2024年3月15日发(作者:踌躇)
生物实验室操作规范
IMB standardization office【IMB 5AB- IMBK 08- IMB 2C】
生物实验室操作规范
生物实验室规范
1. 进入实验室需要在实验室使用登记簿上登记,没有经过培训的人员不允许单独进
入细胞间;
2. 进第二间屋子换上门口拖鞋,外套脱下,换上白大褂;
3. 进细胞间,换上拖鞋,并换上相应的白大褂;
4. 放在实验室的任何化学药品需要贴上标签,写明试剂名称、联系方式,否则一律
垃圾处理;
5. 放入细胞间的物品需用酒精擦拭外包装。放入冰箱的物品外围需用酒精擦拭,然
后注明试剂名称、使用者,远离培养基;
6. 有毒、易挥发试剂在外间通风柜内操作;
7. 双手接触过任何未灭菌的东西后,都需用酒精消毒后才能接触灭菌的器具或试
剂;
8. 值班同学:晚上开紫外灯,早上关掉;垃圾箱满了倒掉;废液瓶满了,加入次氯
酸钠后倒掉;所有的仪器是否关闭;试剂是否收好;衣服、鞋子是否摆好。
生物实验室间使用要求
实验前的例行检查与消毒措施
1. 减压阀检查:减压阀是连接在CO
2
培养箱与CO
2
气瓶间的减压装置,用于将气瓶
内较高的压力降低至培养箱可以使用的压力。靠近气瓶的一级压力表盘指示气瓶
内气体压力,当该压力小于时,表明CO
2
气体不足,应及时购买气体。
远离气瓶的二级压力表盘指针应在之间,若超出此范围请根据箭头指示调节
旋钮(注意:a旋钮感觉越紧,阀门开口越大;b指针示数会因为培养箱对橡胶管
内气体的间断吸气而跳动,调节旋钮时注意延时因素,并将跳动范围控制到
间)。
2. CO
2
培养箱检查:温度显示应在(℃)之间,CO
2
浓度在(%)之间,
严禁私自改
变设置
。底部增湿盘中水量不足1/3,应及时添加无菌去离子水,
严禁添加自来
水
。
培养箱长时间断电重启后,应仅设置温度为37℃,CO
2
浓度设置为零,待培
养箱温度稳定在37℃六小时后,再设置CO
2
浓度为5%。
3. 医用冰箱检查:医用冰箱在稳定状态下冷藏温度应为4℃,冷冻温度应为-20℃,
若示数变化应及时联系管理员。
4. 例行消毒:
a. 在房间无人状态下,每周打开紫外消毒灯30分钟至少2次;
b. 实验前后,用
已经被
70%
酒精浸湿
的纸巾擦拭生物安全柜操作台;
c. 实验前后,分别打开生物安全柜内的紫外灭菌灯至少30分钟;
d. CO
2
培养箱底盘去离子水
两周
更换一次,每次添加%的新洁尔灭溶液;
e.
每四周
清洗一次CO
2
培养箱,将托盘、水盘等拆卸,并用70%酒精对培养箱
内部箱体及零件全部擦拭一遍;
f.
每两周
用次氯酸钠漂白水稀释液清洗实验室地面;
g. 平时应随手用酒精擦拭桌面,保证桌面整洁。水浴锅内应及时添加或更换去离
子水,视具体情况而定。
相关厂家联系方式
1. CO
2
气瓶:纯度规格三个九,千禧京城,,,气瓶1000元左右,有空瓶后可以充
气,约二百元;
2. CO
2
维修保养:见培养箱箱体;
3. 移液器与电动移液枪维修:北京龙跃伟逸科贸,,;
4. 生物安全柜维修:青岛海尔特种电器有限公司,;
5. 医用冰箱维修:青岛海尔特种电器有限公司,;
6. 离心机:江苏省金坛市医疗仪器厂,,。
细胞间操作规范
1. 实验操作必须更换实验区拖鞋,穿着白大褂,佩戴无菌手套,应勤用酒精对前臂
及双手消毒;
2. CO
2
培养箱内部环境非常适宜微生物繁殖,故所有从外界拿入培养箱内的物品均
需要用70%酒精提前擦拭消毒,在对培养箱操作之前务必对双手及前臂消毒;
3. 所有将要使用或用过的
试剂及容器
务必立即标注使用人的
姓名首字母、日期、试
剂名称或状态
以防其他实验人员混用或误认为是干净的无菌容器而造成污染;
4. 一般情况下
不允许
拿出生物安全柜内器械,若必须在安全柜外使用器械,则应在
