2019,

20

(

11

)

：

2667.

DOI

：

10.

3390/

[18]

Huang

M

L,

Qi

C

L,

Zou

Y,

et

al.

PLAC8-mediated

autophagy

regulates

nasopharyngeal

carcinoma

cell

function

via

AKT/mTOR

pathway

ijms20

112667.

[25

]

Inniss

K,

Moore

H.

Mediation

of

apoptosis

and

proliferation

of

human

[J].

J

CeU

Mol

Med,

2020,

24(14)

:

7778

-7788.

[19]

Shi

L,

Xiao

L,

Heng

B,

et

al.

Overexpression

of

placenta

specific

8

embryonic

stem

cells

by

sphingosine-1

-phosphate

[

J

].

Stem

Cells

Dev,

2006,

15(6)

:

789

-796.

is

associated

with

malignant

progression

and

poor

prognosis

of

clear

cell

renal

cell

carcinoma

[

J

]

.

Int

Urol

Nephrol

,

2017

,

49

(

7

)

：

[26]

Tavakoli

Dargani

Z,

Singla

R,

Johnson

T,

et

al.

Exosomes

derived

from

embryonic

stem

cells

inhibit

doxorubicin

and

inflammation-induced

pyroptosis

in

muscle

cells

[

J

]

.

Can

J

Physiol

Pharmacol

,

1165

-1176.

[20]

Tatura

M,

Schmidt

H,

Haijat

M,

et

al.

Placenta-specific

8

is

overexpresd

and

regulates

cell

proliferation

in

low-grade

human

pancreatic

2018,

96(3)

:

304-307.

neuroendocrine

tumors

[J]

.

Neuroendocrinology

,

2020

,

110(

1/2)

:

23

-34.

[27]

Haouzi

D,

Boumela

I,

Chebli

K,

et

al.

Global

,

survival,

and

apoptotic

transcriptome

during

mou

and

human

early

embryonic

development

[21

]

Qin

X

H,

Wang

H

X,

Ma

L,

et

al.

Knockout

of

the

placenta

specific

8

[J/OL].

Biomed

Res

Int,

2018,

2018

：

5895628.

DOI

：

10.

1155/

gene

affects

the

proliferation

and

migration

of

human

embryonic

2018/5895628.

eCoUection

2018.

Knockdown

of

placental-specific

protein

8

(

PLAC8

)

inhibits

proliferation

and

promotes

apoptosis

of

human

embryonic

stem

cells

LI

Rumei

1'

2

,

LI

Min

2

,

CHEN

Lei1

'

2

*

1

Department

of

Obstetrics

and

Gynecology

,

Navy

Clinical

College

,

Anhui

Medical

University

,

Hefei

230032

；

2

Department

of

Obstetrics

and

Gynecology

,

Sixth

Medical

Center

of

PLA

General

Hospital

,

Beijing

100048

,

China

*

Corresponding

author

,

E-mail

:

3313400243

@

qq.

com

[

Abstract]

Objective

To

investigate

the

effect

of

placenta-specific

protein

8

(

PLAC8

)

on

the

proliferation

and

apoptosis

of

human

embryonic

stem

cells

(hESCs).

Methods

Real-time

quantitative

PCR

and

Western

blotting

were

ud

to

detect

the

infection

efficiency

of

hESCs

in

short

hairpin

RNA

negative

control

group,

short

hairpin

RNA

PLAC8

(

shPLAC8)

group,

and

PLAC8

over-expression

(

PLAC8-OE)

group.

The

mRNA

and

protein

levels

of

proliferation

cell

nuclear

antigen

(PCNA)

and

cyclin

DI

(

CCND1

)

in

each

group

were

also

detected

by

the

above

methods.

The

flow

cytometry

was

ud

to

test

the

effect

of

PLAC8

knockdown

or

over-expression

on

the

apoptosis

of

hESCs.

Results

The

mRNA

and

protein

levels

of

CCND1

and

PCNA

in

the

shPLACS

group

decread

,

and

cell

apoptosis

incread.

The

mRNA

and

protein

expression

of

CCND1

and

PCNA

in

the

PLAC8

over-expression

group

were

slightly

up-regulated,

while

the

apoptosis

was

slightly

down-regulated,

but

the

differenee

was

not

statistically

significant.

Conclusion

The

knockdown

of

PLAC8

expression

can

inhibit

the

proliferation

and

promote

the

apoptosis

of

hESCs.

[Key

words]

human

embryonic

stem

cells

(hESCs)

；

placenta

・

specific

protein

8

(

PLAC8

)

；

proliferation

；

apoptosis