使用后经70%酒精仔细擦拭消毒后放回安全柜内;
5. 安全柜的无菌气流由上自下吹过,并在操作台表面分成前后两股气流进入循环系
统,故应
尽可能避免不干净的物品(如双手、使用过的耗材等)出现在无菌物品
上方
,操作应尽量在安全柜中间部分进行,尤其
不能置无菌耗材于前风幕与外界
环境的交界处
;
6. 锥形瓶中的生物废液可在加入适量次氯酸钠漂白液消毒后,倒入下水道中,洗净
瓶体后加入厚约1cm的次氯酸钠漂白液继续盛装生物废液。使用、污染过的生物
耗材应置于次氯酸钠漂白液消毒后再作为一般垃圾处理;
7. 使用移液枪及电动移液器时应慢速、小心操作,避免液体接触枪体,若不慎接
触,应立即用70%酒精擦拭消毒。对于电动移液器,过度吸取液体会堵塞器械管
口,可能造成仪器失效,若更换枪体内过滤器后仍不能正常使用,需联系厂家维
修;
8. 实验结束后,清理废液烧杯,并用酒精擦拭安全柜台面,当电动移液器电量不足
一半时,应及时充电,避免电池老化,开启紫外灯至少30分钟。务必仔细检查使
用过的仪器、器材,确定离心机电源关闭,水浴锅锅盖改好,显微镜已关闭,最
后应清理桌面,保持实验室整洁干净,垃圾桶快满时注意将垃圾带走并换上新的
垃圾袋;
9. 酒精喷壶、酒精灯中酒精快用完时,注意及时补充,尤其是酒精灯。
细胞培养
细胞培养注意事项
1. 打开生物安全柜紫外灯消毒30分钟以上,开启安全柜前玻璃面板,至少运行风机
10分钟以上,保证气流稳定;
2. 提前将培养液置于37℃水浴锅加热(注意不要被紫外线照射以防破坏营养成
分)。若旧培养液耗尽,则应立即在新培养液的容器上标注使用人的姓名;加热
时间不宜过长,达到室温即可;
3. 对双手消毒后打开培养箱,将培养瓶瓶盖旋紧后取出样品并放入安全柜,标记传
代次数,将加热至室温的培养液取出,并用酒精擦拭消毒(注意不要擦拭有字区
域)后放入安全柜。
培养液成分
1. HL-60细胞所采用的全培养基成分为89%RPMI-1640、10% FBS和1% 双抗(青
霉素/链霉素);
2. HeLa细胞所采用的全培养基成分为84%DMEM、15% FBS和1% 双抗(青霉素/
链霉素)。
细胞复苏
1. 将细胞从液氮中的冻存盒取出,用镊子夹着冻存管置于37℃水浴中,不停晃动冻
存管(尽量避免冻存管封口处浸入水中,以防细胞被污染),使其快速完全融
化,得到细胞悬浮液;
2. 用移液枪将细胞悬浮液吸出放入离心管中,15ml离心管都行,用15ml多加培养
液,可将DMSO去除更干净),加入适量(的培养液并混匀,然后进行离心去除
悬浮液中的DMSO,设定离心转速800r/min左右,离心4分钟左右;
3. 弃去离心管中上层含DMSO的冻存液,一般加入新培养基4~5ml(根据培养瓶和
或培养皿的容积确定),混匀,然后移入培养容器中。
注意:如果细胞存活率不高,可尝试先加入适量新培养液直接培养,一天后再换新培
养液,根据实验结果来看,刚解冻细胞对离心较敏感。
细胞传代
悬浮细胞传代
1. 用5mL移液枪吸走4/5的细胞悬浮液(大约为4ml);
2. 换新枪头,加入与吸走悬液相同量的新培养液;
3. 用移液枪混匀,放入培养箱;
注意:如果需要精确传代,则需对细胞悬液进行计数,然后保留所需数目的细胞
进行培养。
贴壁细胞传代
1.
2.
用旧液体轻轻冲洗培养瓶底,然后用移液器枪吸尽旧培养液(弃去);
加入2ml左右 PBS,轻轻摇晃,然后同样用移液枪吸掉PBS(用PBS是为清洗掉
旧培养液中的血清,因为血清可抑制胰酶的活性,后面也是采用含血清新培养液
终止胰酶消化的);
3. 加入约~1ml胰酶(为常规5ml的培养瓶和5ml培养皿的用量,没有明确限制,只
奥胰酶能润湿所有细胞即可),室温或放置4~5分钟,培养箱中放置1~2分钟
(放置于显微镜下观察,细胞变圆时就可以终止消化);
4.
5.
加入约1ml~2ml培养基(含有小牛血清)终止消化;
(a) 如终止消化后,大部分细胞还贴壁,则可直接吸走胰酶和培养液的混合物,然
后加入适量新培养液,然后将细胞和培养液混合均匀,取适量到新培养瓶/皿中,
继续培养。
(b) 如终止消化后,大部分细胞已脱落到胰酶和培养液的混合液中,则需进一步将
细胞吹离瓶壁,混合均匀,然后取适量细胞悬到离心管中进行离心800
~1000r/min,5~3分钟,然后离心管中上清液去除,加入新培养液,将细胞吹打重
悬。取适量到新培养瓶/皿中,继续培养;
6. 传代结束后,对双手、前臂及培养瓶消毒后,将培养瓶置于培养箱内并旋松瓶
盖,确保培养瓶透气。
细胞冻存
1. 重复细胞传代中消化细胞的步骤,将细胞通过胰酶消化下来,同样加入适量含
FBS的培养液终止胰酶消化,然后用移液枪将细胞转移至离心管,设定离心机转
速1000r/min左右,离心3分钟左右,去除上层培养液,留下底部白色细胞团;
2. 细胞团中加入冻存液(90%完全培养液+10%DMSO,较敏感细胞可用90%FBS
+10%DMSO。加DMSO是为防止细胞被冰晶刺破,用FBS取代完全培养液是为
减少水分),用移液枪轻轻吹打制成细胞悬液;
3. 分转到冻存管内,的冻存管每个可加入至,将冻存管口封严,贴上标签,注明冻
存时间、细胞种类及代数;
4. 按下列顺序降温,并最终冻存:室温、4℃ 冰箱放置30min 、 -20℃冰箱放置
2h 、-70℃冰箱过夜(我们无此温度冰箱,放在液氮表面8h至16h代替)、投入
液氮。
注意:准备冻存的细胞,最好是对数期生长的细胞,一般取细胞铺满底部70%左右时
可消化冻存,等细胞铺满底部时,细胞通常不是最佳状态。悬浮细胞可在常规换
液前几小时操作。
主要设备操作说明
安全柜使用说明
1. 向上推动打开玻璃窗(不要超过面表上标记的刻度);
2. 大概2分钟后风速稳定(控制面板上风速不变化),再进行操作,如果在打开玻
璃窗之前紫外灯是打开的,则最好多等几分钟,以使紫外光产生的臭氧被排出;
3. 实验操作完成后,用酒精擦拭台面;
4. 关闭玻璃窗,设定紫外灯开启时间。
注意:实验操作过程中,如果袖子或其它物体遮住过滤网,安全柜会警告风速不稳
定,尽量避免出现这种情况。
进一步详细操作可参考安全柜说明书。
培养箱使用说明
1. 打开培养箱之前现在手上和门把手处喷上酒精;操作时不要和周围的人交谈以防
口中细菌进入培养箱;
2. 断电后,待温度上升到37度,再设定二氧化碳的浓度为5%,否则二氧化碳传感
器不准确。
进一步详细操作见培养箱说明书。
显微镜使用说明
每次使用的开始和结束时间需精确登记,尤其是关闭汞灯的时刻,具体的使用操
作见显微镜使用说明。
操作步骤如下:
一、 明场观察
1.接通电源线,打开电源开关(“︱”为开,“○”为关),同时按下显微镜前面的
按纽(有灯泡);
2.用光路选择杆选择“观察”光路(有眼睛图形),选择所需放大倍数的物镜,并
将选择环置于相应的位置,使用光调节旋钮和滤光片,调节至适当亮度;
3.将标本放在载物台上,转动粗微调调节视野内图象清晰;
4.调节目镜使观察舒适;
5.如需拍照,则打开电脑,选择所需软件,将光路杆调至“旁路光口”(有相机图
形),即可拍摄并保存;
6.使用完毕后,关闭主开关(至O),取下电源插头。
二、 DIC观察
1. 打开明场电源开关(“︱”为开,“○”为关);
2. 将样品置于载物台上,用样品夹夹好;
3. 将起偏器、检偏器、DIC棱镜推入光路,荧光滤块转盘拨到“1”位置,DIC棱镜
应与相应的物镜倍数相匹配;
4. 先选用低倍物镜(“10×”);
5. 调节透射光的强度,调节焦距,找到视野;
6. 换到高倍镜头,观察样品,DIC观察时,光路选择拉杆拉到中间位置,既可观
察,也可拍照。
三、 荧光观察
1. 如使用荧光,打开荧光光源,此时最好关闭明场光源。将荧光光路shutter打开
(“○”为开,“●”为关),需保护样品时关闭shutter;
2. 选择所需波段的荧光,并用荧光调节杆调节亮度;
3. 从低倍镜开始观察,调焦,找到预观察视野,依次换到高倍镜头,观察样品;
4. 不观察时,要及时使用光栅切断荧光(●-关,○-开),避免样品荧光衰
减,如荧光较暗,将周围光亮度减至最低(关灯,拉上窗帘);
5. 拍摄步骤同普通明场观察。
四、 软件功能简介
1. 图像叠加、自动定时拍摄(ISO=200时比较清晰);
2. 比例尺设定(可设定标尺的参数);
3. 可调节背景光颜色以达到白平衡,从而得到真实标本颜色;
4. 调节曝光时间可改变得到图像的亮暗程度。
注意事项
1. 光纤不能大角度弯曲以免折损;
2. 在使用完毕关机时,将镜体电压调至最低, 即保证光的强度最弱才可关闭电源,
防止重新开机时电压高而烧坏灯炮;
3. 不要频繁开关电源;为了延长汞灯使用寿命,请在打开电源后15分钟之内不要关
电源,第二次重新开机间隔时间最少10分钟;同时建议汞灯每次使用不超过2小时;
4. 电脑主机机箱后面插着的类似U盘的器件,不要拔掉(那不是U盘!);
5. 对于光源的控制也要注意,转动光强调节钮时切忌小心,不可太过,以防损
坏;
6. 使用完毕后一定要将物镜置于载物台下方,保持清洁。这一步可以通过转动三
孔转换器实现;不要随意拆散物镜;
7. 对目镜、物镜、聚光镜等光学部件的表面有灰尘时,应先用吹气球吹,再用棉签
蘸清洁液擦拭,方法是由内向外螺旋型擦拭,清洁液建议使用70%乙醚和30%无水酒
精混合液;同时注意不要随意擦拭荧光激发块;
8. 将镜头转到低倍镜,取出样品,若使用过油镜用干净的擦镜纸擦拭镜头;
9. 载玻片不同厚度时,需要转动物镜上的校正环才能得到最清晰图像。
灭菌锅使用说明
1. 打开电源按钮(前面板右上方);
2. 一手按住顶盖靠身体处(有手型标志),然后另一手将前面板左上方的开关拨到
右上方,此时顶盖打开;
3. 检查灭菌锅水位是否处于底部中央大孔和周围8个小孔之间。如果低于大孔,则
需要加水,可将灭菌锅自带冷凝壶中的水倒入(注:冷凝壶中的水位要保持在
LOW与HIGH之间),也可加入纯净水和去离子水,不要用自来水,以免产生水
垢;如果处于大孔和小孔之间,则可将需灭菌器材用纱布包好放入到金属框中
(一定要放入金属框中),置于灭菌锅中灭菌。对瓶装水灭菌时,注意将瓶盖拧
松,让水蒸气排放通畅,以免爆炸;
4. 盖好顶盖,打开顶盖左下方控制面板的控制程序开关,灭菌时参数为:灭菌温度
120度,灭菌时间20到40分钟,灭菌结束后保温温度为60度(保温温度没有明
确要求)。灭菌中途,可按控制面板的stop键强制停止,强制停止后打开盖子
前,请注意显示器中显示灭菌锅中的温度和压强,以防烫伤;
5. 灭菌结束及时取出被灭菌器材,然后放入干燥箱中,关闭电源按钮(灭菌锅进一
步操作说明,去查阅产家说明书)。
干燥箱使用说明
1. 打开左侧面左下角的电源按钮;
2. 按箱体前侧左下方控制面板的Call 按钮,然后上下键设定参数(主要设定干燥温
度80,干燥时间已设定48小时后自动关闭,有些不需要干燥48小时,如急用的
话,干燥后直接取出就行。参数一般按默认即可);
3. 按Start按钮,开始升温干燥。
电子天平使用说明
开机后注意预热20分钟,否则可能称量结果不准确。
本文发布于:2024-03-15 07:08:34,感谢您对本站的认可!
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